蘋果渣中結(jié)合酚不同提取方法的研究

張金宏,李俊娥,魏新元,樊明濤

(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西楊陵 712100)

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蘋果渣中結(jié)合酚不同提取方法的研究

張金宏,李俊娥,魏新元,樊明濤

(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西楊陵 712100)

在最優(yōu)條件下,以結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)的種類和含量為指標(biāo),比較堿法、酶法和酸法對(duì)蘋果渣中結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)的提取效果。采用單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化,HPLC-DAD法分別檢測游離態(tài)酚和結(jié)合態(tài)酚中單體酚的種類和含量。結(jié)果表明:在溫度為40 ℃下,選擇堿降解時(shí)間為4 h,NaOH濃度為3 mol/L;酸降解時(shí)間為15 h,甲醇/濃硫酸濃度為13∶1(v/v);酶降解時(shí)間為20 h,單寧酶酶活為1000 U。蘋果渣中酚類物質(zhì)主要是金絲桃苷、綠原酸、根皮苷、兒茶素、槲皮素、根皮素、沒食子酸、原兒茶酸和咖啡酸。兒茶素、槲皮素、根皮素、沒食子酸、原兒茶酸和咖啡酸主要以結(jié)合態(tài)的形式存在,沒食子酸、原兒茶酸、咖啡酸和根皮素通過酶法提取的含量最高,分別為16.122、18.574、13.030、69.934 μg/g;兒茶素和槲皮素通過酸法提取的含量最高,分別為148.909、66.396 μg/g。酶法水解和酸法水解比堿法水解更適用于提取蘋果渣中的結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)。

蘋果渣,游離酚,結(jié)合酚,優(yōu)化,HPLC-DAD檢測

蘋果是薔薇科(Rosaceae)蘋果屬(Malus)植物的果實(shí)[1]。蘋果是我國第一大水果,是我國少有的占據(jù)國際市場競爭優(yōu)勢的農(nóng)產(chǎn)品[2]。我國對(duì)蘋果的加工利用主要為初加工,如濃縮蘋果汁、蘋果酒、果醬等,在實(shí)際生產(chǎn)生活中,蘋果皮渣往往被扔掉或廢棄,造成大量資源的浪費(fèi)[3]。研究表明蘋果果皮中的多酚類物質(zhì)的含量遠(yuǎn)高于蘋果果肉中的多酚類物質(zhì)含量,蘋果多酚類物質(zhì)具有抗氧化、抗癌、護(hù)肝和抑制血壓升高等功能[4]。目前國內(nèi)外對(duì)蘋果多酚的研究主要集中在果皮和果肉中的游離態(tài)酚,對(duì)于蘋果渣中多酚物質(zhì)的提取和測定也僅分析了游離酚,而對(duì)蘋果中結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)的研究鮮有報(bào)道[5]。已有研究證實(shí),相對(duì)于游離態(tài)酚類物質(zhì),植物中結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)可能會(huì)具有更多的功能特性和發(fā)揮更強(qiáng)的生物活性[6-7]。植物多酚是植物體內(nèi)次生代謝的中間產(chǎn)物,由于植物酚類物質(zhì)大量分布于植物的外層組織(果皮、殼等)中,通常以結(jié)合態(tài)的形式連接在細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)上而難以直接提取出來,必須通過降解的方式使它們釋放出來[8]。蘇東曉等分別采用酸水解法和堿水解法提取荔枝果肉中的結(jié)合酚,發(fā)現(xiàn)酸水解法更適合提取荔枝果肉中的結(jié)合態(tài)酚[9]。因此,有必要探索不同的方法提取蘋果渣中的游離態(tài)酚和結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì),準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)蘋果渣中酚類物質(zhì)的種類和含量,為蘋果皮渣的進(jìn)一步開發(fā)利用打下基礎(chǔ)。

本研究以優(yōu)質(zhì)紅富士蘋果為原料,采用70%乙醇水溶液來提取蘋果渣中的游離態(tài)酚,以提取后的皮渣為原料,分別采用堿法、酶法和酸法來提取蘋果渣中的結(jié)合態(tài)酚,用HPLC-DAD檢測游離態(tài)酚和結(jié)合態(tài)酚中單體酚的種類與含量,為蘋果渣中蘋果多酚資源的深度開發(fā)利用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Folin-Ciocalteu試劑 北京Solarbio科技有限公司;色譜甲醇 TEDIA;純度98%以上的沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、綠原酸、表兒茶素、咖啡酸、阿魏酸、金絲桃苷、根皮苷、鞣花酸、槲皮素和根皮素等12種標(biāo)品 上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司;沒食子酸 分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;單寧酶(酶活為200 u/g)上海源葉生物科技有限公司;無水乙醇、乙酸乙酯、正己烷、NaCO3、HCl、濃硫酸、NaOH、磷酸、甲醇、冰乙酸、醋酸鈉 均為國產(chǎn)分析純試劑。

UVmini-1240型紫外可見分光光度計(jì) 日本京都島津制作所;R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士BUCHI有限公司;SHB-Ⅲ循環(huán)水真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;YLE-2000電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司;HC-3018R高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;JA2003N電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;KQ-500DE超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;Waters 600E高效液相色譜儀 美國Waters;PHS-3C型pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;BCD-256KZL型-20 ℃冰箱 青島海爾股份有限公司;BM252C榨汁機(jī) 美的集團(tuán);QYC-200搖床 上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;101-1烘箱 北京科偉永興儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘋果渣的制備 蘋果渣:將市售的優(yōu)質(zhì)紅富士蘋果清洗、切塊、榨汁(加入1%的抗壞血酸)、抽濾之后得到蘋果渣,立即將其貯存于-20 ℃,備用(全程注意避光)[10]。

1.2.2 蘋果渣中游離態(tài)酚的提取 蘋果渣中游離態(tài)酚的提取參考汪浩明的方法,并稍作修改[10]。準(zhǔn)確稱取5.000 g蘋果渣,加入70%乙醇125 mL,在30 ℃的水浴中提取3次,每次40 min,過濾,再將濾液在4000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min,收集合并上清液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在0.09 MPa下濃縮,濃縮液用甲醇定容至10 mL,于-20 ℃冰箱里密封避光保存,待測。濾渣備用以提取結(jié)合態(tài)酚。

1.2.3 堿法提取蘋果渣中的結(jié)合態(tài)酚

1.2.3.1 提取方法 參照Morimura S等的方法并略有改動(dòng)[11-12]。先將1.2.2中提取后的濾渣用90 mL的正己烷洗滌去脂,再將其在10000 g轉(zhuǎn)速下離心10 min,去掉上清液,再向其中加入40 mL 2 mol/L NaOH溶液,充入氮?dú)饷芊夂蠓謩e在40 ℃下?lián)u床消化4 h。待所得水解液冷卻后用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH至2,再將其在10000 g轉(zhuǎn)速下離心15 min,將酸性上清液轉(zhuǎn)移到干凈的分液漏斗里,殘余物用10 mL的超純水洗滌并在10000 g轉(zhuǎn)速下離心15 min。將此上清液與酸性上清液混合,再將混合的提取液用60 mL乙酸乙酯萃取6次,混合振動(dòng)10 min,再離心分離。收集萃取相,將萃取液在40 ℃下減壓濃縮至干,濃縮物用甲醇定容至10 mL,得結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)提取液,于-20 ℃冰箱里密封避光保存,測定多酚含量。

1.2.3.2 堿降解濃度的確定 采用1.2.3.1中提取方法,分別用1、2、3、4、5、6 mol/L NaOH降解后減壓濃縮至干,測定多酚含量。

1.2.3.3 堿降解時(shí)間的確定 采用1.2.3.1中提取方法和1.2.3.2中所篩選的堿降解濃度,分別降解1、2、3、4、5、6 h后減壓濃縮至干,測定多酚含量。

1.2.4 酸法提取蘋果渣中的結(jié)合態(tài)酚

1.2.4.1 提取方法 參考Hartzfeld等建立的方法并略有改動(dòng)[13]。先將1.2.2中提取后的濾渣用90 mL的正己烷洗滌去脂,再將其在10000 g轉(zhuǎn)速下離心10 min,去掉上清液。再向其中加入20 mL甲醇/濃硫酸(18 mol/L)(9∶1,v/v),充入氮?dú)饷芊夂蠓謩e在40 ℃下?lián)u床消化15 h。待所得水解液冷卻后用6 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至中性,再將其在10000 g轉(zhuǎn)速下離心15 min,將酸性上清液轉(zhuǎn)移到干凈的分液漏斗里,殘余物用10 mL的超純水洗滌并在10000 g轉(zhuǎn)速下離心15 min。將此上清液與酸性上清液混合,再將混合的提取液用60 mL乙酸乙酯萃取6次,并混合振動(dòng)10 min,再離心分離。收集萃取相,將萃取液在40 ℃下減壓濃縮至干,濃縮物用甲醇定容至10 mL,得結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)提取液,于-20 ℃冰箱里密封避光保存,測定多酚含量。

1.2.4.2 酸降解濃度的確定 采用1.2.4.1中提取方法,分別用濃度為5∶1、7∶1、9∶1、11∶1、13∶1、15∶1甲醇:濃硫酸(v/v)降解后減壓濃縮至干,測定多酚含量。

1.2.4.3 酸降解時(shí)間的確定 采用1.2.4.1中提取方法和1.2.4.2所篩選的酸降解濃度,分別降解5、10、15、20、25 h后減壓濃縮至干,測定多酚含量。

1.2.5 酶法提取蘋果渣中的結(jié)合態(tài)酚

1.2.5.1 提取方法 參考S. Chamorro等的方法并略有改動(dòng)[6]。先將1.2.2中提取后的濾渣用90 mL的正己烷洗滌去脂,再將其在10000 g轉(zhuǎn)速下離心10 min,去掉上清液。再向其中加入2 g 200 U/g酶活的單寧酸酶,用0.2 mol/L乙酸鈉緩沖液40 mL溶解單寧酸酶,在35 ℃,100 r/min的條件下分別水解24 h。待水解液冷卻后再將其在6000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min,收集上清液,殘余物用10 mL的超純水洗滌并在10000 g轉(zhuǎn)速下離心15 min。將此時(shí)的上清液與之前的上清液混合,再將混合的提取液用60 mL乙酸乙酯萃取6次,并混合振動(dòng)10 min,再離心分離。收集萃取相,將萃取液在40 ℃下減壓濃縮至干,濃縮物用甲醇定容至10 mL,得結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)提取液,于-20 ℃冰箱里密封避光保存,測定多酚含量。

1.2.5.2 加酶量的確定 采用1.2.5.1中提取方法,分別用酶活為200、400、600、800、1000、1200 U單寧酶降解后減壓濃縮至干,測定多酚含量。

1.2.5.3 酶降解時(shí)間的確定 采用1.2.5.1中提取方法和1.2.5.2所篩選的加酶量,分別降解12、16、20、24、28 h后減壓濃縮至干,測定多酚含量。

1.2.6 多酚含量的測定 多酚含量的測定采用優(yōu)化的Folin-Ciocalteu法并稍作修改[14]。用沒食子酸做標(biāo)準(zhǔn)溶液,配制沒食子酸溶液質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL,分別取0、1、2、3、4、5、6 mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇稀釋成10～60 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,吸取0.5 mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液加到盛有2.5 mL蒸餾水的試管中,再加入0.5 mL Folin-Ciocalteu試劑,充分混合,再加入1.5 mL 7.5%碳酸鈉溶液,搖勻后放置在避光條件下室溫反應(yīng)2 h。在765 nm處用紫外分光光度計(jì)測定吸光度,以含量對(duì)吸光度(A)進(jìn)行直線回歸,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定樣品多酚含量時(shí)取多酚提取液0.5 mL代替沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行反應(yīng),測定吸光度,再通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程算出樣品中多酚的含量,結(jié)果以每1 kg樣品中沒食子酸當(dāng)量(mg/kg干果渣,簡寫為DP)表示。

1.2.7 HPLC-DAD法測定單體酚的種類和含量

1.2.7.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精確地稱取1 mg標(biāo)品溶解于10 mL甲醇中作為儲(chǔ)備液。使用的混標(biāo)溶液是將所有的標(biāo)品儲(chǔ)備液混合至所需濃度。混標(biāo)中所含有的標(biāo)品有沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、綠原酸、表兒茶素、咖啡酸、阿魏酸、金絲桃苷、根皮苷、鞣花酸、槲皮素、根皮素,所有這些標(biāo)品的濃度均為8.333 μg/mL。這些儲(chǔ)備液在4 ℃下避光保存,進(jìn)樣前使用0.45 μm濾膜過濾。

1.2.7.2 色譜條件 色譜柱:WondSil? C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)。使用Empower軟件獲得液相的數(shù)據(jù)并對(duì)其進(jìn)行處理。流動(dòng)相:A是0.01%磷酸水溶液,B是色譜級(jí)甲醇。流速:0.8 mL/min。進(jìn)樣量:20 μL。柱溫:30 ℃。采用梯度洗脫程序:流動(dòng)相B在0～20 min從20%上升到50%;在20～25 min從50%上升到70%;在25～30 min從70%上升到80%;在30～35 min從80%下降到20%;35～45 min,20% B。280 nm下中性酚有最大吸收,320 nm下酸性酚有最大吸收,為使吸收效果最好,紫外檢測波長采用280 nm和320 nm。

將這12種單體酚分別配成甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液,在上述色譜條件下進(jìn)行測定,確定標(biāo)品的保留時(shí)間。

分別準(zhǔn)確稱取0.0010 g 12種標(biāo)品溶于甲醇中,分別定容于10 mL棕色容量瓶中,并稀釋成不同的濃度梯度,在上述色譜條件下進(jìn)行測定,以濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制每種單體酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在上述色譜條件下對(duì)樣品進(jìn)行檢測,對(duì)照標(biāo)品的保留時(shí)間和樣品的保留時(shí)間確定單體酚的種類,獲得的峰面積再根據(jù)所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線得到相對(duì)應(yīng)單體酚的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Excel 2010和DPS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿法提取蘋果渣中的結(jié)合態(tài)酚

2.1.1 堿降解濃度的選擇 以堿降解濃度為變量,以總酚含量為指標(biāo),得到如圖1所示結(jié)果:

圖1 不同堿降解濃度對(duì)結(jié)合酚提取效果的影響Fig.1 The extraction effect of the different degradation concentration for bound phenols

圖1可見,在低濃度時(shí),隨著NaOH溶液濃度的增大,結(jié)合酚的提取量增加,在4 mol/L時(shí)達(dá)到最大,之后稍有減少并且趨于不變,但當(dāng)NaOH溶液濃度為3 mol/L和4 mol/L時(shí),結(jié)合酚的含量沒有顯著性差異,故最佳堿降解濃度為3 mol/L。

2.1.2 堿降解時(shí)間的選擇 以堿降解時(shí)間為變量,以總酚含量為指標(biāo),得到如圖2所示結(jié)果:

圖2 不同堿降解時(shí)間對(duì)結(jié)合酚提取效果的影響Fig.2 The extraction effect of the different alkaline degradation time for bound phenols

圖2可見,堿降解4 h所得結(jié)合酚的量要高于1～3 h的量,稍高于5 h和6 h的量,這是因?yàn)? h時(shí)水解基本已完成,再繼續(xù)水解,多酚物質(zhì)會(huì)被氧化進(jìn)而導(dǎo)致含量稍有降低,因此最佳堿降解時(shí)間確定為4 h。

2.2 酸法提取蘋果渣中的結(jié)合態(tài)酚

2.2.1 酸降解濃度的選擇 以酸降解濃度為變量,以總酚含量為指標(biāo),得到如圖3所示結(jié)果:

圖3 不同酸降解濃度對(duì)結(jié)合酚提取效果的影響Fig.3 The extraction effect of the different degradation concentration for bound phenols

圖3可見,甲醇/濃硫酸(v/v)的濃度達(dá)到13∶1時(shí)所得結(jié)合酚的量最大,濃硫酸濃度過高或過低,都不利用酯鍵的水解,即不利于結(jié)合酚的釋放,故最佳酸降解濃度確定為13∶1。

2.2.2 酸降解時(shí)間的選擇 以酸降解時(shí)間為變量,以總酚含量為指標(biāo),得到如圖4所示結(jié)果:

圖4 不同酸降解時(shí)間對(duì)結(jié)合酚提取效果的影響Fig.4 The extraction effect of the different acid degradation timefor bound phenols

圖4可見,酸降解20 h所得結(jié)合酚的量要高于5～15 h的量,與25 h的量相同,這是因?yàn)?0 h時(shí)水解基本已完成,再繼續(xù)水解,多酚物質(zhì)會(huì)被氧化進(jìn)而導(dǎo)致含量稍有降低,故最佳酸降解時(shí)間確定為15 h。

2.3 酶法提取蘋果渣中的結(jié)合態(tài)酚

2.3.1 酶降解加酶量的選擇 以加酶量為變量,以總酚含量為指標(biāo),得到如圖5所示結(jié)果:

圖5 不同酶降解濃度對(duì)結(jié)合酚提取效果的影響Fig.5 The extraction effect of the different hydrolysis concentration for bound phenols

圖5可見,隨著酶活的逐漸增大,結(jié)合酚的提取量逐漸增加,在1000 U時(shí)達(dá)到最大且趨于不變,這是由于酶活達(dá)到一定程度時(shí),水解作用基本趨于飽和,結(jié)合酚的量幾乎無變化,故最佳酶活確定為1000 U。

2.3.2 酶降解時(shí)間的選擇 以酶降解時(shí)間為變量,以總酚含量為指標(biāo),得到如圖6所示結(jié)果:

圖6 不同酶降解時(shí)間對(duì)結(jié)合酚提取效果的影響Fig.6 The extraction effect of the different enzymatic hydrolysis time for bound phenols

圖6可見,酶降解24 h所得結(jié)合酚的量要高于12～20 h的量,與28 h的量相同,這是因?yàn)?0 h時(shí)水解基本已完成,再繼續(xù)水解,多酚物質(zhì)會(huì)被氧化進(jìn)而導(dǎo)致含量稍有降低,因此最佳酶降解時(shí)間確定為20 h。

2.4 蘋果渣中游離酚和結(jié)合酚中單體酚的種類和含量

HPLC-DAD法分別檢測蘋果渣中游離酚和結(jié)合酚的液相圖如圖7所示:

圖7 280 nm下多酚標(biāo)品(A)和蘋果渣中的游離酚(A0)以及320 nm下多酚標(biāo)品(B)和蘋果渣中的游離酚(B0)的高效液相色譜圖Fig.7 HPLC profiles at 280 nm of phenolic compounds of standards(A)and free phenols of apple pomace(A0)and at 320 nm of phenolic compounds of standards(B)and free phenols of apple pomace(B0)注:1.沒食子酸;2.原兒茶酸;3.兒茶素;4.綠原酸;5.表兒茶素;6.咖啡酸;7.阿魏酸;8.金絲桃苷;9.根皮苷;10.鞣花酸;11.槲皮素;12.根皮素。

由圖7可知,沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、綠原酸、表兒茶素、咖啡酸、阿魏酸、金絲桃苷、根皮苷、鞣花酸、槲皮素和根皮素的保留時(shí)間分別為:7.347、11.785、13.770、16.000、17.598、18.819、24.788、28.356、29.567、32.610、34.178和36.151 min。圖7-A是混標(biāo)在280 nm條件下的色譜圖,每個(gè)標(biāo)品都能出峰,但只有中性酚出現(xiàn)最大吸收;圖7-B是混標(biāo)在320 nm條件下的色譜圖,此波長下中性酚吸收很小或沒有吸收,而酸性酚有最大吸收。因此,按照每個(gè)多酚標(biāo)品的最大吸收來進(jìn)行定性定量,兒茶素、表兒茶素、金絲桃苷、根皮苷、鞣花酸、槲皮素和根皮素的最大吸收波長為280 nm;沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸的最大吸收波長為320 nm。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間來確定樣品中單體酚的種類,采用外標(biāo)法確定其含量,游離酚和結(jié)合酚中單體酚的種類和含量如表1和表2所示:

表1 蘋果渣游離酚中單體酚的種類和含量a

注:a平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;n=3。ND:沒有檢測到。

表2 3種方法提取蘋果渣結(jié)合酚中單體酚的種類和含量a

注:同行不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。 由表1可知,蘋果渣里提取出的游離酚中含有的單體酚是金絲桃苷、綠原酸、根皮苷、表兒茶素、咖啡酸和槲皮素,其中金絲桃苷、綠原酸和根皮苷的含量較高,分別為209.792、128.473、71.723 μg/g;有6種單體酚未檢測到,即沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、阿魏酸、鞣花酸和根皮素,蘇東曉發(fā)現(xiàn)9種游離酚類物質(zhì)存在于荔枝果肉中[9]。

由表2可知,蘋果渣結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)主要有兒茶素、槲皮素、根皮素、沒食子酸、原兒茶酸和咖啡酸。用3種不同方法提取出的蘋果渣結(jié)合酚中所含單體酚的種類基本相同,堿解結(jié)合酚中檢測到了11種單體酚,酶解結(jié)合酚中檢測到了12種單體酚,酸解結(jié)合酚中檢測到了9種單體酚,但不同方法提取的結(jié)合酚所含單體酚含量差異達(dá)到顯著水平(p<0.05)。沒食子酸在酶法提取的結(jié)合酚中含量最高,為16.122 μg/g。原兒茶酸通過酶法提取的含量最高,為18.574 μg/g。兒茶素通過堿法和酸法提取的含量均較高,分別為116.280、148.909 μg/g。綠原酸在結(jié)合態(tài)中也檢測到了,但含量較低。表兒茶素只在酶法提取的結(jié)合酚中檢測到了,但含量較低。咖啡酸通過酶法提取的含量最高,為13.030 μg/g。3種方法提取處理后阿魏酸、金絲桃苷、根皮苷和鞣花酸含量均較低。槲皮素通過酶法和酸法提取的含量較高,分別為44.622、66.396 μg/g。根皮素通過酶法和酸法提取的含量較高,分別為69.934、36.596 μg/g。蘇東曉采用酸法水解和堿法水解荔枝果渣分別釋放出7種和4種單體酚[9]。單體酚總量和總酚含量有較大差距,可能是由于提取液中有部分不是酚類的物質(zhì)對(duì)光有吸收,或是有些物質(zhì)與酚類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)較相近,導(dǎo)致吸光度偏大。

綜合表1和表2結(jié)果,蘋果渣中蘋果多酚的種類主要是金絲桃苷、綠原酸、根皮苷、兒茶素、槲皮素、根皮素和沒食子酸,其中綠原酸、金絲桃苷和根皮苷主要以游離態(tài)的形式存在,兒茶素、槲皮素、根皮素、沒食子酸、原兒茶酸和咖啡酸主要以結(jié)合態(tài)的形式存在。

果蔬中有部分多酚類物質(zhì)是以結(jié)合態(tài)形式存在,結(jié)合型酚類化合物主要通過酯鍵、醚鍵和縮醛鍵與細(xì)胞壁構(gòu)成膳食纖維,不能被直接提取出來。單寧酶可催化水解酯類和水解單寧酸或沒食子酸酯中的縮酚酸鍵,如催化表沒食子兒茶素O-沒食子酸鹽(ECGG)或表兒茶素O-沒食子酸鹽(ECG)可釋放出沒食子酸和表兒茶素[15-17],故3種水解方法中提取出的結(jié)合酚只有酶結(jié)合酚中檢測到了表兒茶素單體酚,且沒食子酸含量最高。有研究表明,堿法、酶法和酸法均用于水解結(jié)合酚,但堿法水解多用于水解谷物類的結(jié)合酚。本研究也發(fā)現(xiàn)酶法水解和酸法水解所提取出的蘋果渣中結(jié)合酚的種類及含量優(yōu)于堿法水解,這是由于單寧酶可以促進(jìn)植物細(xì)胞壁的降解,釋放出結(jié)合酚;酸法水解使得酸性酚更易于釋放出來。因此,酶法水解和酸法水解比堿法水解更適用于提取蘋果渣中的結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)。

3 結(jié)論

本研究表明,堿法提取結(jié)合酚中最佳堿降解時(shí)間為4 h,NaOH濃度為3 mol/L;酸法提取結(jié)合酚中最佳酸降解時(shí)間為15 h,甲醇/濃硫酸濃度為13∶1(v/v);酶法提取結(jié)合酚中最佳酶降解時(shí)間為20 h,單寧酶酶活為1000 U。蘋果渣中酚類物質(zhì)主要由金絲桃苷、綠原酸、根皮苷、兒茶素、槲皮素、根皮素和沒食子酸等組成,其中游離態(tài)酚類物質(zhì)以金絲桃苷、綠原酸和根皮苷為主,結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)以兒茶素、槲皮素、根皮素、沒食子酸、原兒茶酸和咖啡酸為主。酸法和酶法比堿法更適合于提取蘋果渣中的結(jié)合酚。蘋果渣中含有較豐富的酚類物質(zhì),可以根據(jù)酚類物質(zhì)的存在形式進(jìn)行深度開發(fā)和利用,避免資源浪費(fèi)。

[1]冉軍艦. 蘋果多酚的組分鑒定及功能特性研究[D]. 楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2013.

[2]吳茂玉,馬超,王春燕,等.蘋果采后產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及發(fā)展策略研究[J]. 中國果菜,2014,10:1-7.

[3]蘋果加工副產(chǎn)物綜合利用問題亟待解決[J]. 農(nóng)業(yè)工程技術(shù)(農(nóng)產(chǎn)品加工業(yè)),2014,10:33.

[4]白鳳岐,馬艷莉,李笑顏,等. 6個(gè)品種蘋果品質(zhì)及加工適宜性研究[J]. 食品科技,2014(9):66-71.

[5]李青,張名位,張瑞芬,等. 5種秈稻品種谷殼中游離態(tài)和結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)含量及其抗氧化活性比較[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2012(6):1150-1158.

[6]S Chamorro,A Viveros,I Alvarez,et al. Changes in polyphenol and polysaccharide content of grape seed extract and grape pomace after enzymatic treatment[J]. Food Chemistry,2012,133:308-314.

[7]Shoji T,Matsumoto S,Moriichi N,et al. Apple procyanidin oligomers absorption in rats after oral administration:analysis of procyanidins in plasma using the porter method and high performance liquid chromatography/tandem mass spectrophotometry[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2006,54:509-512.

[8]劉天行,郭佳,王偉,等. 小米中結(jié)合型酚類化合物的分離與鑒定[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,1:138-142.

[9]蘇東曉. 荔枝果肉多酚的分離鑒定及其調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝作用機(jī)制[D]. 武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2014.

[10]汪浩明,陳潔,黃行健,等.蘋果渣中蘋果多酚的提取工藝優(yōu)化[J]. 化學(xué)與生物工程,2012(8):76-78,91.

[11]Morimura S,Nagata H,Uemura Y,et al. Development of an effective process for utilization of collagen from livestock and fish waste[J]. Process Biochemistry,2002,37:1403-1412.

[12]朱春秋,程代,蔡曉菲,等. 棗果皮結(jié)合酚的大鼠體內(nèi)吸收及抗氧化能力研究[J]. 食品工業(yè)科技,2012(3):352-354.

[13]Hartzfeld P W,R Forkner,M D Hunter,et al. Determination of Hydrolyzable Tannins(Gallotannins and Ellagitannins)after Reaction with Potassium Iodate[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2002,50:1785-1790.

[14]Singleton V L.,Orthofer R.,Lamuela-Raventos R M. Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin Ciocalteu reagent[J]. Methods in Enzymology,1999,299:152-178.

[15]Min-Jer Lu,Chinshuh Chen. Enzymatic modification by tannase increases the antioxidant activity of green tea[J]. Food Research International,2008,41(92):130-137.

[16]PK Lekha,BK Lonsane. Production and Application of Tannin Acyl Hydrolase:State of the Art[J]. Advances of Applied Microbiology,1997,44:215-260.

[17]Garcia-Conesa M T,Ostergaard P,Kauppinen,S,et al. Hydrolysis of diethyl diferulates by tannase from Aspergillus oryzae[J]. Carbohydrate Polymers,2001,44:319-324.

Effects of different extraction methods on bound phenols in apple pomace

ZHANG Jin-hong,LI Jun-e,WEI Xin-yuan,FAN Ming-tao*

(College of Food Science and Engineering,NWSUAF,Yangling 712100,China)

The bound phenols in the apple pomace were released by alkaline degradation,acid degradation,and enzymatic hydrolysis respectively,and the degradation conditions were optimized using single factor experiment. The HPLC-DAD method was applied to detect the types and contents of individual phenolic in free phenol and three kinds of bound phenols. The optimum alkaline degradation time was 4 h,and the NaOH concentration was 3 mol/L,and the optimum acid degradation time was 15 h,and the methanol/concentrated sulfuric acid concentration was 13∶1(v/v),and the optimum enzymatic degradation time was 20 h,and the tannase activity was 1000 U. Hyperoside,chlorogenic acid,phlorizin,catechin,quercetin,phloretin and gallic acid were the major polyphenols of apple pomace. Catechin,quercetin,phloretin,gallic acid,protocatechuic acid and caffeic acid were mainly in bound form. The highest content of gallic acid,protocatechuic acid,caffeic acid and phloretin by enzymatic hydrolysis were 16.122,18.574,13.030 and 69.934 μg/g respectively,and the highest content of catechin and quercetin by acid degradation were 148.909 μg/g and 66.396 μg/g respectively. Acid degradation and enzymatic hydrolysis were more suitable than alkaline hydrolysis for the extraction of bound phenols of apple pomace.

Apple pomace;Free phenol;Bound phenol;Optimization;HPLC-DAD detection

2016-05-06

張金宏(1991-)女,碩士研究生,研究方向:食品工程,E-mail:18789498190@163.com。

*通訊作者:樊明濤(1963-)男,教授,研究方向:食品生物技術(shù)與食品安全,E-mail:fanmt@nwsuaf.edu.cn。

陜西戰(zhàn)略性新型產(chǎn)業(yè)重大產(chǎn)品(群)項(xiàng)目-農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。

TS255.2

A

1002-0306(2016)20-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.20.000