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    Vero細(xì)胞致腫瘤原性的研究

    2016-11-28 12:58:02李冰潔
    中外醫(yī)學(xué)研究 2016年28期
    關(guān)鍵詞:研究

    李冰潔

    【摘要】 目的:通過對(duì)生產(chǎn)疫苗所用的細(xì)胞系進(jìn)行的致腫瘤原性實(shí)驗(yàn),確定160代以內(nèi)的Vero細(xì)胞可安全用于生產(chǎn)。方法:用Vero細(xì)胞和Hela細(xì)胞接種裸鼠,觀察腫瘤的發(fā)生情況。結(jié)果:Vero細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組裸鼠注射部位、肺部組織、肝臟組織均未見腫瘤組織發(fā)生;Hela細(xì)胞對(duì)照組的10只裸鼠全部有腫塊形成,致癌致瘤率為10/10(100%)。結(jié)論:Vero細(xì)胞系非致瘤性細(xì)胞系,符合我國對(duì)疫苗生產(chǎn)所用細(xì)胞的要求,其在160代以內(nèi)可安全用于疫苗生產(chǎn)。

    【關(guān)鍵詞】 Vero細(xì)胞; Hela細(xì)胞; 腫瘤原性; 研究

    中圖分類號(hào) R73 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 B 文章編號(hào) 1674-6805(2016)28-0157-02

    作為生物制品研究與生產(chǎn)的重要原材料,傳代細(xì)胞系的株系特征,特別是其致腫瘤性,不僅直接影響到疫苗的質(zhì)量,而且關(guān)系到人畜的健康與安全,因此一直被生物制品研究與生產(chǎn)部門所重視。生產(chǎn)疫苗所用細(xì)胞系應(yīng)無外源因子污染,符合細(xì)胞遺傳學(xué)要求,尤其應(yīng)在生產(chǎn)所使用的細(xì)胞代次內(nèi)無致腫瘤性,這才能符合我國對(duì)疫苗生產(chǎn)所用細(xì)胞的要求。筆者在建立傳代Vero細(xì)胞種子庫與工作庫基礎(chǔ)上,對(duì)研制生產(chǎn)疫苗所用的Vero細(xì)胞系160代進(jìn)行了致腫瘤原性實(shí)驗(yàn),以確定160代以內(nèi)的Vero細(xì)胞可安全用于生產(chǎn)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    細(xì)胞株:非洲綠猴腎Vero細(xì)胞,160代(沈陽安迪生物高科技公司);人宮頸癌Hela細(xì)胞S-3株,13代(中國藥品生物制品檢定所細(xì)胞室);(2)裸鼠:Balb/C無胸腺雌性裸鼠20只,約4周齡(中國藥品生物制品檢定所動(dòng)物中心)。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞制備 Vero細(xì)胞160代,250 ml細(xì)胞瓶,Hela細(xì)胞

    13代4瓶,用胰酶消化,用無牛血清的Eagles MEM吹下、50 ml離心管1000 r/min,離心10 min,棄上清,加35 ml PBS重懸細(xì)胞沉淀,1000 r/min,離心10 min,棄上清,細(xì)胞沉淀用滅菌PBS洗1次,用1.5 ml PBS再洗1次,用1.5 ml PBS重懸細(xì)胞,取

    0.1 ml,100倍稀釋,細(xì)胞計(jì)數(shù),再將細(xì)胞濃度調(diào)到1.0×108/ml,Hela細(xì)胞為1.5 ml,Vero細(xì)胞為1.5 ml。

    1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,對(duì)照組每只裸鼠頸部皮下注射0.1 ml Hela細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)組每只裸鼠頸下皮下注射0.1 ml Vero細(xì)胞,細(xì)胞濃度均為1.0×108/ml,各注射10只;每周觀察記錄1次裸鼠狀態(tài)、體重及注射部位變化,觀察30 d,而后將裸鼠處死,解剖,用10%中性緩沖福爾馬林固定裸鼠肺、肝、頸部接種部位組織,石蠟包埋切片,常規(guī)蘇木精-伊紅染色,顯微鏡下觀察[1-2]。

    2 結(jié)果

    2.1 一般狀態(tài)

    2.1.1 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行7 d時(shí) 實(shí)驗(yàn)組裸鼠中有3只注射部位變紅,對(duì)照組裸鼠注射部位均出現(xiàn)直徑0.4~0.6 cm的結(jié)節(jié)。

    2.1.2 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行14 d時(shí) 實(shí)驗(yàn)組裸鼠均正常并有體重增加,對(duì)照組裸鼠注射部位均出現(xiàn)直徑1.0~1.5 cm的結(jié)節(jié),有2只結(jié)節(jié)中央有0.3~0.5 cm的潰瘍發(fā)生。

    2.1.3 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行21 d時(shí) 實(shí)驗(yàn)組裸鼠均正常并有體重增加,對(duì)照組裸鼠注射部位均出現(xiàn)直徑1.0~2.0 cm的結(jié)節(jié),其中2只裸鼠結(jié)節(jié)中央有0.5~0.8 cm的潰瘍發(fā)生,2只裸鼠死亡。

    2.1.4 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行30 d時(shí) 實(shí)驗(yàn)組裸鼠均正常并有體重增加,對(duì)照組裸鼠注射部位均出現(xiàn)1.0~2.0 cm的結(jié)節(jié),有2只結(jié)節(jié)中央有0.5~1.0 cm的潰瘍發(fā)生。

    2.2 病理變化

    通過顯微鏡病理切片檢查,實(shí)驗(yàn)組(注射Vero細(xì)胞)的10只裸鼠注射部位未見異常、狀態(tài)良好、體重有增加,皮下組織、肺部組織、肝臟組織的病理切片均未見腫瘤組織發(fā)生;對(duì)照組(注射Hela細(xì)胞)剩余的8只裸鼠注射部位均見腫瘤發(fā)生,肺部組織、肝臟組織均未見腫瘤組織發(fā)生(見圖1、圖2、圖3、圖4、圖5、圖6)。

    圖1 對(duì)照組頸部腫物的病理切片 圖2 實(shí)驗(yàn)組接種部位皮下組織病理

    切片

    注:圖1,Hela細(xì)胞接種裸鼠1個(gè)月頸部腫物的病理切片,未見腫瘤組織。圖2,Vero細(xì)胞接種裸鼠1個(gè)月接種部位皮下組織病理切片,未見腫瘤組織

    圖3 對(duì)照組肝臟組織病理切片 圖4 實(shí)驗(yàn)組肝臟組織病理切片

    注:圖3,Hela細(xì)胞接種裸鼠1個(gè)月肝臟組織病理切片,未見腫瘤組織。圖4,Vero細(xì)胞接種裸鼠1個(gè)月肝臟組織病理切片,未見腫瘤組織

    圖5 對(duì)照組肺部組織病理切片 圖6 實(shí)驗(yàn)組肺部組織病理切片

    注:圖5,Hela細(xì)胞接種裸鼠1個(gè)月肺部組織病理切片,未見腫瘤組織。圖6,Vero細(xì)胞接種裸鼠1個(gè)月肺部組織病理切片,未見腫瘤組織

    3 討論

    裸鼠先天性胸腺缺失,胸腺依賴性免疫功能缺乏,T或B淋巴細(xì)胞功能完全缺乏,異種移植時(shí)不產(chǎn)生排斥反應(yīng),所以國內(nèi)外許多學(xué)者多選用裸鼠作為異種動(dòng)物組織、細(xì)胞的移植和人類腫瘤異種動(dòng)物組織、細(xì)胞的移植和人類腫瘤異種移植的首選對(duì)象。

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Vero細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組的10只裸鼠注射部位肺、肝均未見腫瘤性病變,致癌致瘤率為零;Hela細(xì)胞對(duì)照組的10只裸鼠全部有腫塊形成,致癌致瘤率為10/10(100%)。Hela細(xì)胞對(duì)照組的裸鼠在注射部位均有直徑1~2 cm大小的腫瘤發(fā)生。腫瘤中央有0.5~1.0 cm的潰瘍發(fā)生,解剖內(nèi)臟,肺無明顯肉眼病變,肝臟有肉眼可見病變發(fā)生,肝腫大,表面有呈針尖大小多凸起病變發(fā)生,但除注射部位有惡性腫瘤發(fā)生外,肺及肝組織未見腫瘤性病變。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Vero細(xì)胞系非致瘤性細(xì)胞系,符合我國對(duì)疫苗生產(chǎn)所用細(xì)胞的要求,其在160代以內(nèi)可安全用于疫苗生產(chǎn)。所以,在采用Vero細(xì)胞進(jìn)行疫苗生產(chǎn)過程中,要保障產(chǎn)品的安全性[3],很有必要建立一個(gè)經(jīng)過檢定的、低代次的細(xì)胞種子庫,并且在可能的情況下,對(duì)更高代次的Vero細(xì)胞進(jìn)行檢定,以確保細(xì)胞種子庫的安全性及生產(chǎn)的需要。

    近年來,Vero細(xì)胞作為連續(xù)細(xì)胞系在我國越來越多地用于病毒性疫苗的生產(chǎn)[4],檢測(cè)方法也在不斷更新中[5],并且在發(fā)達(dá)國家病毒疫苗生產(chǎn)的主要工藝技術(shù)是Vero細(xì)胞的微載體固定化培養(yǎng),這也是目前我國致力于建立和完善的病毒疫苗生產(chǎn)技術(shù)[6]。隨著對(duì)疫苗質(zhì)量和安全性要求的不斷提高,用無血清培養(yǎng)基取代含血清培養(yǎng)基Vero細(xì)胞已成為病毒疫苗生產(chǎn)的一個(gè)重要發(fā)展趨勢(shì)[7],但商業(yè)化的Vero細(xì)胞無血清培養(yǎng)基還存在諸如培養(yǎng)基大多以液體的形式提供,價(jià)格昂貴等問題[8],這在很大程度上限制了Vero細(xì)胞無血清培養(yǎng)基在病毒疫苗生產(chǎn)中的實(shí)際應(yīng)用[9]。因此,用傳統(tǒng)的方法,開發(fā)更高代次的Vero細(xì)胞系仍是今后需要努力的方向。

    參考文獻(xiàn)

    [1]中華人民共和國衛(wèi)生部.中國生物制品規(guī)程[M].北京:中國人口出版社,1995:121.

    [2]施新.醫(yī)用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)[M].西安:陜西科學(xué)技術(shù)出版社,1989.

    [3]洪小栩,李琦涵.加強(qiáng)疫苗生產(chǎn)用Vero細(xì)胞控制的思考[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn),2012,13(5):323-326.

    [4]吳浩非飛,楊曉明.Vero細(xì)胞作為基質(zhì)的病毒性疫苗研制進(jìn)展[J].微生物學(xué)與免疫學(xué)進(jìn)展,2011,3(39):56-63.

    [5]李愛靈,王紅燕,張?jiān)绿m,等.Vero細(xì)胞傳代過程中致瘤性的檢測(cè)[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2011,31(5):456-461.

    [6] Bluml G.Microcarrier cell culture technology[M].Methods Biotechnol,2007,24:149-178.

    [7] Merten O W.Safety for vaccines[J].Cytotechnology,2000,34(3):181-183.

    [8] Ulmer J B,Valley U,Rappuoli R.Vaccine manufactueing:challenges and solutions[J].Nat Biotechnol,2006,24(11):1377-1383.

    [9]劉紅,陳天,李世崇,等.Vero細(xì)胞微載體培養(yǎng)的化學(xué)成分明確無血清培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2013,13(32):6210-6239.

    (收稿日期:2016-06-22)

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