GLI3基因表達與新疆維吾爾族先天性馬蹄內(nèi)翻足發(fā)病的關系

程國杰，呂發(fā)明，王晶，艾克巴爾·阿不都熱西提，董豪杰

(新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院，烏魯木齊830000)

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GLI3基因表達與新疆維吾爾族先天性馬蹄內(nèi)翻足發(fā)病的關系

程國杰，呂發(fā)明，王晶，艾克巴爾·阿不都熱西提，董豪杰

(新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院，烏魯木齊830000)

目的 探討GLI3基因表達與新疆維吾爾族先天性馬蹄內(nèi)翻足(ICTEV)發(fā)病之間的關系。方法 選擇新疆地區(qū)84例ICTEV患兒(維吾爾族51例，漢族33例)和39例足部創(chuàng)傷正常兒童(維吾爾族25例，漢族14例)，分別采用實時熒光定量PCR、Western blot法檢測足部肌肉組織中的GLI3 mRNA及蛋白。結(jié)果 觀察組足部肌肉組織中GLI3 mRNA及蛋白相對表達量分別為0.61±0.02、68.72±3.05，對照組分別為0.07±0.01、22.38±1.74，P均<0.01；觀察組維吾爾族患兒足部肌肉組織中GLI3 mRNA及蛋白相對表達量分別為0.73±0.01、83.01±4.42，漢族患兒分別為0.40±0.02、56.85±3.50，P均<0.05；對照組維吾爾族和漢族患兒足部肌肉組織中GLI3 mRNA及蛋白相對表達量比較，P均>0.05。結(jié)論 GLI3基因表達與新疆維吾爾族ICTEV的發(fā)病有一定關系，維吾爾族可能更易受GLI3基因表達水平的影響而導致ICTEV的發(fā)生。

先天性馬蹄內(nèi)翻足；GLI3基因；維吾爾族；漢族；發(fā)病關系；新疆;兒童

先天性馬蹄內(nèi)翻足(ICTEV)是一種常見的嚴重影響兒童足功能的先天畸形之一，發(fā)病率為1%～8%[1]，目前該病的致病原因尚不明確。相關研究表明，遺傳、血管發(fā)育異常和多細胞因子相互作用等因素在ICTEV發(fā)病過程的起到重要作用[2]。流行病學調(diào)查顯示，不同民族間ICTEV發(fā)病率存在明顯差異，我國維吾爾族ICTEV患病率明顯高于本地區(qū)其他民族[3]。因此，在排除氣候、環(huán)境、生活方式等方面的影響之外，應注意因遺傳和多細胞因子平衡作用所致的民族間ICTEV發(fā)病率差異[4～6]。SHH-GLI信號通路是胚胎發(fā)育過程中重要信號通路之一，在正常肢體發(fā)育方面發(fā)揮至關重要的作用[7]。GLI3基因作為GLI基因家族成員，其與SHH相互制約、相互平衡確保肢體的正常形態(tài)。2005年，Johnston等[8]證實GLI3基因突變是導致多指(趾)綜合征的原因之一。因此，選擇人體先天性肢體缺陷影響因子GLI3，以及與其他民族ICTEV發(fā)病率存在明顯差異的維吾爾族作為發(fā)病關系的研究對象，是了解維吾爾族ICTEV高發(fā)病率成因，以及進一步探索ICTEV致病原因的有效方法。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年2月～2015年11月新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院創(chuàng)傷骨科收治的84例ICTEV患兒(觀察組)，其中男56例、女28例，年齡(6.45±2.11)歲；維吾爾族51例，漢族33例；均符合《骨科診療常規(guī)》中ICTEV的診斷標準，術中收集患兒足部肌肉組織。選擇新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院和喀什人民醫(yī)院收治的足部創(chuàng)傷患兒39例(對照組)，其中男22例、女17例，年齡(7.11±2.10)歲；維吾爾族25例，漢族14例；均無其他疾病，術中收集患兒足部肌肉組織。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會通過，患兒家長均簽署知情同意書。兩組患兒性別、年齡及民族構(gòu)成均具有可比性(P均>0.05)。

1.2 足部肌肉組織中GLI3基因檢測方法 采用實時熒光定量PCR法。以TRIzol試劑盒提取ICTEV患兒和正常兒童足部肌肉組織的總RNA，運用Invitrogen公司MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行RNA反轉(zhuǎn)錄，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA置于-70 ℃冷凍保存。按照Invitrogen公司Platinum SYBR Green qPCR Super Mix Kit使用說明書操作。GLI3 mRNA上游引物為5′-TTTTCCAACACAGAGGCCTATTC-3′，下游引物為5′-ATCTTGGACCTCTTGTTGTGCAT-3′，擴增片段153 bp；β-actin上游引物為5′-TCACCCACACTGCCCATCTACGA-3′，下游引物為5′- CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3′，擴增片段205 bp；引物均有上海生工生物工程股份有限公司合成。反應體系(25 μL)：SYBR Green Realtime PCR Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA樣品2 μL，去離子水8.5 μL；反應條件:95 ℃ 預變性5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；56 ℃退火無延伸步驟。記錄各擴增反應Ct值，mRNA相對表達量2-ΔCt=CT目的基因-CT看家基因，計算GLI3基因mRNA相對表達量。

1.3 足部肌肉組織中GLI3蛋白檢測方法 采用Western blot法。提取ICTEV患兒和正常兒童足部肌肉組織蛋白，采用Bradford法測定總蛋白量。取30 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)入PVDF膜進行封閉。封閉結(jié)束后，用1∶300稀釋的鼠抗人GLI3抗體和鼠抗人β-actin抗體室溫雜交1 h，1∶2 000稀釋的辣根過氧化酶標記的山羊抗鼠(二抗)室溫孵育1 h。條帶經(jīng)Odyssey紅外線熒光掃描儀掃描后，采用Image-Pro Plus圖像軟件進行分析。以目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶的光密度比值，表示目的蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 兩組足部肌肉組織中GLI3 mRNA及蛋白相對表達量比較 見表1。

表1 兩組足部肌肉組織中GLI3 mRNA及蛋白相對表達量比較±s)

注：與對照組比較，*P<0.01。

2.2 維吾爾族與漢族患兒足部肌肉組織中GLI3 mRNA及蛋白相對表達量比較 見表2。

表2 維吾爾族與漢族患兒足部肌肉組織中GLI3 mRNA及蛋白相對表達量比較±s)

注：與同組漢族比較，*P<0.05。

3 討論

ICTEV是一種常見的骨科出生缺陷，嚴重威脅兒童的身體和心理健康。近年新疆地區(qū)ICTEV發(fā)病率呈明顯上升趨勢，喀什、和田等南疆地區(qū)維吾爾族ICTEV發(fā)病率明顯高于新疆其他民族和全國發(fā)病水平。當?shù)豂CTEV流行病學調(diào)查提示，骨骼發(fā)育異常、血管發(fā)育異常、遺傳因素、母親吸煙史和多種細胞因子的相互作用可能是導致ICTEV發(fā)病的主要原因。隨著分子生物學的快速發(fā)展，關于細胞基因表達對ICTEV發(fā)病和畸形程度影響的相關研究備受關注。Wang等[9]運用實時定量RT-PCR檢測ICTEV患兒肌肉組織，發(fā)現(xiàn)ICTEV患兒肌肉組織Pitx1、Col2al基因表達水平明顯下調(diào)，表明兩種基因與ICTEV存在一定關系。此外，Wang等[10]發(fā)現(xiàn)，ICTEV患兒肌肉組織SOX9基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達量明顯高于正常人。推測在ICTEV的致病過程中，SOX9基因過度表達可能發(fā)揮重要作用。Cao等[11]利用RT-PCR、免疫組化和Western blot法分析大鼠En1基因與ICTEV的相關性，結(jié)果證實En1、GLI3基因在ICTEV模型鼠中表達水平分別下降和上升；通過P-Match軟件分析提示，在ICTEV模型鼠中，En1基因表達水平下降可能引起GLI3基因表達水平上升，最終導致大鼠ICTEV的發(fā)生。

SHH-GLI信號通路由SHH分泌蛋白啟動，在靶細胞中引發(fā)一系列反應，最終與GLI轉(zhuǎn)錄因子家族共同作用導致靶基因的激活或抑制，對胚胎正常發(fā)育起到至關重要的作用[12]。相關研究表明，GLI3作為SHH-GLI信號通路中的關鍵細胞因子，通過自身裂解來抑制SHH靶基因的表達，而SHH同樣可以抑制GLI3的裂解，達到SHH-GLI3相互平衡的狀態(tài)，以維持肢體的正常形態(tài)[13,14]；如果機體一旦失去SHH-GLI的平衡狀態(tài)，將導致多種先天畸形的發(fā)生。例如，在指的發(fā)育中，如果沒有SHH的作用，GLI3的抑制效應占優(yōu)勢，其靶基因被抑制而出現(xiàn)形態(tài)異常；但除去GLI3，機體同樣不能維持正常形態(tài)，甚至出現(xiàn)多指現(xiàn)象[7]。此外，GLI3基因的突變同樣可以引起肢體的異常形態(tài)。Johnston等[8]為進一步證實GLI3基因突變可能導致多指(趾)綜合征，對89例患者進行GLI3基因突變檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)47種致病突變，并且GLI3突變多數(shù)是DNA重復、大片段缺失以及錯義、移碼、無義突變。而本研究表明，ICTEV患兒足部肌肉組織中GLI3基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平均出現(xiàn)明顯上調(diào)，除了進一步揭示GLI3基因表達與ICTEV的發(fā)生存在關系，還可以推斷ICTEV的發(fā)生可能與SHH-GLI信號通路失去原有的平衡狀態(tài)有關。

此外，為了進一步探討GLI3基因與ICTEV的相關性，本研究對維吾爾族、漢族ICTEV患兒以及維吾爾族、漢族正常兒童進行GLI3表達水平的比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，維吾爾族ICTEV患兒GLI3基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平上調(diào)程度均高于漢族ICTEV患兒，維吾爾族正常兒童和漢族正常兒童足部肌肉組織中GLI3基因表達水平無統(tǒng)計學差異，提示GLI3基因可能在不同民族間ICTEV發(fā)病率差異性方面發(fā)揮著重要作用；并且，維吾爾族可能更容易受GLI3上游信號通路或SHH-GLI3信號通路的影響，進而引起GLI3基因的異常表達。

綜上所述，GLI3基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平異常上調(diào)與ICTEV的發(fā)生存在一定的關系，并且維吾爾族兒童可能更易受GLI3基因異常表達的影響而出現(xiàn)ICTEV。此外，GLI3基因的突變可能是該基因參與ICTEV致病的一種機制。因此，仍然需要對GLI3基因的突變篩查做進一步研究，以便深入探討ICTEV的致病原因和新疆維吾爾族ICTEV高發(fā)的成因。

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Pathogenic relation between GLI3 expression and idiopathic congenital talipes equinovarus in Xinjiang Uygur nationality

CHENGGuojie,LYUFaming,WANGJing,AikebareAbudurexiti,DONGHaojie

(TheAffiliatedTraditionalChineseMedicineHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830000,China)

Objective To investigate the pathogenic relation between GLI3 expression and idiopathic congenital talipes equinovarus (ICTEV) in Xinjiang Uygur nationality. Methods Eighty-four cases of children with ICTEV (observation group, 51 cases of Uygur, 22 cases of Han) and 39 cases of children with normal foot trauma (control group, 25 cases of Uygur, 14 cases of Han) were chosen from Xinjiang. Real-time fluorescence quantitative PCR and Western blotting were used to analyze the mRNA and protein levels of GLI3 gene in the muscular tissues. Results The mRNA and protein levels of GLI3 were 0.61±0.02, 68.72±3.05 in the foot muscular tissues in the observation group, while they were 0.07±0.01 and 22.38±1.74 in the control group, which were significant different (allP<0.01). The mRNA and protein levels of GLI3 in the foot muscular tissues from Uygur children of the observation group were 0.73±0.01 and 83.01±4.42, while they were 0.40±0.02 and 56.85±3.50 in Han, which were statistically different (allP<0.05).There were no significant differences in GLI3 mRNA and protein expression levels between the Uygur and Han children in the control group (allP>0.05). Conclusion There is some correlation between GLI3 gene expression and ICTEV, and the Uygur nationality who is easily affected by expression level of GLI3 gene is easier to get ICTEV.

idiopathic congenital talipes equinovarus; GLI3 gene; Uygur nationality; Han nationality; pathogenic relation; Xinjiang; child

國家自然科學基金資助項目(81160215)。

程國杰(1973-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，副教授，主要研究方向為老年髖骨骨折圍手術期治療及肩部創(chuàng)傷中西醫(yī)結(jié)合治療。E-mail: 898649737@qq.com

簡介：呂發(fā)明(1957-)，男,主任醫(yī)師，教授，主要研究方向為慢性軟組織損傷的中西醫(yī)結(jié)合治療。E-mail: king-2032169@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.42.006

R682.1

A

1002-266X(2016)42-0021-03

2016-07-13)