基于化學(xué)指紋圖譜的茶樹(shù)新品系麗早香識(shí)別研究

潘建義，成 浩，王麗鴛，馬軍輝， 陳香云

(1.浙江省麗水市農(nóng)業(yè)局 農(nóng)作物站， 浙江 麗水323000； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所/國(guó)家茶樹(shù)改良中心，浙江 杭州 310008； 3.江蘇省南京市高淳區(qū)林業(yè)工作站，江蘇 南京211300)

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基于化學(xué)指紋圖譜的茶樹(shù)新品系麗早香識(shí)別研究

潘建義1，成 浩2，*，王麗鴛2，馬軍輝1， 陳香云3

(1.浙江省麗水市農(nóng)業(yè)局 農(nóng)作物站， 浙江 麗水323000； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所/國(guó)家茶樹(shù)改良中心，浙江 杭州 310008； 3.江蘇省南京市高淳區(qū)林業(yè)工作站，江蘇 南京211300)

化學(xué)指紋圖譜技術(shù)應(yīng)用于茶樹(shù)研究可用于其身份、產(chǎn)地的判別。茶樹(shù)品種間差異鑒別是申請(qǐng)農(nóng)作物新品種審定的重要內(nèi)容，試驗(yàn)利用HPLC檢測(cè)分析麗早香、龍井43、迎霜和當(dāng)?shù)厝后w的化學(xué)組成及比例，構(gòu)建化學(xué)指紋圖譜，從而區(qū)分麗早香品系。通過(guò)HPLC測(cè)定樣品色譜數(shù)據(jù)，選擇90%以上樣品中存在的峰為樣本集的共有峰，建立數(shù)字化多元化學(xué)指紋圖譜。麗早香在圖譜相似性上與當(dāng)?shù)厝后w最高；在兒茶素、咖啡堿、沒(méi)食子酸等茶葉主要化學(xué)組成比例上，與對(duì)照不同，可以與龍井43、迎霜、當(dāng)?shù)厝后w辨別區(qū)分，為茶樹(shù)品種間差異鑒別和申請(qǐng)植物新品種保護(hù)提供借鑒。

茶樹(shù)；麗早香；化學(xué)指紋圖譜；識(shí)別分析

化學(xué)指紋圖譜技術(shù)在中藥等領(lǐng)域用于評(píng)價(jià)材料品質(zhì)、道地性、產(chǎn)地等已有許多成功的應(yīng)用案例[1-3]。近年來(lái)，該技術(shù)在茶樹(shù)上應(yīng)用研究并用于身份、產(chǎn)地判別已經(jīng)有相關(guān)報(bào)道[4-11]。麗早香是浙江麗水市選育出來(lái)的早生茶樹(shù)新品系，其早生優(yōu)質(zhì)特別適制螺形顯毫名茶(如金獎(jiǎng)惠明、蘇州碧螺春、南京雨花茶)和扁形名茶、半烘炒香茶等名優(yōu)綠茶和工夫紅茶，該品系多適制性在生產(chǎn)上給茶農(nóng)帶來(lái)良好經(jīng)濟(jì)效益而為茶農(nóng)迅速接受，具有較大開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。本文運(yùn)用HPLC建立多元化學(xué)指紋圖譜，并結(jié)合判別技術(shù)，明確麗早香與其他品種特別是主栽品種的差異， 為茶樹(shù)品種間差異鑒別提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)采用干茶樣本材料76個(gè)，由浙江省麗水市蓮都區(qū)、景寧縣、遂昌縣、松陽(yáng)縣、縉云縣等地的13個(gè)茶場(chǎng)(廠)以扁型茶制作工藝加工制作，原料品種除了麗早香(LZX)外，以本地主栽品種龍井43(LJ)、迎霜(YS)和當(dāng)?shù)伉F坑群體種(QT)作為對(duì)照；鮮葉采樣標(biāo)準(zhǔn)為春季第一輪新梢的一芽一葉相同品種隨機(jī)采樣；茶樣制作完成后冷藏干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與試劑

Agilent 1100高效液相色譜儀(Agilent 公司，含四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器)；DK-S24 型電熱恒溫水浴鍋(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；表沒(méi)食子酸兒茶素( EGC，純度>99%) 、兒茶素( C，純度>99%) 、表兒茶素(EC，純度>99%)、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG，純度>99%)、表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG，純度>99%)、咖啡堿(Caffeine，純度>99%)、沒(méi)食子酸(GA)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；色譜乙腈(德國(guó)Merck公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品提取方法

參考王麗鴛等[5-6]方法，干茶樣粉碎后，精密稱(chēng)取3 g，50%乙醇室溫浸提15 min，過(guò)濾，濾渣洗滌3次后合并濾液，用容量瓶定容至100 mL[12]，過(guò)0.22 μm濾膜，所得濾液用于HPLC分析。

1.3.2 HPLC方法

Phenomenex C12色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；色譜條件：(1)A相為1%甲酸；B相為乙腈；梯度從4% B到25% B，流速1 mL·min-1，60 min，檢測(cè)波長(zhǎng) 280 nm；(2)A相為1%甲酸；B相為乙腈；梯度從10% B到30%B，流速1 mL·min-1，60 min。柱溫40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)365 nm[6]。

1.3.3 指紋圖譜的建立

獲得色譜圖后，每個(gè)樣本的2個(gè)色譜圖分別以峰面積相對(duì)最大之主峰為參照，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積；各峰按相對(duì)保留時(shí)間一一匹配后，選擇90%以上樣品中存在的峰為樣本集的共有峰，按多元信息融合原理將兩色譜圖以串行方式進(jìn)行像素級(jí)融合，最后選擇41個(gè)色譜峰數(shù)據(jù)建立起各樣本的數(shù)字化多元化學(xué)指紋圖譜[5-6,12]。

1.3.4 組成比例、模式圖譜與相似度計(jì)算

樣本材料按品種分為4組，求取同組樣本的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，Excel作圖分析。用同組樣本的平均值構(gòu)建該組樣本的模式圖譜；利用SPSS軟件，采用向量夾角法測(cè)算樣本與模式圖譜間或樣本間的相似度[5-6,12]。

1.3.5 品種間差異與判別分析

每組樣本以每隔3個(gè)樣本留1個(gè)的方法留出驗(yàn)證樣本，其余作為訓(xùn)練樣本，進(jìn)行品種差異與判別研究。利用SPSS軟件，根據(jù)統(tǒng)計(jì)量Wilksλ最小值原則選擇變量，進(jìn)行逐步判別分析并建立判別方程；接著通過(guò)訓(xùn)練樣本的回代判別并計(jì)算回代錯(cuò)判率，將每一樣本逐一從訓(xùn)練集中去掉，再用同樣方法判別分析，進(jìn)行內(nèi)部交叉驗(yàn)證分析，驗(yàn)證所建立方程的穩(wěn)定性。最終利用外部驗(yàn)證樣本驗(yàn)證判別方程的判別效果[4]，并采用判別方程數(shù)據(jù)作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本色譜間的相似度

將各樣本按品種分組后，計(jì)算出各品種的平均色譜數(shù)據(jù)，然后利用SPSS軟件以向量夾角法計(jì)算出各樣本與各品種平均色譜間的相似度，分析相關(guān)數(shù)據(jù)，可以看到絕大部分樣本都和其本身所屬的品種平均色譜間的相似度最高，經(jīng)數(shù)據(jù)分析剔除2個(gè)異常樣本后，各品種平均色譜的峰面積和相對(duì)峰面積見(jiàn)表1。按同樣原理，計(jì)算出各品種平均色譜之間的相似度見(jiàn)表2。從表中可以看出，4個(gè)品種材料間相似度最高的是麗早香和當(dāng)?shù)伉F坑群體種，其次是龍井43和當(dāng)?shù)伉F坑群體種，相似度最低的是龍井43和迎霜。

表1 各茶樹(shù)品種平均色譜的峰面積和相對(duì)峰面積

Table 1 Average chromatographic peak area and relative peak area of each tea variety

峰編號(hào)PeakNo.LJPARA/%QTPARA/%YSPARA/%LZXPARA/%X1234.582.8297.563.2346.293.0189.142.2GA1060.9712.7937.019.81034.078.6571.307.5X31509.3218.11328.7013.91526.6712.71272.1416.2X4215.532.7388.374.0398.193.3433.395.1EGC220.762.6184.191.9210.951.7186.292.4X7292.483.5257.192.8297.322.5214.632.7C266.393.2213.812.2213.171.8204.642.7X91168.8314.01456.5115.61090.449.1753.039.7caf7883.6294.68163.4785.18601.4671.57608.1095.8X12162.442.0237.372.4312.522.6157.091.9EC717.058.6544.415.7541.314.5687.119.1EGCG8366.95100.09710.87100.012108.66100.08256.62100.0X15482.495.8406.734.2246.272.0277.113.7GCG427.395.2285.823.0388.493.2323.224.2X171866.0122.31349.0314.32663.7922.91245.6115.1X18481.355.7579.546.2455.153.8205.852.6X21961.9811.2210.112.3202.601.7405.385.2X22368.484.4318.793.4263.632.2327.544.2ECG5486.3065.74187.3243.93157.6526.14862.9762.3X31247.1535.6206.8637.8115.7030.5193.3552.4X3270.9810.5107.6419.185.5822.2118.2733.9X33163.1723.1170.6030.744.6511.395.9124.4X34153.9423.5268.3148.7346.1591.3248.6071.4X35288.2542.8371.5973.7330.5691.4251.0874.5X36698.56100.0540.65100.0367.68100.0386.70100.0X37231.7833.9230.6742.057.8115.2183.0150.7X3842.147.1113.4820.866.7717.8145.4745.0X39252.1238.6420.8278.1847.71227.0486.42145.3X40321.8346.8253.4046.8154.0641.1293.4982.4X4131.655.276.2113.783.6422.2141.8744.9

LJ，龍井43；QT，當(dāng)?shù)伉F坑群體種；YS，迎霜；LZX，麗早香；PA，峰面積；RA，相對(duì)面積。

LJ， Longjing 43; QT， Jiukeng; YS， Yingshuang; LZX， Lizaoxiang; PA， Peak area; RA， Relative area.

表2 各茶樹(shù)品種平均色譜間的相似度

Table 2 The degree of similarity between average chromatographic data of each tea variety

品種VarietyLJQTYSLZXLJ1.0000.9490.7190.851QT1.0000.8710.952YS1.0000.930LZX1.000

LJ，龍井43；QT，當(dāng)?shù)伉F坑群體種；YS，迎霜；LZX，麗早香。

LJ， Longjing 43; QT， Jiukeng; YS， Yingshuang; LZX， Lizaoxiang.

2.2 生化組成與比例

圖1所示的是各品種的兒茶素單體含量，以及它們的沒(méi)食子酸和咖啡堿含量。從圖中可以看出，各品種之間相差較大的主要是EGCG和ECG等酯型兒茶素成分含量，其中迎霜的EGCG含量較高，同時(shí)ECG含量相對(duì)較低。而麗早香的兩種酯型兒茶素含量均與龍井43在一個(gè)等級(jí)上，EGCG低于迎霜，而ECG高于迎霜。

LJ，龍井43；QT，當(dāng)?shù)伉F坑群體種；YS，迎霜；LZX，麗早香LJ，Longjing 43； QT，Qunti； YS: Yingshuang； LZX，Lizaoxiang圖1 各茶樹(shù)品種的兒茶素單體、沒(méi)食子酸和咖啡堿含量Fig.1 The contents of catechin monomer， garlic acid and caffeine of each tea variety

圖2所示的是4個(gè)品種的兒茶素單體、沒(méi)食子酸和咖啡堿構(gòu)成比例。從圖中可以看出，組成比例最為穩(wěn)定的成分是咖啡堿，不論哪個(gè)品種都是34%左右。組成比例變化最大的是EGCG，其幅度為35%～47%。而麗早香各成分組成比例與龍井43比較相似，與迎霜相差較大。

2.3 各茶樹(shù)品種模式圖譜的建立

將2個(gè)色譜圖按信息融合原則進(jìn)行合并后，計(jì)算出相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，按相對(duì)保留時(shí)間對(duì)每個(gè)樣本的色譜峰進(jìn)行一一匹配后，選擇90%以上樣本共有的峰為樣本集共有峰，并去除相對(duì)峰面積過(guò)小的峰，最終得到每個(gè)樣本的化學(xué)指紋圖譜并通過(guò)求取平均構(gòu)建各組樣本的模式圖譜如圖3。從這些模式圖譜中可以比較形象直觀地看出各個(gè)不同品種在生化組成方面的差異。

LJ，龍井43；QT，當(dāng)?shù)伉F坑群體種；YS，迎霜；LZX，麗早香LJ， Longjing 43; QT， Jiukeng; YS， Yingshuang; LZX， Lizaoxiang圖2 各茶樹(shù)品種兒茶素單體、沒(méi)食子酸和咖啡堿比例Fig.2 The proportion of catechin monomer， garlic acid and caffeine of each tea variety

圖3 各茶樹(shù)品種的模式圖譜比較Fig.3 Fingerprint pattern of each tea variety

2.4 品種差異的判別

采用各品種組選出的訓(xùn)練集樣本，利用SPSS軟件計(jì)算進(jìn)行逐步判別分析，根據(jù)計(jì)算得出的非標(biāo)準(zhǔn)化判別方程系數(shù)，得到判別方程組，包含3個(gè)判別方程，它們的變量和各項(xiàng)系數(shù)見(jiàn)表3。判別函數(shù)F1、F2和F3的特征值分別為96.46、35.81和16.33，典型相關(guān)系數(shù)分別為0.995、0.986和0.971，對(duì)判別結(jié)果的方差分析表明，類(lèi)間差異明顯(P<0.0001)，即判別結(jié)果有效。

將57個(gè)訓(xùn)練集樣本再逐一代入判別方程，所有的樣本都成功地判別為其正確的品種，回判成功率為100%。再將每一樣本逐一從訓(xùn)練集中去掉后，重新建立判別方程組并做判別分析，進(jìn)行內(nèi)部交叉驗(yàn)證分析，用于驗(yàn)證建立的方程組的穩(wěn)定性，所有樣本的內(nèi)部交叉驗(yàn)證都成立，其正確率同樣是100%。最后將17個(gè)外部驗(yàn)證樣本逐一代入進(jìn)行判別分析，只有一個(gè)麗早香的樣本被錯(cuò)判為當(dāng)?shù)伉F坑群體種，正確判別率為94.1%。分析錯(cuò)誤原因，主要是麗早香的有效樣本數(shù)量只有8個(gè)，數(shù)量太少，因此它的訓(xùn)練集還沒(méi)能完全綜合出這個(gè)品種的特性。

訓(xùn)練集和驗(yàn)證集樣本的判別結(jié)果和判別函數(shù)X3、X9、EC……X41分別代表不同相對(duì)保留時(shí)間色譜峰的相對(duì)峰面積。

表3 逐步判別分析得到的判別方程式組的各項(xiàng)系數(shù)

Table 3 The coefficient of discriminant equation group by Stepwise discriminant analysis

自變量Independentvariable系數(shù)Coefficient方程式1Formula1方程式2Formula2方程式3Formula3常數(shù)項(xiàng)-23.24-5.074.99X327.9117.53-24.62X9-19.2716.0052.79EC135.8380.0027.06X18-48.48-65.18-30.10ECG7.60-9.23-24.00X3114.29-0.36-8.29X32-21.71-14.8219.60X37-20.43-3.28-1.86X3854.1325.2536.48X39-4.906.43-4.17X4029.69-10.418.35X41-14.713.17-24.00

X3，X9，EC……X41 represents the relative peak area at different relative retention time， respectively.

得分見(jiàn)表3，為更直觀體現(xiàn)判別分析的結(jié)果，將3個(gè)判別函數(shù)的得分值兩兩作圖(圖4)，從圖4可以看出，判別分類(lèi)的效果很好，不同的品種都分布在不同的區(qū)域，相互間的界限明顯，只有被錯(cuò)判的那個(gè)麗早香樣本的位置與其他麗早香樣本較遠(yuǎn)。

圖4 判別函數(shù)得分值的分布圖Fig.4 The layout of score values of discriminant function

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，從兒茶素單體組成來(lái)看，麗早香與龍井43比較接近，但從整個(gè)化學(xué)指紋圖譜的相似性來(lái)看，麗早香與當(dāng)?shù)伉F坑群體種的相似度更高，與生產(chǎn)實(shí)踐中反映的麗早香感官品質(zhì)色香味形及適制性與當(dāng)?shù)伉F坑群體相當(dāng)這一現(xiàn)象一致。從化學(xué)指紋圖譜模式圖上，可以清楚地看出麗早香與龍井43、當(dāng)?shù)伉F坑群體種和迎霜在主要生化組成與比例上不同。通過(guò)判別分析，可以將麗早香與其他3個(gè)品種的樣本很好地辨別區(qū)分。

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(責(zé)任編輯 張 韻)

Identification and characterization of new tea line Lizaoxiang based on chemical fingerprint

PAN Jian-yi1， CHENG Hao2，*， WANG Li-yuan2， MA Jun-hui1， CHEN Xiang-yun3

(1.CropWorkstationofAgricultureBureauofLishui，Lishui323000，China; 2.TeaResearchInstituteofChineseAcademyofAgriculturalSciences，NationalCenterforTeaImprovement，Hangzhou310008，China; 3.ForestWorkstationofGaochunDistrictofNanjing，Jiangsu，Nanjing211300，China)

Chemical fingerprint technology has widely been implicated for discriminating the identity and origin of tea plant. Difference identification between tea plant cultivars is important for applying for new variety certification. In the current study， we analyzed the chemical composition and proportion of bioactive compounds using HPLC and built a chemical fingerprint to distinguish Lizaoxiang from Longjing 43， Yingshuang and Jiukeng. On the basis of the obtained HPLC chromatographic data， we selected common peak data of more than 90% samples to build chemical fingerprint chromatograph for further analysis. Chromatography revealed that Lizaoxiang was closest to Jiukeng；while the proportion of catechins， gallic acid and caffeine was different from that of Longjing 43， Yingshuang and Jiukeng. These observations help to distinguish Lizaoxiang from Longjing 43， Yingshuang and Jiukeng， and thus provid reference to characterize the difference between the varieties of tea plant for new variety protection.

tea; Lizaoxiang; chemical fingerprint; identification analysis

http://www.zjnyxb.cn潘建義，成浩，王麗鴛，等. 基于化學(xué)指紋圖譜的茶樹(shù)新品系麗早香識(shí)別研究[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，28(10)： 1724-1729.

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.10.14

2016-06-16

浙江省茶產(chǎn)業(yè)重點(diǎn)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(2011R50024)；麗水市優(yōu)質(zhì)特早紅綠兼制型茶樹(shù)新品種選育研究(2014XPZ11)

潘建義(1968—)，男，浙江溫州人，碩士，高級(jí)農(nóng)藝師，主要從事茶葉技術(shù)推廣及茶樹(shù)品種研究。 E-mail: pjy369@126.com

*通信作者，成浩，E-mail: chenghao@mail.tricaas.com

S571.1

A

1004-1524(2016)10-1724-06

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(10): 1724-1729