二甲基亞砜對(duì)高糖刺激下大鼠腎小球系膜細(xì)胞的生長影響

劉　兵　王榮申　趙春貞　王曉紅　李萬忠.濰坊醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東濰坊　6053；.濰坊醫(yī)學(xué)院應(yīng)用藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，山東濰坊　6053

二甲基亞砜對(duì)高糖刺激下大鼠腎小球系膜細(xì)胞的生長影響

劉兵1王榮申1趙春貞2王曉紅1李萬忠1
1.濰坊醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東濰坊261053；2.濰坊醫(yī)學(xué)院應(yīng)用藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，山東濰坊261053

目的 初步探討二甲基亞砜（DMSO）對(duì)正常與高糖刺激下大鼠腎小球系膜細(xì)胞（RMCs）生長、形態(tài)的影響。方法 根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)基中葡萄糖含量及DMSO濃度的不同，采用成組設(shè)計(jì)方法隨機(jī)將細(xì)胞分為NG組（給予葡萄糖濃度為5.6 mmol/L低糖DMEM完全培養(yǎng)基）、MG組（給予甘露醇濃度為25 mmol/L DMEM完全培養(yǎng)基）、高糖組（HG，給予葡萄糖濃度為25 mmol/L DMEM完全培養(yǎng)基）、DMSO+NG組（給予含0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%DMSO的低糖DMEM培養(yǎng)基）、DMSO+HG組（給予含0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%DMSO的高糖DMEM培養(yǎng)基），以細(xì)胞存活率為考察指標(biāo)，采用MTT法檢測(cè)不同處理組細(xì)胞活力。 結(jié)果 與NG組比較，當(dāng)DMSO終濃度大于0.5%時(shí)，DMSO+NG組細(xì)胞形態(tài)改變，細(xì)胞活力有顯著性變化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與HG組比較，當(dāng)DMSO終濃度大于0.1%時(shí)，DMSO+HG組細(xì)胞形態(tài)改變，細(xì)胞活力發(fā)生極顯著性變化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在0.5%~2.5%濃度范圍內(nèi)，DMSO+NG組與含相同體積的DMSO+HG組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。DMSO對(duì)正常生長環(huán)境下細(xì)胞的半數(shù)抑制率為2.402%，對(duì)高糖刺激條件下細(xì)胞的半數(shù)抑制率為2.114%。結(jié)論基于DMSO對(duì)高糖刺激下大鼠RMCs細(xì)胞影響更為敏感，可為DMSO作溶劑進(jìn)行同類體外活性篩選提供一定參考。

二甲基亞砜；腎小球系膜細(xì)胞；M TT法；高糖

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是一種重要篩選手段，可以直接觀察活細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)與生命活動(dòng)，廣泛用于藥物體外活性篩選。中藥提取物成分復(fù)雜，理化性質(zhì)存在差異，某些成分水溶性較差，一定程度上影響體外評(píng)價(jià)。二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）作為難溶性藥物助溶劑與細(xì)胞冷凍保護(hù)劑[1-3]，能夠解決水溶性差化學(xué)成分的溶解問題；DMSO同時(shí)對(duì)細(xì)胞生長產(chǎn)生一定影響，量效關(guān)系隨細(xì)胞種類或細(xì)胞生長環(huán)境產(chǎn)生不同影響[4-6]。本研究不同濃度DMSO對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞及高糖刺激下大鼠腎小球系膜細(xì)胞生長影響，旨在尋找合適DMSO濃度范圍，降低DMSO對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞（Rats'renal mesangial cells，RMCs）生長影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性與可靠性。

1　材料與方法

1.1材料

大鼠RMCs購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2試劑

DMEM（低糖）培養(yǎng)基（美國 Hyclone公司）、DMEM（高糖）培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）、青鏈霉素混合液（100X）（北京Solarbio科技有限公司）、葡萄糖（上海源葉生物科技有限公司）、甘露醇（上海源葉生物科技有限公司）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）（北京Solarbio科技有限公司）、二甲基亞砜（DMSO）（北京Solarbio科技有限公司）、0.25%胰蛋白酶-EDTA（北京Solarbio科技有限公司）、“四季青”胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）。

1.3儀器

潔凈工作臺(tái)（SW-OJ-2F，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、二氧化碳培養(yǎng)箱（0812K2073CE，力康發(fā)展有限公司）、低速離心機(jī)（22331Hamburg，德國Eppendorf AG）、倒置顯微鏡（ECLIPSE TS100-F，日本Nikon公司）、高壓蒸汽滅菌器 （MLS-3750，日本SANYO公司）、HW-200S離體腸管恒溫裝置 （HW-200S，成都泰盟科技有限公司）、Haier超低溫保存箱、實(shí)驗(yàn)室超純水器（UPT-I-100L，成都優(yōu)普電子產(chǎn)品有限公司）、多功能讀板機(jī)（SpectraMax M5，美國Molecular Devices公司）。

1.4方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng)RMCs培養(yǎng)于含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液中，青鏈霉素混合液濃度為100 U/mL，于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育，次日顯微鏡下觀察，1～2 d更換培養(yǎng)液。

1.4.2細(xì)胞分組根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)基中含有的葡萄糖的濃度以及DMSO體積分?jǐn)?shù)的不同，根據(jù)成組設(shè)計(jì)原理，隨機(jī)將細(xì)胞分為 NG組、MG組、高糖組（HG）、DMSO+正常組（DMSO+NG）、DMSO+高糖組（DMSO+ HG），具體分組如下。

NG組：給予低糖DMEM培養(yǎng)基，葡萄糖濃度為5.6 mmol/L；

MG組：給予含25 mmol/L甘露醇培養(yǎng)基；

HG組：給予高糖DMEM培養(yǎng)基，葡萄糖濃度為25 mmol/L；

DMSO+NG組：給予含不同體積分?jǐn)?shù)DMSO的低糖DMEM培養(yǎng)基（體積分?jǐn)?shù)分別為0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%）；

DMSO+HG組：給予含不同體積分?jǐn)?shù)DMSO的高糖DMEM培養(yǎng)基（體積分?jǐn)?shù)分別為0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%）。

1.4.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力顯微鏡下觀察細(xì)胞，細(xì)胞融合面積達(dá)80%左右時(shí)，移去培養(yǎng)液，PBS清洗，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，1000 r/min離心3 min，加入適量培養(yǎng)基混懸細(xì)胞。計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，培養(yǎng)基稀釋制成密度為5×104個(gè)/mL細(xì)胞混懸液，接種于96孔板，每孔100μL，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。次日更換為無血清培養(yǎng)基同步24 h，按照“1.4.2”項(xiàng)下方法給予細(xì)胞不同處理，每組5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)箱孵育24 h。每孔加入100μL 0.5 mg/m L MTT溶液，培養(yǎng)箱中孵育4 h，每孔加入100μL DMSO溶液，培養(yǎng)箱孵育15 min，震蕩10 min，酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定每孔吸光度，重復(fù)3次，取均值。按公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組×100%

1.4.4細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察大鼠RMCs細(xì)胞按照上述分組處理24 h后，于倒置顯微鏡下觀察各個(gè)分組的細(xì)胞形態(tài)。

1.4.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

大鼠RMCs細(xì)胞貼壁后，呈梭形、不規(guī)則或星形，有數(shù)個(gè)長短不一的突起，密集生長時(shí)，出現(xiàn)重疊現(xiàn)象，細(xì)胞團(tuán)簇之間形成網(wǎng)絡(luò)（圖1a，見封三）與NG組相比，MG組細(xì)胞形態(tài)基本沒有改變，數(shù)量有所增加，但不明顯（圖1b，見封三）；HG組細(xì)胞數(shù)量明顯增加，主要呈梭形，細(xì)胞肥大，細(xì)胞間重疊現(xiàn)象更明顯，細(xì)胞邊緣不清晰（圖1c，見封三）。

與NG組相比，DMSO+NG組0.1%、0.5%細(xì)胞形態(tài)基本未發(fā)生改變，細(xì)胞數(shù)量有所減少（圖2a、b，見封三）；隨著DMSO體積分?jǐn)?shù)的不斷增大，細(xì)胞數(shù)量不斷減少，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，胞質(zhì)聚攏，突起收縮，由梭形改變?yōu)闄E圓形，最后呈圓形，由初始的貼壁狀態(tài)，最終呈漂浮狀態(tài)（圖2c、d、e、f、g、h，見封三）。

與HG組相比，DMSO+HG組0.1%組細(xì)胞基本沒有變化（圖3a，見封三），；隨DMSO體積分?jǐn)?shù)的增加，細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)發(fā)生顯著變化，細(xì)胞逐漸分散，圓形、漂浮細(xì)胞數(shù)量不斷增加（圖3b、c、d、e、f、g、h，見封三）。

2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

由表1可知，與NG組比較，HG組和MG組均能促進(jìn)RMCs的增殖，HG組有顯著性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明高糖對(duì)RMCs細(xì)胞造成一定損傷，且促進(jìn)作用是非滲透壓造成的。其次，隨著DMSO體積分?jǐn)?shù)的不斷增加，細(xì)胞的OD值不斷降低，活細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。與NG組比較，當(dāng)DMSO終濃度低于0.5%時(shí)，DMSO+NG組細(xì)胞正常生長且形態(tài)完整，細(xì)胞活力無顯著性變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；當(dāng)DMSO濃度大于0.5%時(shí)，DMSO+NG組細(xì)胞形態(tài)改變，細(xì)胞活力有顯著性變化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與HG組比較，當(dāng)DMSO濃度低于0.1%時(shí)，DMSO+HG組細(xì)胞形態(tài)與活力無顯著性變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；當(dāng)DMSO終濃度大于0.1%時(shí)，DMSO+HG組細(xì)胞形態(tài)改變，細(xì)胞活力發(fā)生極顯著性變化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且隨DMSO濃度的增加細(xì)胞存活率不斷降低。當(dāng)DMSO濃度在0.5%范圍內(nèi)，DMSO+NG組與含相同體積的DMSO+HG組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。利用Excel 2010中FORECAST函數(shù)分別以DMSO+NG組和DMSO+HG組中DMSO濃度為因變量，細(xì)胞存活率為自變量，可知IC50正=2.402%，IC50高=2.114%。

表1　不同處理組對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞存活率的影響（n=3，）

表1　不同處理組對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞存活率的影響（n=3，）

注：與NG組比較，*P＜0.05，#P＜0.01；與HG組比較，▲P＜0.01；與等量DMSO+HG組比較，△P＜0.01

分組　濃度（%）　OD值　存活率（%）NG組MG組HG組DMSO+NG組DMSO+HG組0.1 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 0.1 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 0.464±0.041 0.470±0.030 0.517±0.021*0.452±0.027 0.434±0.033 0.394±0.047#0.354±0.024#0.256±0.037#0.227±0.030#0.171±0.007#0.151±0.022#0.507±0.054 0.406±0.045▲0.375±0.051▲0.315±0.041▲0.241±0.022▲0.196±0.024▲0.204±0.018▲0.141±0.016▲100 -100 97.41 93.66△85.04△76.28△55.23△48.99△36.96 32.56 98.18 78.55 72.67 60.98 46.61 39.57 32.95 27.29

隨著DMSO濃度的不斷增加，大鼠RMCs細(xì)胞存活率逐漸降低。在DMSO濃度大于0.1%時(shí)，高糖刺激下的大鼠RMCs細(xì)胞的存活率低于相同DMSO濃度下正常細(xì)胞的存活率。見圖4。

圖4　不同濃度DMSO對(duì)正常大鼠RMCs與高糖刺激下大鼠RMCs細(xì)胞存活率影響

3　討論

DMSO是一種重要的非質(zhì)子極性溶劑，既能溶于有機(jī)溶劑又能溶于水。在細(xì)胞領(lǐng)域中，DMSO作為藥物的媒介，有助于藥物穿透細(xì)胞膜，是一種良好的滲透增強(qiáng)劑[7-11]。但DMSO在不同條件下超過臨界濃度對(duì)細(xì)胞有一定損傷，且不同細(xì)胞對(duì)其敏感性也不同。研究發(fā)現(xiàn)，DMSO在4℃環(huán)境中對(duì)細(xì)胞的毒性作用比在室溫時(shí)小[12]。此外，DMSO終濃度低于2.0%時(shí)，對(duì)PC12細(xì)胞形態(tài)和活力無顯著影響，大于4.0%時(shí)呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性。對(duì)人骨髓細(xì)胞而言，10%DMSO作為低溫保護(hù)劑時(shí)毒性作用較小，5.0%和20.0%DMSO使骨髓細(xì)胞中α-萘酚酯酶（ANAE）、過氧化物酶（POX）活性以及糖原含量顯著下降，嚴(yán)重影響細(xì)胞功能[13]。本實(shí)驗(yàn)研究表明，不同濃度DMSO對(duì)相同條件下RMCs細(xì)胞影響存在差異，隨著DMSO濃度的不斷增加，RMCs細(xì)胞的活力不斷降低；DMSO對(duì)不同條件下RMCs細(xì)胞存在不同影響，當(dāng)DMSO終濃度在0.1%時(shí)，DMSO使高糖刺激下大鼠RMCs細(xì)胞活力顯著降低，形態(tài)發(fā)生改變，但對(duì)正常條件下大鼠RMCs細(xì)胞的活力及形態(tài)無顯著性影響。因此，DMSO對(duì)細(xì)胞影響不能從一種細(xì)胞生長環(huán)境外推到另一種生長環(huán)境，也不能從一種細(xì)胞結(jié)果推廣至另一種細(xì)胞。

基于DMSO對(duì)不同條件下RMCs細(xì)胞及不同種類細(xì)胞的影響，體外細(xì)胞篩選設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)充分考慮所用溶劑濃度，最大限度減少或避免對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)濃度的DMSO對(duì)高糖刺激下大鼠RMCs細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用，為今后2型糖尿病的治療提供了一種思路[14]，但至于其具體作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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Effects of Dimethyl Sulfoxide on grow th in rats'renal m esangial cells induced by high glucose medium

LIU Bing1WANG Rongshen1ZHAO Chunzhen2WANG Xiaohong1LI Wanzhong1
1.College of Pharmacy,Weifang Medical University,Shandong Province,Weifang 261053,China;2.Applied Pharmacology Laboratory,Weifang Medical University,Shandong Province,Weifang 261053,China

Objective To investigate the effects of dimethyl sulfoxide(DMSO)on growth and morphology in rats'renal mesangial cells(RMCs)in high glucose and normal medium.M ethods According to the concentration of glucose and DMSO in the cell culture medium and using the method of group design,the cells were random ly divided into NG group(the concentration of glucose was 5.6 mmol/L),MG group(the concentration of mannitol was 25 mmol/L),high glucose group(HG,the concentration of glucose was 25 mmol/L),DMSO and NG group(the concentration of DMSO was 0.1%,0.5%,1%,1.5%,2.0%,2.5%,3.0%and 3.5%in the normal group)and DMSO and HG group(the concentration of DMSO was 0.1%,0.5%,1.0%,1.5%,2.0%,2.5%,3.0%and 3.5%in the high glucose group).Cell viability was selected as evaluation index and carried out with colorimetric assay with MTT.Results Compared with NG group,when the DMSO concentration was higher than 0.5%,the morphous of DMSO and NG group cells changed and the cell viability had statistical difference(P<0.01）.Compared with HG group,when the DMSO concentration was higher than 0.1%,the morphous of DMSO and HG group cells changed and the cell viability had statistical difference(P<0.01). DMSO and HG group had significant difference compared with DMSO and NG group,which had same concentration of DMSO,when the concentration of DMSO was changed between 0.5%and 2.5%(P<0.01).The half of the inhibition of DMSO for normal cells was 2.402%,and for cells induced by high glucose medium was 2.114%.Conclusion Based on the fact that the cells induced by high glucose medium were more sensitive,it can provide reference for DMSO as a solvent mediator to the similar activity screening in vitro.

Dimethylsulfoxide;Renal mesangial cells; MTT assay;High glucose

R962

A

1673-7210（2016）04（b）-0014-04

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81274049）；山東省中醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（2015－231）；山東省高等學(xué)校科技計(jì)劃項(xiàng)目（J15LK11）。

劉兵（1990.7-），男，濰坊醫(yī)學(xué)院2013級(jí)藥劑學(xué)專業(yè)在讀碩士研究生；研究方向：中藥及天然產(chǎn)物。

李萬忠（1970.7-），男，博士，副教授；研究方向：中藥及天然產(chǎn)物。

（2015-12-16 本文編輯：趙魯楓）