慢病毒介導(dǎo)穩(wěn)定表達(dá)抑制PRRSV復(fù)制的shRNA細(xì)胞系的建立

吳錦艷，田 宏，尚佑軍，陳 妍，王光祥，劉湘濤，張志東

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730046)

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慢病毒介導(dǎo)穩(wěn)定表達(dá)抑制PRRSV復(fù)制的shRNA細(xì)胞系的建立

吳錦艷，田 宏，尚佑軍，陳 妍，王光祥，劉湘濤*，張志東*

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730046)

利用慢病毒表達(dá)技術(shù)將穩(wěn)定持續(xù)抑制PRRSV復(fù)制的shRNA導(dǎo)入Marc-145細(xì)胞，建立穩(wěn)定表達(dá)靶向抑制PRRSV復(fù)制的shRNA的Marc-145陽性細(xì)胞克隆，并從細(xì)胞模型水平闡明抑制PRRSV復(fù)制的關(guān)鍵靶基因的干擾效果。采用LR重組技術(shù)，將pENTR/U6/Nsp9-4、pENTR/U6/Nsp9-6及pENTR/U6/-CON分別與pDEST載體進(jìn)行LR重組，獲得表達(dá)骨架，重組后的表達(dá)載體在轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)下與已經(jīng)優(yōu)化的輔助質(zhì)粒Vira PowerTMPackaging Mix共轉(zhuǎn)染293-FT包裝細(xì)胞，獲得慢病毒樣粒子，并用其感染Marc-145細(xì)胞，殺稻瘟菌素抗性篩選獲得陽性細(xì)胞克隆，通過PCR、CPE、TCID50、Real-time PCR和間接免疫熒光試驗(yàn)等方法分別驗(yàn)證上述細(xì)胞株的穩(wěn)定整合以及其表達(dá)的shRNA對(duì)PRRSV增殖的抑制效果。結(jié)果顯示：優(yōu)勢(shì)干擾序列和無關(guān)序列被穩(wěn)定整合在靶細(xì)胞基因組上，無論觀察細(xì)胞病變效應(yīng)、免疫熒光產(chǎn)生情況、致細(xì)胞半數(shù)感染量還是實(shí)時(shí)定量分析相對(duì)表達(dá)量，與正常Marc-145和整合有無關(guān)序列的兩株陰性對(duì)照細(xì)胞相比，整合有NSP9-4和NSP9-6的兩株細(xì)胞由于表達(dá)了靶向抑制PRRSV復(fù)制的shRNA，PRRSV對(duì)其易感性降低，而且差別顯著，分別將其命名為Marc/pU6/NSP9-4和Marc/pU6/NSP9-6。經(jīng)驗(yàn)證，本研究成功構(gòu)建兩株穩(wěn)定表達(dá)靶向抑制PRRSV復(fù)制的shRNA細(xì)胞——Marc/pU6/NSP9-4、Marc/pU6/NSP9-6，同時(shí)獲得一株表達(dá)無意義shRNA的Marc/pU6-CON輔助細(xì)胞，該細(xì)胞表達(dá)的shRNA具有明顯抑制PRRSV復(fù)制的功能，不僅可以從細(xì)胞模型水平闡明抑制PRRSV復(fù)制的關(guān)鍵靶基因，也為PRRSV感染引起宿主細(xì)胞的變化以及對(duì)機(jī)體的致病機(jī)制等研究提供資料。

PRRSV; shRNA;Marc-145細(xì)胞系;慢病毒表達(dá)技術(shù)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)，亦稱藍(lán)耳病，由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起，是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的接觸性傳染病。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是真核生物中的特異核苷酸序列產(chǎn)生的基因沉默現(xiàn)象，被認(rèn)為有抑制病毒復(fù)制的功能，能夠簡單、高效地阻抑特定基因的表達(dá)。所以利用RNAi技術(shù)研究siRNA抑制病毒增殖時(shí)，選擇病毒基因組保守區(qū)域是關(guān)鍵，眾所周知，選擇的干擾靶序列越保守，抑制各血清型基因復(fù)制能力會(huì)越強(qiáng)。PRRSV基因組含有9個(gè)開放閱讀框(open reading frame, ORF)，分別為ORFla、ORFlb、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7。ORF1b蛋白比較保守，不編碼蛋白水解酶，借助ORF1a編碼的蛋白水解酶Nsp4將其切割成4個(gè)成熟的非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp9～Nsp12，其具備聚合酶、復(fù)制酶及其蛋白酶，是病毒復(fù)制所必需的[1-2]。Nsp9為依賴于RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)，含有正鏈RNA病毒所特有的4個(gè)序列[3]，作為催化活性的基元其保守性最高。研究證實(shí)nsp9基因的替換會(huì)影響病毒在保守細(xì)胞上的生長[4]。反向遺傳學(xué)研究結(jié)果顯示如果缺失Nsp9，病毒的感染性cDNA無法包裝成完整的病毒粒子。作為PRRSV重要的RdRp, Nsp9參與病毒基因組和亞基因組RNA的復(fù)制及轉(zhuǎn)錄[5-6]，而且Nsp9通過與宿主蛋白質(zhì)相互作用參與病毒復(fù)制[7-8]。NSP9 C端的RdRp′結(jié)構(gòu)域與其聚合酶活性及病毒基因組的轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)[9]。最近的研究表明，Nsp9與Nsp10不僅影響我國高致病性PRRSV(HP-PRRSV)在體內(nèi)外的復(fù)制和增殖，而且與病毒的毒力密切相關(guān)[5]。也有報(bào)道顯示，Nsp9與宿主蛋白內(nèi)annexin A2的相互作用有利于PRRSV在Marc-145中的復(fù)制[7]。趙雙成[10]采用免疫共沉淀(Co-IP)技術(shù)證實(shí)Nsp9 C端的RdRp結(jié)構(gòu)域與解旋酶蛋白DDX5N端的DEXDc與HELICc結(jié)構(gòu)域存在相互作用，激光共聚焦分析顯示，在Nsp9和DDX5真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的情況下，兩者主要共定位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核的周圍；而PRRSV感染能誘導(dǎo)DDX5從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，并與Nsp9共定位。可見，Nsp9是PRRSV編碼蛋白質(zhì)中影響病毒復(fù)制和致病性最重要的非結(jié)構(gòu)蛋白之一。由此推斷，以PRRSV NSP9作為靶標(biāo)，應(yīng)用RNAi技術(shù)研究針對(duì)NSP9的干擾效果具有現(xiàn)實(shí)意義。

近幾年應(yīng)用RNAi技術(shù)研究PRRS方面也取得了可喜成績。曹素芳等針對(duì)PRRSV核衣殼蛋白(N基因編碼)設(shè)計(jì)了3對(duì)siRNA靶序列，將此克隆到真核表達(dá)載體，經(jīng)過相應(yīng)鑒定后，篩選到有效的干擾序列，特異性地抑制阻斷了PRRSV核衣殼蛋白N基因的表達(dá)，為PRRSV新型防治技術(shù)研究奠定了基礎(chǔ)[11]。賀云霞[12]針對(duì)PRRSV較保守的N蛋白選取4個(gè)siRNA序列，通過一步PCR法制備shRNA表達(dá)盒，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)shRNA179-PCR抑制PRRSV增殖效果明顯。宋德武等[13]針對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因設(shè)計(jì)了3個(gè)RNAi，構(gòu)建shRNA表達(dá)質(zhì)粒，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞，攻毒后，經(jīng)過一系列試驗(yàn)驗(yàn)證，構(gòu)建的干擾質(zhì)?？梢愿咝б种芇RRSV在Marc-145細(xì)胞中的復(fù)制?？梢钥闯?，第一，上述針對(duì)的都是結(jié)構(gòu)蛋白，結(jié)構(gòu)蛋白是構(gòu)成一個(gè)形態(tài)成熟的病毒顆粒所必需的蛋白質(zhì)；而非結(jié)構(gòu)蛋白特別是參與病毒復(fù)制或基因表達(dá)調(diào)控的酶，對(duì)病毒復(fù)制是必需的，只有在這些酶系統(tǒng)的參與下，病毒才具備復(fù)制和增殖的功能。第二，都停留在驗(yàn)證干擾效果階段，僅僅篩選到具有抑制PRRSV復(fù)制效果的shRNA，并沒有建立真正具有穩(wěn)定抑制PRRSV復(fù)制的細(xì)胞系。

經(jīng)過前期設(shè)計(jì)、構(gòu)建、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，最終篩選到了2個(gè)干擾效果比較理想的靶序列pENTR/U6-shRNA[14-15]，作者借助慢病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建shRNA干擾表達(dá)載體，經(jīng)LR重組后，與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293-FT細(xì)胞，再將其包裝成為成熟的缺陷型慢病毒顆粒后感染至Marc-145細(xì)胞中，將其整合到Marc-145細(xì)胞基因組染色體上，建立靶向抑制PRRSV復(fù)制的表達(dá)shRNA的陽性細(xì)胞株。該細(xì)胞株的建立將有助于闡明抑制PRRSV復(fù)制的關(guān)鍵靶基因，對(duì)病原體感染宿主的功能性進(jìn)行定位，為動(dòng)物抗病育種提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega公司；DMEM-F12、OPTI-MEM購自Sigma公司；胎牛血清購自杭州四季青生物公司；新生牛血清購自PAA；LR Clonase Enzyme Mix、ViraPowerTMPackaging Mix、Blasticidin、感受態(tài)細(xì)胞One Shot Stbl3、Gateway LR Clonase II Enzyme Mix、pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST Gateway Vector Kit均購自Invitrogen公司；MX3005P購自Agilent；T4 DNA Ligase、One Step PrimerScriptTMRT-PCR Kit購自TaKaRa公司；pENTR/U6/Nsp9-4、pENTR/U6/Nsp9-6、pENTR/U6/-CON、293-FT(人胚腎)細(xì)胞、Marc-145細(xì)胞由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所病毒病研究室保存。

1.2 慢病毒介導(dǎo)shRNA表達(dá)載體pEX/U6-shRNA的構(gòu)建及其鑒定

參照Gateway LR Clonase II Enzyme Mix使用說明，分別將pENTR/U6/Nsp9-4、pENTR/U6/Nsp9-6和pENTR/U6/-CON與pLenti6/Dest Gateway Vector載體于25 ℃進(jìn)行LR重組反應(yīng)，1.5 h后加1 μL蛋白酶K終止。依據(jù)Invitrogen公司One Shot Stbl3 轉(zhuǎn)化步驟，將LR重組后的產(chǎn)物全量轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞Stbl3，隨機(jī)挑取單菌落，質(zhì)粒提取試劑盒小量提取質(zhì)粒，首先PCR擴(kuò)增鑒定，然后將陽性質(zhì)粒隨機(jī)送生物公司測(cè)序，兩種方法均鑒定合適的質(zhì)粒即為構(gòu)建的陽性質(zhì)粒，分別命名為pEX/U6/Nsp9-4、pEX/U6/Nsp9-6和pEX/U6/-CON。

1.3 pEX/U6/Nsp9-4和pEX/U6/Nsp9-6慢病毒的包裝

以5×105的濃度將包裝細(xì)胞293-FT接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。待細(xì)胞密度達(dá)到60%～80%時(shí)，利用Lipfection 2000將pEX/U6/Nsp9-4、pEX/U6/Nsp9-6和pEX/U6/-CON分別與已經(jīng)優(yōu)化的Vira PowerTMPackaging Mix包裝混合物共同轉(zhuǎn)染293-FT細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后8～10 h吸出培養(yǎng)液，加入3 mL完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)48～72 h后，收集包裝細(xì)胞的培養(yǎng)液，用0.22 μm的醋酸纖維素膜過濾。上清液即為慢病毒樣粒子，置超低溫冰箱備用。

1.4 Blasticidin對(duì)Marc-145細(xì)胞致死濃度的檢測(cè)

將Marc-145細(xì)胞按一定比例接種于24孔細(xì)胞板，48 h后，將blasticidin殺稻瘟菌素用細(xì)胞完全培養(yǎng)基從0.5～10 μg·mL-1依次遞增稀釋，用稀釋后的含殺稻瘟菌素培養(yǎng)基按梯度給24孔細(xì)胞培養(yǎng)板換液，置37 ℃CO2培養(yǎng)箱，連續(xù)培養(yǎng)2周，期間可以更換抗性溶液，2周后Marc-145細(xì)胞全部死亡對(duì)應(yīng)blasticidin的最低濃度為Marc-145致死劑量。

1.5 轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞克隆的篩選

選取生長良好的Marc-145細(xì)胞，分別加入收獲的pEX/U6/Nsp9-4、pEX/U6/Nsp9-6和pEX/U6/-CON慢病毒上清，置37 ℃，50 mL·L-1CO2溫箱孵育，期間每30 min搖1次培養(yǎng)瓶，持續(xù)吸附2 h，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照。吸棄感染液，加入上述已確定致死Marc-145細(xì)胞死亡最低blasticidin濃度的DMEM完全營養(yǎng)液，期間繼續(xù)更換抗性營養(yǎng)液，大約2周后，細(xì)胞瓶內(nèi)出現(xiàn)細(xì)胞克隆島，擴(kuò)大培養(yǎng)后，繼續(xù)抗性篩選，直至找到干擾效率較高的陽性克隆，然后擴(kuò)大培養(yǎng)并且傳代建立穩(wěn)定細(xì)胞系，將本研究建立的穩(wěn)定細(xì)胞系分別命名為Marc/pU6/Nsp9-4、Marc/pU6/ Nsp9-6及Marc/pU6-CON。

1.6 穩(wěn)定整合鑒定

為了鑒定shRNA載體是否穩(wěn)定整合入Marc-145細(xì)胞基因組，取抗性篩選后擴(kuò)大培養(yǎng)的細(xì)胞各1瓶(25 m2)，棄培養(yǎng)液，1 mL胰酶消化后，棄掉，輕拍細(xì)胞瓶，1 mL PBS收集整合后Marc-145，4 000 r·min-1，離心5 min，細(xì)胞用400 μL PBS重懸，方法參照試劑盒說明書，用基因組DNA提取試劑盒提取Marc/pU6/Nsp9-4、Marc/pU6/ Nsp9-6及Marc/pU6-CON細(xì)胞基因組DNA，分別用上游引物U6啟動(dòng)子、下游引物慢病毒載體V5進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.7 整合基因組Marc-145細(xì)胞表達(dá)shRNA抑制PRRSV復(fù)制的驗(yàn)證

1.7.1 病毒接種轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞檢測(cè)病毒感染情況 擴(kuò)大培養(yǎng)Marc/pU6/Nsp9-4、Marc/pU6 /Nsp9-6及Marc/pU6-CON轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株，至細(xì)胞鋪滿度達(dá)到85%以上，一般細(xì)胞分種后培養(yǎng)48 h就可達(dá)到要求。三種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，每種做3個(gè)平行組，首先用維持液清洗細(xì)胞面兩次，一方面可以去除代謝產(chǎn)物，另一方面除去血清影響。然后每個(gè)細(xì)胞瓶接種2 mL Marc-145細(xì)胞適應(yīng)病毒[16]，其毒價(jià)為10-4.29TCID50，感作1 h后換用正常維持液。第一組分別在12、24、48及72 h收集病毒，凍融后測(cè)定細(xì)胞毒價(jià)并觀察細(xì)胞病變效應(yīng)；第二組待36 h做間接免疫熒光試驗(yàn)；第三組分別于24、48和72 h收病毒，凍融后做Real-time RT-PCR驗(yàn)證。

1.7.2 TCID50測(cè)定轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞的抗病毒效果 分別取第一組制備好的病毒材料按照100 μL病毒加900 μL維持液依次倍比稀釋，使成10-1～10-10。選擇生長良好的Marc-145細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，48 h后，棄營養(yǎng)液，每孔加入倍比稀釋的病毒液100 μL，每個(gè)滴度做8個(gè)重復(fù)。第11和12列每孔加入100 μL維持液，作為陰性對(duì)照，然后將96孔培養(yǎng)板置37 ℃含5%的CO2培養(yǎng)箱，每天觀察記錄病變情況，并用Reed-Muench公式計(jì)算TCID50。

1.7.3 間接免疫熒光驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞表達(dá)shRNA抑制PRRSV復(fù)制情況 對(duì)第二組轉(zhuǎn)基因陽性Marc-145細(xì)胞接毒培養(yǎng)36 h后，棄去培養(yǎng)液，按照常規(guī)方法以0.5 mol·L-1，pH7.6的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，加入預(yù)冷的丙酮，置-20 ℃冰箱固定30 min， PBS洗滌細(xì)胞4～5次，吸水紙吸干，稀釋液稀釋PRRSV陽性血清，按照一定濃度加入一抗，置濕盒中，37 ℃作用1 h，吸干，用PBS洗滌單層細(xì)胞4～5次，吸水紙吸干，每孔加入已稀釋FITC標(biāo)記抗豬的二抗IgG，再孵育1 h，吸棄液體，PBS洗滌，吸干后滴加50%甘油，觀察結(jié)果。

1.7.4 Real-time RT-PCR驗(yàn)證整合Marc-145細(xì)胞對(duì)nsp9基因干擾效果 針對(duì)nsp9基因設(shè)計(jì)并合成探針法檢測(cè)引物以及探針引物，同時(shí)合成β-actin管家基因的引物。分別稀釋成10 μmol·L-1，收集第三組已經(jīng)準(zhǔn)備材料的各個(gè)時(shí)間段細(xì)胞，反復(fù)凍融后，各取400 μL，Trizol法分別提取其RNA，ND2000測(cè)定其濃度，稀釋使所有RNA保持在一個(gè)濃度下，每個(gè)樣品3 μL，引物1 μL，按照One Step PrimerScriptTMRT-PCR Kit說明書配比，同步擴(kuò)增nsp9和β-actin基因，每個(gè)樣重復(fù)3次。然后，用比較閾值法分析不同樣品中PRRSV的相對(duì)拷貝數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 慢病毒介導(dǎo)shRNA構(gòu)建質(zhì)粒的重組鑒定

pENTR/U6/Nsp9-4、pENTR/U6/Nsp9-6和pENTR/U6/-CON經(jīng)LR重組、PCR及測(cè)序鑒定，證實(shí)，構(gòu)建的入門載體和慢病毒載體pLenti6/Dest已正確重組，初步證明pEX/U6/Nsp9-4、pEX/U6/Nsp9-6和pEX/U6/-CON 重組質(zhì)粒已經(jīng)成功構(gòu)建。

2.2 Marc-145細(xì)胞抗性篩選濃度的確定

殺稻瘟菌素按一定比例稀釋后，配成含抗性DMEM完全培養(yǎng)基，給24孔正常Marc-145細(xì)胞換液，連續(xù)觀察，孔內(nèi)Marc-145細(xì)胞會(huì)逐漸出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，2周后發(fā)現(xiàn)，最低質(zhì)量濃度為3.3 μg·mL-1殺稻瘟菌素孔細(xì)胞全部死亡，故將其作為轉(zhuǎn)基因Marc-145細(xì)胞篩選濃度。

2.3 Marc-145細(xì)胞整合基因組陽性細(xì)胞的獲得

慢病毒上清感染正常Marc-145細(xì)胞后，經(jīng)適合濃度blasticidin篩選，得到了細(xì)胞克隆，經(jīng)過連續(xù)傳代和篩選，出現(xiàn)了blasticidin抗性的陽性克隆，細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后如圖1中C～E所示。與正常Marc-145細(xì)胞相比，整合后的細(xì)胞其形態(tài)眼觀上有所改變。

2.4 Marc-145細(xì)胞基因組整合鑒定

Marc/pU6/Nsp9-4、Marc/pU6/Nsp9-6及Marc/pU6-CON細(xì)胞基因組經(jīng)U6啟動(dòng)子和慢病毒載體V5引物PCR鑒定后，從圖2可以看出，本研究構(gòu)建的慢病毒攜帶干擾序列已經(jīng)成功整合在Marc-145細(xì)胞基因組上。

A.正常Marc-145；B.正常Marc-145感染PRRSV；C～E.分別為整合基因組后Marc/pU6/Nsp9-4、Marc/pU6/Nsp9-6及Marc/pU6/-CON細(xì)胞；F～H.分別為整合基因組后發(fā)生CPE的Marc/pU6/Nsp9-4、Marc/pU6/Nsp9-6及Marc/pU6-CON細(xì)胞A. Normal Marc-145; B. Infected Marc-145 by PRRSV; C. Marc/pU6/Nsp9-4; D. Marc/pU6/Nsp9-6; E. Marc/pU6/-CON; F-H. Infected Marc/pU6/Nsp9-4, Marc/pU6/Nsp9-6 and Marc/pU6-CON by PRRSV, respectively圖1 PRRSV感染轉(zhuǎn)基因前、后及發(fā)生病變的Marc-145細(xì)胞Fig.1 Normal Marc-145, integrated and infected Marc-145 cell by PRRSV

1. Marc/pU6/Nsp9-4；2. Marc/pU6/Nsp9-6；3. Marc/pU6-CON；M. DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) ；4.空白對(duì)照1. Marc/pU6/Nsp9-4；2. Marc/pU6/Nsp9-6；3. Marc/pU6-CON；M. DL2000 marker；4.Control圖2 Marc-145細(xì)胞基因組整合后PCR鑒定Fig.2 PCR identification of integrated Marc-145 cellular genome

2.5 轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞接種PRRSV后致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)

Marc/pU6/Nsp9-4、Marc/pU6/Nsp9-6、Marc/pU6-CON及正常Marc-145細(xì)胞接毒后第3天，對(duì)照Marc/pU6-CON及正常Marc-145部分細(xì)胞聚集變圓，Marc/pU6/Nsp9-4、Marc/pU6/Nsp9-6也有部分細(xì)胞變圓，但變化程度比較輕微。第4天時(shí)對(duì)照病變明顯，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞病變情況類似對(duì)照第3天，第5天時(shí)接近對(duì)照第4天，可見，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞表達(dá)shRNA且出現(xiàn)明顯抑制PRRSV復(fù)制現(xiàn)象(見圖1中F～H)。

2.6 間接免疫熒光試驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞表達(dá)的shRNA對(duì)PRRSV復(fù)制的抑制

Marc/pU6/Nsp9-4、Marc/pU6/Nsp9-6、Marc/pU6-CON及正常Marc-145細(xì)胞接種100 TCID50的PRRSV，同時(shí)設(shè)不接毒的細(xì)胞為陰性對(duì)照，36 h后，熒光顯示如圖3，Marc/pU6-CON及正常Marc-145細(xì)胞間接免疫后產(chǎn)生熒光比穩(wěn)定整合的Marc/pU6/Nsp9-4和Marc/pU6/Nsp9-6細(xì)胞強(qiáng)，眼觀上有明顯差異。說明Marc/pU6/Nsp9-4、Marc/pU6/Nsp9-6兩株細(xì)胞表達(dá)的shRNA有效抑制了PRRSV的復(fù)制和表達(dá)。

2.7 轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞抗病毒結(jié)果

Marc/pU6/Nsp9-4、Marc/pU6/shRNA/Nsp9-6、Marc/pU6/shRNA-CON及正常Marc-145細(xì)胞接毒后，第5天收毒，置-70 ℃反復(fù)凍融2次，倍比稀釋，測(cè)定12、24、48、72 h等不同時(shí)間的TCID50。結(jié)果，不管哪個(gè)時(shí)間點(diǎn)，Marc/pU6/NSP9-4和Marc/pU6/NSP9-6 組TCID50值明顯低于Marc/pU6-CON及正常Marc-145對(duì)照組。說明轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞表達(dá)的shRNA具有抑制PRRSV復(fù)制的能力，這一結(jié)果進(jìn)一步印證了“2.5和2.6”中直接觀察到的細(xì)胞病變效應(yīng)結(jié)果(圖4)。

2.8 Real-time RT-PCR驗(yàn)證整合Marc-145細(xì)胞表達(dá)shRNA對(duì)nsp9基因干擾效果

Marc/pU6/Nsp9-4、Marc/pU6/Nsp9-6、Marc/pU6-CON及正常Marc-145細(xì)胞，提取其RNA，ND2000測(cè)定質(zhì)量濃度為200 ng·μL-1，如果模板濃度太高會(huì)影響擴(kuò)增曲線，故每個(gè)樣品稀釋為100 ng·μL-1，在完全一致的PCR條件下，于同一塊板上同時(shí)擴(kuò)增nsp9基因和β-actin基因；用比較閾值法分析不同樣品中PRRSV的相對(duì)拷貝數(shù)[17]。從轉(zhuǎn)錄水平驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因細(xì)胞表達(dá)的shRNA對(duì)nsp9基因干擾效果。由圖5可知，與Marc/pU6-CON和正常細(xì)胞Marc-145相比，Marc/pU6/Nsp9-4、Marc/pU6/Nsp9-6病毒計(jì)算拷貝數(shù)在0.058以下，對(duì)nsp9基因干擾效率達(dá)到90.05%以上，說明2個(gè)干擾組都表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制病毒感染的效果。

a. 正常Marc-145細(xì)胞; b. Marc/pU6/-CON細(xì)胞; c. 空白對(duì)照; d. Marc/pU6/Nsp9-4細(xì)胞; e. Marc/pU6/Nsp9-6細(xì)胞a. Infected normal Marc-145; b. Marc/pU6/-CON; c. Control; d. Marc/pU6/Nsp9-4; e. Marc/pU6/Nsp9-6圖3 轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞表達(dá)的shRNA抑制PRRSV復(fù)制的間接免疫熒光驗(yàn)證Fig.3 To verify PRRSV replication inhibition of shRNA expressed by transgenic positive cells through IFA

圖4 接毒后轉(zhuǎn)基因陽性Marc-145細(xì)胞不同時(shí)間TCID50比較Fig.4 Comparison of transgenic Marc-145 cells′ TCID50 post-infection at different time

圖5 Real-time RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞表達(dá)的shRNA對(duì)PRRSV復(fù)制的抑制效果Fig.5 Detection of suppression of PRRSV replication of shRNA expressed by transgenic positive cells through real-time RT-PCR

3 討 論

本研究通過多種方法及多步驟驗(yàn)證，不僅篩選到具有抑制PRRSV復(fù)制能力的兩株shRNA，而且成功構(gòu)建了能夠穩(wěn)定表達(dá)shRNA的兩株Marc-145細(xì)胞系，將其命名為Marc/pU6/Nsp9-4、Marc/pU6/Nsp9-6。同時(shí)，為便于驗(yàn)證，構(gòu)建了一株表達(dá)隨機(jī)序列的Marc/pU6/Nsp9-CON細(xì)胞系。該細(xì)胞系經(jīng)過PCR、間接免疫熒光、TCID50(組織細(xì)胞半數(shù)感染量)及Real-time RT-PCR等試驗(yàn)驗(yàn)證后，發(fā)現(xiàn)，PRRSV對(duì)Marc/pU6/Nsp9-CON和正常Marc-145兩者的易感性沒有差異；相反，整合在Marc-145細(xì)胞上的干擾序列對(duì)應(yīng)兩株細(xì)胞系由于穩(wěn)定表達(dá)靶向抑制PRRSV復(fù)制的shRNA，而具有干擾nsp9基因表達(dá)的效果，由此說明整合在細(xì)胞上的干擾序列獲得表達(dá)，從圖1～5中也可以看出干擾PRRSV增殖效果顯著。

值得注意的是，建立的Marc/pU6/Nsp9-4、Marc/pU6/Nsp9-6細(xì)胞系雖然實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證能夠持續(xù)產(chǎn)生干擾效果，但體內(nèi)抑制病毒的效率還需要大量試驗(yàn)。另外，siRNA研究證實(shí)，載體介導(dǎo)shRNA在抑制病毒核酸復(fù)制的同時(shí)使病毒產(chǎn)生對(duì)RNAi的耐受性，一方面源于體內(nèi)本身就存在siRNA，病毒粒子會(huì)對(duì)此產(chǎn)生適應(yīng)性耐受；另一方面由于轉(zhuǎn)染siRNA的壓力以及外源的導(dǎo)入使得病毒粒子選擇優(yōu)勢(shì)得到進(jìn)化，為了避免病毒對(duì)RNA干擾產(chǎn)生免疫耐受，設(shè)計(jì)時(shí)盡可能選擇多對(duì)針對(duì)多個(gè)靶點(diǎn)的siRNA，事實(shí)上，以前的研究也證實(shí)了這點(diǎn)，并且得到了重視，再者，并非所有干擾片段都能對(duì)病毒復(fù)制產(chǎn)生較好的抑制效果，所以本研究最初設(shè)計(jì)了6對(duì)針對(duì)nsp9基因的shRNA，多種方法篩選，驗(yàn)證后，最終才篩選到2對(duì)有意義序列。值得關(guān)注的最后一點(diǎn)，雖然 siRNA片段比較短，僅僅21～23 bp，但是，研究證實(shí)siRNA也許會(huì)通過調(diào)節(jié)干擾素IFN而引起非特異免疫反應(yīng)[18]，因此，如果用此做轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，siRNA引起的副反應(yīng)、注射靶點(diǎn)以及如何注射等都值得我們深慮。

外源基因進(jìn)入細(xì)胞通常需要“運(yùn)載工具”，即載體，目前常用的載體有慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體等，各種病毒載體各具其優(yōu)缺點(diǎn)。鄭海學(xué)等利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)將T7 RNA 聚合酶基因穩(wěn)定整合在IB-RS-2細(xì)胞，建立穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶IBRS-2細(xì)胞系從而體內(nèi)拯救SVDV[19]。田宏應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)研制豬水皰病和豬瘟基因工程亞單位疫苗[20]，免疫動(dòng)物后抗體效價(jià)達(dá)1∶8以上。本研究選用慢病毒載體(lentiviral vector)，其屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，是一種來源于逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體。與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體相比，雖然都是去除基因組中部分基因，并插入所需的目的基因和標(biāo)記物構(gòu)建而成，但慢病毒系統(tǒng)轉(zhuǎn)染效率更高，因?yàn)槁《静坏筛腥痉至哑诩?xì)胞，而且還可以感染非分裂期細(xì)胞，并可容納較大的基因片段[21]。而其他載體(如非病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體)不具備整合到靶細(xì)胞染色體的特性，或者只能整合到分裂細(xì)胞的染色體。另外，研究證實(shí)自身失活慢病毒載體的安全性比逆轉(zhuǎn)錄病毒載體更高[22]。目前慢病毒載體系統(tǒng)應(yīng)用于RNAi研究已有許多成功的例子。有學(xué)者應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)RNAi技術(shù)，設(shè)計(jì)合成針對(duì)Clusterin基因的siRNA，研究CLU基因?qū)δI癌786-O細(xì)胞的作用，發(fā)現(xiàn)具有抑制作用，并建立了CLU基因穩(wěn)定干擾的人腎癌786-O細(xì)胞系[23]。研究shRNA沉默HDAC1表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞EC109細(xì)胞的生長特性后證實(shí)，慢病毒介導(dǎo)的干擾序列能有效抑制EC109中的HDAC1的表達(dá)，不僅如此，還能抑制細(xì)胞的增殖分裂[24]。另外，以前關(guān)于RNAi的研究大部分建立在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染基礎(chǔ)上，只是對(duì)某個(gè)靶點(diǎn)的瞬時(shí)驗(yàn)證，仍停留在基因水平，沒有形成有形的東西。王曉紅等研究發(fā)現(xiàn)GP5⊿84-119的表達(dá)能夠抑制PRRSV的復(fù)制，建立了穩(wěn)定表達(dá)缺失84-119氨基酸殘基(第二個(gè)胞外區(qū))的截短型GP5的Marc-145細(xì)胞系[25]。受此啟發(fā)，本研究在前人研究基礎(chǔ)上選用慢病毒表達(dá)系統(tǒng)及包裝細(xì)胞系293-FT，將具有干擾效果shRNA整合在Marc-145細(xì)胞基因組染色體上，并建立穩(wěn)定表達(dá)shRNA的Marc-145細(xì)胞系，為下一步轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究提供理論及物質(zhì)基礎(chǔ)。

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(編輯 白永平)

Establishment of Cell Lines with Stable Expression of shRNA to Inhibit Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Proliferation Using the Lentiviral Expression System

WU Jin-yan, TIAN Hong, SHANG You-jun, CHEN Yan, WANG Guang-xiang,LIU Xiang-tao*, ZHANG Zhi-dong*

(KeyLaboratoryofAnimalVirologyofMinistryofAgriculture,StateKeyLaboratoryofVeterinaryBiology,LanzhouVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Lanzhou730046,China)

In the present study, Marc-145cell lines with stable expression of shRNA were established by lentiviral expression system to inhibit replication of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), and its interference suppression effect to PRRSV key target genes was clarified from the level of cell model. LR recombination reaction between pENTR/U6/Nsp9-4 (pENTR/U6/Nsp9-6, or pENTR/U6/-CON, respectively) and pDEST were done by using the LR technology to obtain expression skeleton. Expression vector and auxiliary plasmid Vira PowerTMPackaging Mix were cotransfected into 293-FT cells by Lipofectamine 2000, respectively, to gain Lentiviral supernate and to infect Marc-145 cells. After 48 h, the cells were incubated in standard culture medium including blasticidin (3.3 μg·mL-1), colonies with blasticidin were obtained when cells were cultured in selection medium within 14 d, monoclonal were expanded, passaged, screened to get monoclonal cell lines. The integration of the obtained monoclonal cell lines were identified by PCR, CPE observation and TCID50determination, and the inhibition effect of the cell lines with shRNA to PRRSV proliferation were detected by indirect immunofluorescence test and real-time PCR methods. pENTR/U6/Nsp9-4, pENTR/U6/Nsp9-6 and Marc/pU6-CON had been integrated into the chromosome of Marc-145 cells and expressed stably at high level. Results showed that the shRNA expressed by two cells with pEN/U6/Nsp9-4, pEN/U6/Nsp9-6 specifically suppressed PRRSV proliferation, respectively. The infection rates of PRRSV to the negative control and normal cells were higher than those to the recombinant Marc/pU6/NSP9-4 and Marc/pU6/NSP9-6, and the difference was obvious. These results demonstrate that Marc/pU6/NSP9-4 and Marc/pU6/NSP9-6 cell lines can effectively express shRNA to inhibit the replication and proliferation of PRRSV. It helps to clarify the key target genes that suppress PRRSV replication, and is expected to construct transgenic animals based on the siRNA targeted PRRSV.

PRRSV; shRNA;Marc-145 cells; lentiviral expression system

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.11.016

2016-07-14

農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制定計(jì)劃項(xiàng)目(2014-308)

吳錦艷(1975-)，女，漢，甘肅靜寧人，助理研究員，博士，從事分子病毒學(xué)與免疫學(xué)研究，E-mail：jingningcaixiong@163.com

*通信作者：劉湘濤，E-mail: hnxiangtao@hotmail.com; 張志東, E-mail: zhangzhidong@caas.cn

S852.659.6

A

0366-6964(2016)11-2280-08