熊果酸對人結腸癌HT—29細胞增殖抑制和誘導凋亡的研究

江華++++++張奕穎++++++尹素改++++++張小莉++++++馮黎++++++劉勝利++++++張秋萍

[摘要] 目的 探討熊果酸（UA）誘導人結腸癌細胞HT-29凋亡的作用機制。 方法 MTT法觀察UA對HT-29細胞增殖的抑制作用；熒光顯微鏡和流式細胞術觀察HT-29細胞的凋亡情況；Western blot檢測細胞色素c（cyt-c）、caspase-3及Livin蛋白的表達。 結果 UA對HT-29細胞具有明顯的的增殖抑制作用，并呈一定的濃度和時間依賴性；熒光顯微鏡觀察結果顯示，50 μmol/L的UA作用24 h后，較多細胞呈現(xiàn)出凋亡的特征性改變；流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)，UA可將HT-29細胞阻滯于G1期，隨著UA濃度的增高，細胞凋亡率也相應增加；Western blot結果顯示，UA作用24 h后，Livin蛋白和caspase-3酶原的表達逐漸降低，線粒體釋放的cyt-c逐漸增多，活化的caspase-3片段逐漸增加。 結論 UA對HT-29細胞具有明顯的增殖抑制作用，其機制可能與UA阻滯HT-29細胞的細胞周期、激活線粒體凋亡途徑以及下調(diào)凋亡抑制蛋白Livin的表達有關。

[關鍵詞] 熊果酸；人結腸癌細胞HT-29；凋亡

[中圖分類號] R735.3+5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）09（a）-0025-05

[Abstract] Objective To investigate the apoptosis-inducing mechanism of ursolic aicd （UA） in human colon cancer cell HT-29. Methods The inhibitory effect of UA on the growth of HT-29 cells was evaluated by MTT assay. Apoptosis was determined by fluorescence microscopy and flow cytometry. The expressions of apoptosis-associated proteins including cytochrome c （cyt-c）， caspase-3 and Livin were assessed by Western blot analysis. Results UA inhibited HT-29 cell proliferation in a time- and dose-dependent manner. Fluorescent microscope indicated characteristics of apoptosis present in cells after UA-treated （50 μmol/L， 24 h）. Flow cytometry showed that UA inhibited HT-29 in G1 phase， and the apoptosis rate of HT-29 cell exposured to UA increased， corresponding to the concentration of UA. The inceasing of the release of cyt-c from the mitochondria and the activated fragment of caspase-3 were detected by Western blot， while the expression of procaspase-3 and Livin was decreased gradually. Conclusion UA can inhibit the proliferation of HT-29 cells effectively in vitro. The mechanism of above-mentioned phenomena may be related with the arrest effect of UA in the cell cycle of HT-29， activated mitochondrial apoptotic pathway， and down-regulating the expression of Livin.

[Key words] Ursolic acid； Human colon cancer cell HT-29； Apoptosis

熊果酸（Ursolic acid，UA），又叫烏蘇酸、烏索酸，它在自然界中存在廣泛，是熊果、白花蛇舌草、烏梅等多種植物的主要活性成分，具有多種生物學活性，包括護肝[1]、抗炎[2-3]、抗血管生成[4]、降血糖[5]以及抗腫瘤[6-8]等作用?，F(xiàn)在人們?nèi)找嬷匾昒A的抗腫瘤作用，它可以抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移、減少腫瘤血管的生成、誘導腫瘤細胞的凋亡等，但UA通過何種途徑誘導腫瘤細胞的凋亡尚不完全清楚。本實驗研究了UA對HT-29細胞增殖和凋亡的影響，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人結腸癌細胞HT-29購自北京大學；UA、胰酶、四甲基偶氮唑藍（MTT）、DMSO、Hoechst33258和碘化丙啶（PI）染料均購自Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自HYCLONE公司；新生小牛血清購自杭州四季青有限公司；鼠抗人cyt-c單克隆抗體和鼠抗人caspase-3單克隆抗體均購自Neomarkers公司；鼠抗人Livin單克隆抗體購自Stratagene Corporation公司；Western blot試劑盒購自Kirkegaard Perry Laboratories公司；二氧化碳細胞培養(yǎng)箱為美國NUAIRE公司產(chǎn)品；熒光酶標儀為TECAN公司產(chǎn)品，型號：GENiOS VA200；流式細胞儀為BECKMAN產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 用含10%新生小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HT-29細胞，每2～3天傳代1次，用對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 MTT法檢測UA對HT-29細胞的增殖抑制情況 將HT-29細胞調(diào)節(jié)濃度至5×104個/mL，加入96孔培養(yǎng)板中，待其貼壁后加入UA，使終濃度分別為10、20、30、40、50 μmol/L，并設立不含UA（0 μmol/L）的對照組，每組設3個復孔，各組中DMSO的最終含量均為0.5%（V/V）。將96孔板放在培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12、24、36、48 h后加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，然后置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入DMSO 100 μL，震蕩混勻后用酶標儀在570 nm波長下檢測各孔的吸光值（OD值）。計算細胞增殖抑制率=[（對照組OD值-實驗組OD值）/對照組OD值]×100%。

1.2.3 熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況 將HT-29細胞接種于24孔培養(yǎng)板中，接種濃度為1.25×105個/mL，加入UA至終濃度為50 μmol/L，同時設立不含UA（0 μmol/L）的對照組。UA作用24 h后，0.25﹪胰酶消化，2000 r/min離心10 min收獲細胞，PBS洗滌，加入Hoechst 33258染液避光孵育10 min。離心棄上清，加入PI染液4℃孵育30 min，離心，PBS洗滌，滴片，用熒光顯微鏡進行觀察。

1.2.4 流式細胞術（FCM）檢測細胞周期和細胞凋亡率 分別以0、20、30、40、50 μmol/L的UA作用于HT-29細胞24 h，胰酶消化，離心棄上清，冷PBS洗2次，用預冷的70%乙醇4℃固定過夜。離心棄固定液，冷PBS洗2次，棄上清，加入RNA酶（1 mg/mL）240 μL，37℃水浴箱中放置30 min，加入PI染液避光染色30 min，流式細胞儀檢測。

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達 將HT-29細胞以5×106個/mL濃度培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中，加入UA使其終濃度分別為0、20、30、40、50 μmol/L作用24 h后，2000 r/min離心10 min，PBS洗滌，棄上液。分別加入100 μL蛋白裂解液裂解30 min，離心取上清，熒光酶標儀檢測蛋白濃度。各實驗組蛋白液與等體積上樣緩沖液混勻，煮沸3 min，以15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)印蛋白至硝酸纖維素膜。然后將其放在封閉液中封閉2 h，分別加入鼠抗人cyt-c單克隆抗體、鼠抗人caspase-3單克隆抗體和鼠抗人Livin單克隆抗體，4℃孵育2 h。TBS漂洗3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h。TBS漂洗3次，用Western blot蛋白質(zhì)印跡（ECL）檢測試劑盒檢測，并用圖像分析軟件分析蛋白條帶的光密度。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 UA對HT-29細胞的增殖抑制作用

MTT結果表明，UA對人結腸癌細胞HT-29具有增殖抑制作用，并呈現(xiàn)出明顯的劑量和時間依賴性（圖1）。直線回歸方程顯示，UA作用于HT-29細胞12、24、36、48 h，其IC50值分別為（52.73±1.50）、（43.23±1.94）、（37.39±1.69）、（32.04±1.16）μmol/L。

2.2 熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況

熒光顯微鏡觀察結果顯示，50 μmol/L的UA作用于HT-29細胞24 h后，許多細胞呈現(xiàn)出凋亡的特征性改變，HT-29細胞內(nèi)的染色質(zhì)分布不均勻，呈濃染的塊狀或顆粒狀；而0 μmol/L的UA作用24 h后，HT-29細胞內(nèi)的染色質(zhì)分布比較均勻，呈均勻彌散的藍白色熒光。壞死細胞呈紅色熒光（圖2，封三）。

2.3 流式細胞術（FCM）檢測細胞周期及細胞凋亡率情況

細胞經(jīng)不同濃度UA作用24 h后，隨著UA濃度的增加，G0/G1期細胞比例逐漸增高，S期細胞比例逐漸降低；流式細胞儀分析顯示，隨著UA濃度的增高，在G1期前出現(xiàn)亞二倍體峰（細胞凋亡峰）逐漸增高，與0 μmol/L UA比較，凋亡率差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。見表1、圖3。

2.4 Western blot檢測Livin、caspase-3、cyt-c蛋白表達情況

Western blot結果顯示，隨著UA濃度（0、20、30、40、50 μmol/L）的增加，Livin蛋白和caspase-3酶原蛋白表達逐漸降低，而從線粒體中釋放出來的cyt-c逐漸增多，活化后的caspase-3片段的表達也逐漸升高，與0 μmol/L UA比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見圖4。

3 討論

UA在自然界中分布較為廣泛，具有多種多樣的生物學效應，其突出作用是抗腫瘤，它對多種致癌物有抵抗作用，并且對多種惡性腫瘤細胞具有明顯的細胞毒作用、誘導分化以及抗血管生成作用。因此，人們越來越重視UA的抗癌防癌作用。

本試驗研究了UA對于人結腸癌HT-29細胞的作用，細胞增殖抑制實驗表明從30 μmol/L起，UA開始較顯著地抑制HT-29細胞的增殖作用，并呈濃度和時間依賴性。

PI只能透過壞死的細胞膜與細胞核結合，因此在紫外光激發(fā)下壞死細胞呈紅色。而Hoechst 33258屬于脂溶性染液，可以通過完整的細胞膜與靶細胞的細胞核結合，在紫外光的激發(fā)下會發(fā)出藍白色熒光。若細胞核染色均勻一致，呈彌散的藍白色熒光，則是活細胞；若細胞核染色不均勻，呈現(xiàn)出濃染的塊狀或顆粒狀，則是凋亡細胞。本試驗中采用Hoechst 33258和PI染色，通過熒光顯微鏡觀察HT-29細胞的凋亡現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)在50 μmol/L UA作用下，比較多的HT-29細胞呈現(xiàn)出凋亡的改變，其細胞內(nèi)染色質(zhì)分布不均勻，在熒光顯微鏡下可看到熒光斑點形成，而0 μmol/L的UA作用24 h后，HT-29細胞的細胞膜完整，染色質(zhì)分布均勻，呈彌散的藍白色熒光。在兩個濃度的UA作用下都可以觀察到表現(xiàn)為紅色熒光的壞死細胞。

通過FCM檢測發(fā)現(xiàn)，UA可以將HT-29細胞阻滯在細胞周期的G1期，具體表現(xiàn)為G0/G1期的細胞比例增加，而S期的細胞比例降低。隨著熊果酸濃度的增加，HT-29細胞的凋亡率也在逐漸升高，體現(xiàn)在HT-29細胞的凋亡峰逐漸增高。因此，UA對HT-29細胞的凋亡作用可能是通過影響HT-29細胞從G1期向S期轉(zhuǎn)變，從而將該腫瘤細胞阻滯在G1期，減少了HT-29細胞進入S期的數(shù)量，從而抑制了腫瘤細胞DNA的復制，并導致HT-29細胞凋亡。

研究表明，腫瘤的發(fā)生和失控性生長是細胞增殖和細胞凋亡兩個過程失衡的結果。參與細胞凋亡的通路有三條，線粒體通路[9]、死亡受體通路[10]和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路[11]，而線粒體通路中細胞色素c（cyt-c）是關鍵的分子。當細胞受到損傷后，cyt-c從線粒體中釋放出來，與凋亡活化因子1（Apaf-1）結合，并且激活caspase-9的前體，再進一步激活caspase-3，引發(fā)caspase的級聯(lián)反應，而caspase活化以后又可以促進靶細胞內(nèi)的線粒體釋放cyt-c，同時其降解底物后的產(chǎn)物可以引起線粒體通透性的改變從而導致靶細胞凋亡的發(fā)生[12-15]。

在細胞凋亡的過程中，天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶（caspase）發(fā)揮著很重要的作用。根據(jù)caspase在細胞凋亡中的作用和N-末端的長度，可以將其分成為兩大類：一類是起始型caspase（initiator caspase），如caspase-8、caspase-9，它們可以激活下游的caspase；另一類為效應型caspase（effector caspase），如caspase-3、caspase-6、caspase-7，它們可以直接降解靶細胞內(nèi)的相關功能蛋白，導致凋亡的發(fā)生。這些caspase都是以無活性的前體形式存在，需要相關的激活因子將其激活為活性形式后才能發(fā)揮作用[16]。

在機體內(nèi)還存在有抗凋亡基因和其相關表達產(chǎn)物，凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptosis protein，IAPs）就是其中一類，它對于調(diào)節(jié)細胞凋亡具有重要的作用[17]，某些IAPs成員的異常高表達可以導致細胞的凋亡過程受阻，其中，Livin是近些年來發(fā)現(xiàn)的人類IAP家族的新成員[18]，它與腫瘤的發(fā)生有著密切的關系[19-21]。研究證實，IAPs主要通過與特異性的caspase蛋白結合并抑制caspase蛋白的活性，從而阻斷凋亡的發(fā)生[22-23]。

本研究Western blot結果表明，UA作用24 h后，隨著藥物濃度的增加，15 kD處cyt-c的釋放增多，caspase-3酶原和Livin蛋白的表達降低，而活化后的caspase-3片段的表達逐漸增高。據(jù)此推測，UA有可能通過改變HT-29細胞內(nèi)線粒體膜的通透性，促進cyt-c的釋放，釋放出來的cyt-c進而導致caspase-3的活化。同時，UA還可以下調(diào)HT-29細胞內(nèi)Livin蛋白的表達，故UA有可能解除Livin蛋白對caspase-3的抑制作用。上述兩個過程均可以增強靶細胞內(nèi)caspase-3的活化作用，而活化的caspase-3可以作用于HT-29細胞質(zhì)中的相關細胞骨架蛋白，或者是作用于靶細胞內(nèi)的DNA酶，引起DNA的斷裂，從而導致HT-29細胞凋亡。

綜上所述，在體外UA可明顯抑制HT-29細胞增殖，并誘導其凋亡，它的作用機制可能是通過下調(diào)HT-29細胞內(nèi)Livin蛋白的表達，促進線粒體內(nèi)膜中的cyt-c釋放到胞漿中，繼而激活caspase-3，導致靶細胞的凋亡，其具體分子機制還有待進一步研究。

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