瘤胃4株纖維降解細菌的分離鑒定及其纖維降解特性

王衛(wèi)云 ，李大彪， 于永強，邢媛媛，李子健

(內蒙古農業(yè)大學動物科學學院，呼和浩特 010018)

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瘤胃4株纖維降解細菌的分離鑒定及其纖維降解特性

王衛(wèi)云 ，李大彪*， 于永強，邢媛媛，李子健

(內蒙古農業(yè)大學動物科學學院，呼和浩特 010018)

作者從蒙古綿羊瘤胃內容物中篩選出四株纖維素降解細菌并進行鑒定，將其編號為H1、H2、N1、N2，對菌株生長特性和纖維素酶活力進行測定，以期為后續(xù)試驗提供試驗材料。通過生理生化特征、DNA序列分析對分離菌株進行鑒定,比濁法測定細菌生長曲線，用還原糖法測定四株細菌的濾紙酶活、羧甲基纖維素酶活、水楊苷酶活和微晶纖維素酶活力。結果表明：經鑒定，四株菌中H1、H2為黃色瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)，N1、N2為鏈球菌(Streptococcus)；生長曲線測定表明菌株H1生長延遲期為4 h，H2、N1、N2均為3 h，黃色瘤胃球菌最大菌體濃度出現(xiàn)在28 h，鏈球菌為14 h；四株細菌均具有良好的纖維降解特性，其中H2濾紙酶活力、羧甲基纖維素酶活力、微晶纖維素酶活力顯著高于菌株H1、N1、N2(P<0.05)，H1濾紙酶活力最低，為0.08 μmol·(mL·min)-1。本試驗利用hungate滾管法分離出4株具有纖維素酶活力的細菌，可以滿足后續(xù)試驗需要。

瘤胃纖維素降解細菌；篩選；鑒定；纖維素酶

瘤胃是牛、羊等反芻動物的重要消化器官，是自然界中具有很強纖維降解能力的微生態(tài)系統(tǒng)之一，其中棲息著大量的真菌、細菌、古菌、原蟲和噬菌體等微生物，纖維性植物能夠作為反芻動物主要能量來源，依靠的是瘤胃內存在的這些微生物，其中纖維分解菌在纖維素分解過程中發(fā)揮高達80%的作用[1]。反芻動物瘤胃對飼料結構變化具有極強的適應能力, 其本質是瘤胃微生物區(qū)系發(fā)生變化并且誘導相應酶系統(tǒng)發(fā)生重新配置。瘤胃內主要優(yōu)勢纖維分解菌包括黃色瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)、白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)及產琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobactersuccinogenes)[2]。三種細菌在瘤胃中所占比例因動物飼料結構會發(fā)生改變，飼喂苜蓿干草的野牛瘤胃內, 產琥珀酸絲狀桿菌的數(shù)量占到總纖維分解菌的58%, 遠遠高于飼喂秸稈飼料的雜交牛和家牛，這是由于野牛采食的飼草結構所決定的[3]。近年，除主要的三種降解纖維素分解細菌外，關于其他纖維素降解菌的研究也較多。張曉華[4]從瘤胃內容物中分離得到1株降解纖維素的厭氧瘤胃梭菌；劉玉承[5]等從綿羊的瘤胃內容物中分離到2株嚴格厭氧纖維降解細菌,其中1株為黃色瘤胃球菌,1株為丁酸弧菌；周非帆[6](2014)從蒙古綿羊瘤胃液中分離得到4株纖維分解細菌，分別為拜氏梭菌、丁酸梭菌、白色瘤胃球菌、糞腸球菌；孫美洲等[7]從荷斯坦奶牛瘤胃內容物中分離到 28 株厭氧真菌與甲烷菌共培養(yǎng)物共獲得四種不同的厭氧真菌與甲烷菌組合，分別為Piromyces/類Methanobrevibacterolleyae菌株，Neocallimastix/類Methanobrevibacterolleyae菌株，Neocallimastix/類Methanobrevibacterthaueri菌株及Caecomyces/類Methanobrevibacterolleyae菌株。作者從綿羊瘤胃內容物中分離纖維素降解細菌，并對分離得到的纖維降解細菌纖維素酶活力進行了測定，旨在了解瘤胃纖維素降解細菌的生物學特性，為探究反芻動物營養(yǎng)物質消化利用機制提供試驗材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 瘤胃內容物采自體況良好的 1.5～2.0歲、體重 40 kg左右、安裝永久性瘤胃瘺管的蒙古綿羊。試驗動物按照維持需要的 1.2倍飼養(yǎng)[8]。試驗動物統(tǒng)一驅蟲，單籠飼養(yǎng)。

1.1.2 培養(yǎng)基的配制 參考高巍[9]的方法配制培養(yǎng)基。培養(yǎng)基分為初篩、富集、復篩以及凍存培養(yǎng)基。其中初篩培養(yǎng)基以1%羧甲基纖維素鈉為唯一碳源并加入1%瓊脂，每管8 mL分裝到hungate滾管中；富集培養(yǎng)基中加入1%纖維二糖作為唯一碳源，每管分裝9 mL到帶塞試管中，濾紙發(fā)酵培養(yǎng)基中加入三片1 cm×5 cm的Whatman NO.1濾紙作為唯一碳源，每瓶分裝60 mL到100 mL西林瓶中；凍存培養(yǎng)基是在富集培養(yǎng)基基礎上添加1 mL濃度為16%的甘油，每瓶9 mL分裝到25 mL西林瓶中。所有培養(yǎng)基分裝前均通入CO2來排除氧氣，并在嚴格厭氧情況下分裝，所用滾管和西林瓶加蓋膠塞和鋁蓋。

1.1.3 主要試劑及耗材 羧甲基纖維素、纖維二糖、纖維素、Whatman NO.1濾紙、蛋白酶K、DL2000Marker、PCR引物、 Premix TaqTM、膠回收試劑盒、pMDTM19-T Vector Cloning Kit、微生物微量生理生化鑒定管。

1.2 菌株分離方法

1.2.1 細菌的采集 將100 mL離心管提前充好CO2氣體密封，迅速采集瘤胃液到100 mL離心管，經四層紗布過濾抽取1 mL濾液經梯度稀釋(10-5、10-6、10-7)作為菌株來源備用。

1.2.2 細菌的培養(yǎng)及純化 參考劉占英等的方法分離純化細菌[10]。用1 mL無菌注射器吸取各濃度梯度的備用菌液0.1 mL接種到初篩培養(yǎng)基中，39 ℃培養(yǎng)36～48 h，至滾管中長出菌落。在Shellab厭氧培養(yǎng)箱中使用挑菌針挑取具有透明圈的單一菌落接入富集培養(yǎng)基中39 ℃培養(yǎng)16～24 h，吸取0.1 mL菌液接種到初篩培養(yǎng)基中39 ℃培養(yǎng)至滾管中菌落長全，在Shellab厭氧培養(yǎng)箱中挑取具有透明圈的菌落接種到富集培養(yǎng)基，重復這個過程直到滾管中菌落形態(tài)、大小基本一致，通過革蘭染色結果初步確定滾管中菌株是否已經純化，將已純化的菌株凍存。若革蘭染色結果不是純化菌株則用以上方法繼續(xù)分離純化。

1.2.3 纖維降解細菌的濾紙發(fā)酵試驗 將得到的純化細菌按培養(yǎng)基體積的10%接入含濾紙的培養(yǎng)基中，39 ℃培養(yǎng)。觀察濾紙降解情況，若濾紙出現(xiàn)明顯的孔洞、分層或邊緣溶解等現(xiàn)象，就可認為該菌株具有纖維降解能力，并將有濾紙降解能力的菌株保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 瘤胃纖維降解細菌的鑒定

1.3.1 分離菌株的生理生化特征鑒定 根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[11]和伯杰細菌鑒定手冊(第9版)[12]結合微生物微量生理生化鑒定管進行生理生化鑒定。在Shellab厭氧培養(yǎng)箱中將生長到對數(shù)期的新鮮菌液吸取0.05～0.08 mL接種到每種微量西林瓶內[葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、山梨醇、阿拉伯糖、纖維二糖、七葉苷、半乳糖、木糖、水楊苷和硝酸鹽(還原)]，挑取新鮮菌落穿刺接種于硫化氫、明膠西林瓶內，將所有西林瓶置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h觀察結果，明膠瓶培養(yǎng)48 h后置4 ℃冰箱10 min后觀察結果，硝酸鹽(還原)西林瓶培養(yǎng)24 h后滴加硝酸鹽還原試劑甲液、乙液立刻觀察結果。葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、山梨醇、阿拉伯糖、纖維二糖、半乳糖、木糖培養(yǎng)結束黃色為陽性，紫色為陰性；水楊苷棕黑色為陽性，不變色為陰性；硫化氫黑色為陽性，無黑色為陰性；明膠4 ℃液態(tài)為陽性，4 ℃固態(tài)為陰性；硝酸鹽深紅色為陽性，略帶淡粉色為陰性。

1.3.2 菌株16S rDNA基因序列分析 按以下步驟進行操作。

1.3.2.1 細菌DNA的提?。翰捎寐然S法[13]并作適當改動提取細菌DNA。收集1.5 mL培養(yǎng)到對數(shù)生長期的菌液12 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入1 mL 1×TE混勻，12 000 r·min-1離心5 min，用1×TE洗滌三次后提取基因組DNA。

1.3.2.2 DNA序列 PCR擴增：以細菌16S rDNA的通用引物[14]、白色瘤胃球菌引物[15]、黃色瘤胃球菌引物[16]和產琥珀酸絲狀桿菌引物[17]對菌株的基因組DNA進行PCR擴增，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。PCR反應體系為25 μL，即DNA 2 μL，上、下游引物各1 μL，DNA連接酶12.5 μL，ddH2O(無酶水)8.5 μL。PCR反應的循環(huán)條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，使用Maker為DL2000 DNA maker，用凝膠成像分析系統(tǒng)成像，觀察目的條帶。

1.3.2.3 PCR擴增產物的切膠回收：PCR產物瓊脂糖凝膠電泳后，將條帶清晰明亮，無雜帶并處于1 500和295 bp左右的條帶在紫外燈照射下切膠回收，用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(Axygen Biosciences)純化PCR產物。

1.3.2.4 目的片段的克隆及測序：將純化好的PCR產物用pMD-19T克隆試劑盒進行連接，連接產物用TOP10感受態(tài)細胞轉化。將轉化好的含重組質粒的基因工程菌進行菌落PCR擴增，擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢驗條帶，若電泳條帶符合目的片段長度，說明所篩選的陽性克隆含有目的片段。將篩選出來的含有陽性克隆的菌液送到北京六合華大基因科技股份有限公司進行基因序列測定。

1.4 菌株生長特性

配制富集培養(yǎng)基時去掉培養(yǎng)基中刃天青，接種菌液后39 ℃培養(yǎng)，每隔2～8 h取菌液用752型分光光度計在600 nm波長處測定吸光度值，以未接菌的富集培養(yǎng)基作為對照。

1.5 分離菌株的纖維素酶活力測定

測定纖維素酶活力培養(yǎng)基同富集培養(yǎng)基，其中碳源纖維二糖用纖維素(Sigmacell cellulose, Sigma公司生產)代替，纖維素添加量為每60 mL培養(yǎng)基加0.60 g。將菌液按培養(yǎng)基10%的接種量接種到含60 mL培養(yǎng)基的西林瓶中，39 ℃培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)結束后取發(fā)酵液進行酶活力測定。纖維素酶是β-葡萄糖苷酶、外切-β-1,4-葡聚糖酶和內切-β-1,4-葡聚糖酶的總稱，在測定這3種酶活力時分別以水楊苷、微晶纖維素和羧甲基纖維素(CMC)為底物。通過濾紙酶活力的測定反映總纖維素酶活力。酶活力的測定采用還原糖法[18-19]。

2 結 果

2.1 菌株形態(tài)觀察與纖維降解特性

篩選出四株纖維降解細菌，在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)菌株在固體培養(yǎng)基上厭氧培養(yǎng)24 h左右，菌落形態(tài)呈表面光滑邊緣整齊的圓形，菌落起初為白色，隨著純化次數(shù)增多會變成黃色，且純化后的菌落產生的透明圈變小，有的甚至不產生透明圈。導致這種現(xiàn)象的原因可能是菌株間存在復雜的互作關系。跟據(jù)四株細菌在固體培養(yǎng)基和富集培養(yǎng)基中生長速度快慢判斷為不同的細菌，暫時將4株菌編號為H1、H2、N1、N2，并將菌株于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?株菌在濾紙培養(yǎng)基中培養(yǎng)后經肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，西林瓶中的濾紙均出現(xiàn)明顯的孔洞或絮狀，而空白對照瓶的濾紙則無任何變化，說明試驗菌株已對纖維濾紙有所降解。

2.2 菌株生理生化特性

菌株H1、H2、N1、N2的生理生化特性見表1。由表1可知，菌株H1、H2可發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、纖維二糖、七葉苷、半乳糖、水楊苷，不可發(fā)酵甘露醇、山梨醇、阿拉伯糖、木糖，不產硫化氫，不液化明膠，硝酸鹽還原為陰性；菌株N1、N2除乳糖發(fā)酵與H1、H2結果不同外，其余均相同。

表1 4株瘤胃纖維降解菌的生理生化特征

Table 1 The physiological and biochemical characteristics of four cellulolytic ruminal bacteria strains

生化特征BiochemicalcharacteristicsH1H2N1N2革蘭染色++++葡萄糖++++乳糖--++麥芽糖++++甘露醇----蔗糖++++山梨醇----阿拉伯糖----纖維二糖++++七葉苷++++半乳糖++++木糖----水楊苷++++產硫化氫----明膠液化----硝酸鹽還原----

+.陽性；-.陰性

+.Positive; -.Negative

2.3 菌株基因序列分析

用細菌特異性引物和細菌16S rDNA通用引物擴增的目的片段經瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1。如圖1所示H1、H2在295 bp有明顯的條帶，N1、N2在1 500 bp左右有明顯的條帶。將所測得的16S rDNA序列用NCBI的Blast程序進行同源序列比對，再結合生理生化特性，可判定H1、H2為黃色瘤胃球菌，N1、N2為鏈球菌，各菌株的對比結果見表2。

圖1 PCR產物凝膠電泳照片F(xiàn)ig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR-amplified 16S rDNA gene fragments

2.4 四株菌生長曲線的測定

測得四株菌生長曲線見圖2。由圖2可知，黃色瘤胃球菌H1、H2和鏈球菌N1、N2生長速度快且延遲期短，H1延遲期4 h，H2、N1、N2為3 h，四株菌經6 h達到生長平臺期。黃色瘤胃球菌平臺期菌體濃度大于鏈球菌，鏈球菌在20 h后出現(xiàn)菌體濃度下降的趨勢。

表2 4株瘤胃纖維降解菌的DNA序列相似性比較

Table 2 DNA sequence homology comparison of four cellulolytic ruminal bacteria strains

菌株編號StrainNo.最高相似度菌株名稱Mostsimilarstrain最高相似度菌株GenBank登錄號GenBankNo.ofthemostsimilarstrain相似性/%SimilarityH1黃色瘤胃球菌NZJNKE01000007.199H2黃色瘤胃球菌NZJNKE01000007.199N1鏈球菌NC017576.198N2鏈球菌NC_017576.199

圖2 黃色瘤胃球菌H1、H2和鏈球菌N1、N2生長曲線Fig.2 Growth curves for two Ruminococcus flavefaciens strains and two Streptococcus strains

2.5 四株菌纖維素酶活力的測定

4株菌纖維素酶活力結果見表3。由表3可以看出，四株菌均具有纖維素酶活力，但是同一種細菌測得的濾紙酶活力差異較大。四株細菌之間濾紙酶活力差異顯著(P<0.05)，其中菌株H2濾紙酶活力顯著高于其他三株菌(P<0.05)，N2濾紙酶活力顯著高于H1和N1(P<0.05)。H1、H2羧甲基纖維素酶活力顯著高于N1、N2(P<0.05)；H2微晶纖維素酶活力顯著高于其他三株菌(P<0.05)；H2水楊苷酶活力顯著低于其他三株菌(P<0.05)。

表3 4株菌纖維素酶活力

Table 3 The cellulose enzyme activity of four strains cellulolytic bacteria

μmol·(mL·min)-1

同種酶活力不同菌株之間，同列肩注字母相同表示差異不顯著(P>0.05)，同列肩注字母不同表示差異顯著(P<0.05)

Values with same superscript letters in the same column are of no significant difference (P>0.05), those with different letters are of significant or extreme difference (P<0.05)

3 討 論

作者采用hungate滾管培養(yǎng)法從蒙古綿羊瘤胃內容物中分離出兩株黃色瘤胃球菌和兩株鏈球菌。黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和產琥珀酸絲狀桿菌被認為是主要的瘤胃纖維素降解細菌[2]，無論是數(shù)量還是降解纖維素能力，這三種細菌在瘤胃纖維降解細菌中都占有絕對優(yōu)勢，但是對于三種菌在瘤胃中的數(shù)量比例目前仍存在爭議[20]。對于鏈球菌的分離鑒定在同類的研究中報道較少，娜仁圖雅[21]在分離瘤胃纖維降解細菌時也分離到一株鏈球菌。瘤胃微生物的體外培養(yǎng)需要的環(huán)境條件和培養(yǎng)基均比較苛刻，而且瘤胃微生物對于營養(yǎng)需要的復雜性和不確定性更加限制了對瘤胃纖維素降解細菌的分離和體外培養(yǎng)。本次試驗分離出的鏈球菌經濾紙降解試驗發(fā)現(xiàn)這兩株鏈球菌也具有纖維素酶活力，但是瘤胃鏈球菌具體作用和功能還有待進一步研究。

本試驗測定了四株細菌的生長曲線，四株菌生長延遲期均為3～4 h，黃色瘤胃球菌最大菌體濃度出現(xiàn)在28 h，吸光值為2.1；鏈球菌最大菌體濃度出現(xiàn)在14、16 h，吸光值為2.0、1.9。劉占英[22]在研究黃色瘤胃球菌生長曲線時其生長延遲期為10 h，穩(wěn)定期最大菌體濃度出現(xiàn)在25 h，吸光值為1.4。本試驗篩選出的四株菌生長延遲期短可能是因為篩選菌株過程中所用液體培養(yǎng)基和測定生長曲線所用液體培養(yǎng)基相同，菌株對培養(yǎng)基已經適應，導致測定生長曲線時細菌生長速度很快，所以出現(xiàn)延遲期短的現(xiàn)象。

纖維素的有效降解需要由纖維素酶系中的外切葡聚糖酶活力、內切葡聚糖酶活力和β-葡萄糖苷酶活力發(fā)揮協(xié)同作用才能完成，每一種組分酶活力偏低都會限制濾紙酶活力。本研究在分離過程中采用透明圈法初篩和濾紙降解復篩結合的方法篩選出同時具有外切葡聚糖酶活力、內切葡聚糖酶活力和β-葡萄糖苷酶活力的菌株，試驗結果表明所篩選菌株具有纖維素降解能力。許多研究表明纖維降解菌的纖維素降解能力大多用內切葡聚糖酶活力(羧甲基纖維素酶活力)來衡量，但是最終濾紙酶活力要結合羧甲基纖維素酶活、微晶纖維素酶活和水楊苷酶活來具體衡量。本研究測得黃色瘤胃球菌濾紙酶活力平均值為0.145 μmol·(mL·min)-1，鏈球菌為0.115 μmol·(mL·min)-1。關于鏈球菌纖維降解特性報道較少。周非帆[6]分離到3株瘤胃纖維降解細菌，經測定3株菌的濾紙酶活力平均值為0.028 μmol·(mL·min)-1。劉占英[22]測得黃色瘤胃球菌濾紙酶活力為0.18 μmol·(mL·min)-1。本試驗中纖維素酶活力測定結果表明羧甲基纖維酶活力高的菌株濾紙酶活力不一定高，例如菌株H1的羧甲基纖維素酶活力顯著高于N1、N2(P<0.01)，濾紙酶活力卻低于N1、N2。本試驗測得同種細菌間的濾紙酶活力差異較大，黃色瘤胃球菌H2濾紙酶活力顯著高于H1(P<0.01)，這表明在瘤胃纖維降解細菌的同一種內存在纖維素降解能力差異較大的菌株[22]。

4 結 論

(1)本試驗通過透明圈初篩濾紙降解復篩的方法分離得到四株纖維降解細菌，經鑒定H1、H2為黃色瘤胃球菌，N1、N2為鏈球菌。

(2)生長曲線測定結果表明菌株H1生長延遲期為4 h,H2、N1、N2 為3 h，四株菌6 h達到平臺期。

(3)通過對4株菌纖維素酶活力測定結果可知黃色瘤胃球菌H2的濾紙酶、羧甲基纖維素酶和微晶纖維素酶活力在4株菌中最高。

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(編輯 白永平)

Isolation and Identification of Four Strain Cellulolytic Bacteria in Rumen of Sheep and Cellulose Degradation Characteristics

WANG Wei-yun, LI Da-biao*, YU Yong-qiang, XING Yuan-yuan, LI Zi-jian

(CollegeofAnimalScience,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Hohhot010018，China)

Four cellulose-degrading rumen bacteria strains were isolated from Mongolia sheep. The four strains bacteria were identified and numbered as H1, H2, N1 and N2. The growth characteristics and cellulose activity were measured to provide experimental material for subsequent experiments. Bacterial morphological, physiological and biochemical characterization, DNA sequence homology analysis were used for identification of isolated strains. Growth curve of strains were measured by using spectrophotometer. Filter paper enzyme activity, CMCase activity, salicin activity and microcrystalline cellulose enzyme activity of four strains of cellulolytic bacteria were measured by using reducing sugar method. Two strains of bacteria H1, H2 were identified asRuminococcusflavefaciensand N1, N2 wereStreptococcus. The growth curves of four strains showed that lag phase of H1, H2, N1, N2 were 3-4 h and the maximum cell concentration of H1, H2 appeared in 28 h and N1, N2 appeared in 14 h. Four strains of bacteria had high activity of filter paper enzyme. The activity of filter paper enzyme, CMCase and microcrystalline cellulose enzyme were significantly higher for H2 than for H1, N1 and N2 (P<0.05). Filter paper enzyme activity of H1 was 0.08 μmol·(mL·min)-1and was lowest among four strains. Four strains bacteria with cellulose enzyme activity were isolated by using the method of roll tube technique. These four cellulolytic bacteria strains can be used for subsequent study.

cellulolytic bacteria in rumen; isolation; identification; cellulase

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.11.018

2016-05-19

國家自然科學基金項目(31201822)；內蒙古自治區(qū)自然科學基金項目(2011BS0403)

王衛(wèi)云(1991-)，女，內蒙古赤峰人，碩士生，主要從事反芻動物營養(yǎng)與瘤胃微生態(tài)研究，E-mail: wangweiyun1991@126.com

*通信作者：李大彪，主要從事反芻動物營養(yǎng)研究，E-mail: dkyldb@imau.edu.cn

S826

A

0366-6964(2016)11-2294-07