兔出血癥病毒2型的VP60基因保守區(qū)人工合成及RT-PCR檢測方法初探

楊澤曉，趙希侖，李 巖，王 波， 姚學(xué)萍，王 印，3，*，耿 毅，蒙正群，白 瑜

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院， 四川 溫江 611130； 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院， 四川 溫江 611130； 3.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 溫江 611130)

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兔出血癥病毒2型的VP60基因保守區(qū)人工合成及RT-PCR檢測方法初探

楊澤曉1，趙希侖1，李 巖2，王 波1， 姚學(xué)萍1，王 印1，3，*，耿 毅1，蒙正群1，白 瑜1

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院， 四川 溫江 611130； 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院， 四川 溫江 611130； 3.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 溫江 611130)

為建立用于兔出血癥病毒2型(RHDV2)的快速檢測方法，根據(jù)GenBank已公布的RHDV和RHDV2VP60基因，設(shè)計合成2對特異性引物和10條末端重疊引物，通過重疊PCR 人工合成RHDV2VP60基因中保守區(qū)片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒，并以其為模板，經(jīng)過反應(yīng)條件優(yōu)化、敏感性試驗、特異性試驗和35份樣品檢測應(yīng)用，初步建立RHDV2 RT-PCR檢測方法。實驗成功合成RHDV2VP60基因的435 bp保守片段并構(gòu)建了pMD-19T-RHDV2重組質(zhì)粒， 初步建立的RHDV2 RT-PCR方法具有良好的特異性和敏感性，RHDV2的檢測限度可達到230個拷貝的靶基因片段，檢測RHDV、pGM-T-EBHSV(已構(gòu)建)、兔巴氏桿菌、兔源大腸埃希菌和沙門氏菌均無特異性擴增，樣品檢測結(jié)果顯示樣品中RHDV2核酸陰性。該研究為中國及時進行RHDV2的防控提供技術(shù)儲備。

兔病毒性出血癥；RHDV2；RT-PCR；重疊PCR

兔病毒性出血癥(rabbit hemorrhagic disease，RHD)，俗稱兔瘟，自1984年我國首次報道后，世界很多國家也發(fā)生并流行[1]。RHD由兔出血癥病毒(rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)引起，是兔的一種急性、高度致死性傳染病。它主要危害2月齡以上多個家兔品種的成年兔子，并以呼吸系統(tǒng)出血，實質(zhì)器官淤血、腫大、出血和肝臟壞死為主要特征性病變，此病潛伏期短、發(fā)病急、病程短、傳播快、死亡率高達100%，嚴(yán)重威脅著世界養(yǎng)兔業(yè)的發(fā)展[1-3]。由于滅活苗等多種防控措施的廣泛使用，該病得到了一定程度的控制。然而，在2010年法國出現(xiàn)了一種新型兔病毒性出血癥(new rabbit hemorrhagic disease，nRHD) ，該病與經(jīng)典兔瘟病理相似，平均死亡率雖然只有20%左右，但是能感染致死30 日齡以內(nèi)的兔子，并可突破傳統(tǒng)RHDV毒株滅活苗的免疫保護作用[4-5]。研究表明，這種nRHD病原是一種新RHDV變異株即兔出血癥病毒2型(rabbit hemorrhagic disease virus type 2，RHDV2)，或者稱兔出血癥病毒b型(rabbit hemorrhagic disease virus variant b，RHDVb)[5]。RHDV2毒株，與包括G6基因型的RHDVa毒株[6]在內(nèi)的傳統(tǒng)RHDV毒株不同，它們與傳統(tǒng)RHDV毒株的核苷酸序列同源性僅為82.4%左右[5，7]，且還可感染一些野兔屬兔子品種，較傳統(tǒng)RHDV毒株感染范圍更廣[8-9]，對養(yǎng)兔業(yè)的威脅不亞于RHDV。近年來，該病已迅速擴散至意大利、西班牙、葡萄牙、德國、英國等多個西歐大陸國家和亞速爾群島[5，8，10-14]，呈現(xiàn)出向外蔓延的趨勢。隨著兔子引種、及其相關(guān)產(chǎn)品等國際經(jīng)濟貿(mào)易的發(fā)展，進行RHDV2的檢測方法等防控技術(shù)研究，加強檢驗檢疫已經(jīng)顯得非常重要和必需。目前我國尚未見關(guān)于RHDV2發(fā)生及其防控相關(guān)研究的公開報道。為此，本研究擬通過對RHDV和RHDV2分子生物學(xué)信息的收集分析和引物設(shè)計，采用重疊PCR技術(shù)人工合成RHDV2的VP60保守區(qū)基因片段，進而進行其RT-PCR檢測方法的初步研究，以期為我國RHDV2的檢測技術(shù)研究提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與樣品

Pfu DNA polymerase， 2×TaqMaster Mix， pMD-19T Vector Kit(VT202-01)， TIANprep Mini Plasmid Kit(DP103)和 TIANgel Midi Purification Kit(DP209)均為成都飛克生物科技有限公司產(chǎn)品；DNA Maker DL2000、RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT Reagent Kit (RR037A) 均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品；兔巴氏桿菌、兔大腸埃希菌、兔沙門氏菌、歐洲野兔綜合征病毒(EBHSV)重組質(zhì)粒pGM-T-EBHSV和兔出血病病毒(RHDV-Sch01株)人工感染病料由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物檢疫實驗室保存。

1.2 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫登錄的RHDV和RHDV2的VP60基因序列分析，采用DNAStar軟件分別設(shè)計4條特異性引物和10條重疊PCR延伸引物(表1)，送上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成，按照合成說明書將其稀釋至10 μmol·L-1，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RHDV2 VP60基因靶片段的人工合成

按照參考文獻[15]操作，采用搭橋PCR技術(shù)進行RHDV2VP60靶基因片段的人工合成。首先利用每對重疊PCR引物(F1/R1， F2/R2， F3/R3， F4/R4 和F5/R5)進行初級延伸反應(yīng)，體系為：10×Pfu 緩沖液 5 μL， dNTP(2.5 mmol·L-1)8 μL，重疊PCR引物(10 μmol·L-1)各1 μL，Pfu DNA 聚合酶1 μL和 34 μL ddH2O；反應(yīng)程序為95 ℃ 30 s，72 ℃ 15 min。接著依次分別取兩個相鄰的前一次重疊延伸反應(yīng)產(chǎn)物各20 μL，10×Pfu 緩沖液1 μL，dNTP(2.5 mmol·L-1)8 μL，Pfu DNA 聚合酶1 μL混勻進行次級延伸反應(yīng)，至最終模板延伸結(jié)束，反應(yīng)程序同上。

表1 RHDV2 RT-PCR與重疊PCR的引物

Table 1 Primers used in this study

項目和引物編號TaskandPrimername引物序列(5'-3')Primersequence(5'-3')產(chǎn)物大小Productsize/bp參考序列ReferencesequenceRHDVRT-PCR P1GGGTGTCATATCCACCCCAAA(6573-6593)441DQ205345 P2CCCAGGTTGAACACGAG(7013-6997)RHDV2RT-PCR FCATATCCACCCCAAAYAGT(6539-6557)435KP129339 RCCCAARTTGTACACAAGC(6973-6956)RHDV2OverlapextensionPCR F1TATCCACCCCAAACAGTAATGCCGTCACGTACACACCTCAGCCAAACAGGAKP129339 F2GCTCCTATTGGCAAGAACACACCCATCAT-GTTCGCGTCTGTTGTTAGGCGCACCGGCGA F3GAACCCAGTACGGCGCGGGATCACAAC-CACTGCCGGTGACAGTTGGACTCTCACTGAAC F4GTTCTTTGTTTGGCAGCTGAATTTCGCT-TCCGGTTTCATGGAACTTGGCTTGAGTGTTG F5TCAGCCACCCTCATTGACCTGTCAGAACT-TGTTGACATCCGCCCTGTGGGACCCAGACC R1CTTGCCAATAGGAGCGGCAGCAGGGGTGC-CAGGTGCATTGACAATCCTGTTTGGCTGAG R2CGCCGTACTGGGTTCCGTTAGCTGAACCG-GCCTCAGCGTTGATGTCGCCGGTGCGCCTA R3TGCCAAACAAAGAACTGCCCAGGCATA-AGTGCCGACGAGTAATTGTTCAGTGAGAGTCC R4AATGAGGGTGGCTGAAGCCCCCGTCCCTG-CATAGAAGTACCCATCAACACTCAAGCCAA R5CCCAAGTTGTACACAAGCGTGCTTGTGGACGGTCTGGGTCCCACA

分別以最終次級延伸反應(yīng)產(chǎn)物和F/R為模板與引物，進行PCR。其反應(yīng)體系為：2×Taq Master Mix 25 μL，F(xiàn)/R (10 μmol·L-1)各1 μL ，最終次級延伸反應(yīng)產(chǎn)物5 μL和ddH2O 18 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，57 ℃ 40 s，72 ℃ 45 s，30個循環(huán)；72 ℃ 8 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL產(chǎn)物進行凝膠電泳分析。

用TIANgel Midi Purification Kit(DP209)純化回收預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物；然后按照pMD-19T Vector Kit說明書進行連接轉(zhuǎn)化，挑取Amp+LB平板上的陽性克隆擴增培養(yǎng)，按照TIANpre Mini Plasmid Kit(DP103)說明書抽提質(zhì)粒按照上述反應(yīng)程序同時進行pMD-19T Vector通用引物(MR13-47/ RV-M)和特異性引物(F/R)的PCR鑒定，并將PCR鑒定均為陽性的重組質(zhì)粒送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進行序列測定。

1.4 RHDV VP60基因靶片段的克隆鑒定

按照RNAiso Plus reagent 說明書操作，提取RHDV人工感染組織病料中總RNA，使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit進行反轉(zhuǎn)錄(RT)，取5×Primerscript buffer 2 μL，Oligo dT Primer(50 μmol·L-1)0.5 μL，ddH2O 4.0 μL，Primerscript RT Enzyme Mix 0.5 μL，Random 6 mers(100 μmol·L-1)0.5 μL和總RNA 2.5 μL，混勻，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。反應(yīng)結(jié)束后取2 μL RT產(chǎn)物(其余產(chǎn)物保存 -20 ℃?zhèn)溆?，以P1/P2為引物，采用1.3節(jié)的PCR反應(yīng)體系與程序進行PCR擴增。按照1.3節(jié)的方法步驟進行RHDV PCR產(chǎn)物的純化回收，連接轉(zhuǎn)化和重組質(zhì)粒的PCR鑒定與測序分析。

1.5 反應(yīng)條件的優(yōu)化

以1.3節(jié)中構(gòu)建的RHDV2陽性重組質(zhì)粒為模板，以F/R為引物，進行PCR退火溫度(54～60 ℃)和反應(yīng)時間等條件的優(yōu)化。

1.6 RHDV2 RT-PCR敏感性試驗

抽提1.3節(jié)中構(gòu)建的RHDV2陽性重組質(zhì)粒，用ND-2000紫外分光光度計定量后進行10倍梯度稀釋，按照1.5節(jié)確定的反應(yīng)條件進行PCR擴增。

1.7 RHDV2 RT-PCR特異性試驗

按照1.5節(jié)確定的反應(yīng)條件分別以1.4節(jié)中RHDV RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA)、RHDV2 陽性重組質(zhì)粒、pGM-T-EBHSV、兔巴氏桿菌、兔大腸埃希菌、兔沙門氏菌為模板進行PCR特異性檢測。

1.8 初步應(yīng)用試驗

利用建立的RHDV2 RT-PCR方法對5份RHDV人工感染病料樣品和30份臨床收集的病死兔子檢樣進行了檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 RHDV2和RHDV靶基因片段的克隆鑒定

按照1.3節(jié)操作經(jīng)過初級延伸反應(yīng)、次級延伸反應(yīng)和PCR人工合成出一段與預(yù)期大小(435 bp)相符的DNA條帶(圖1，泳道1)，同時按照1.4節(jié)操作采用RT-PCR技術(shù)對人工合成靶片段對應(yīng)的RHDV基因片段進行了擴增，結(jié)果(圖1，泳道2)擴增出預(yù)期大小(441 bp)的特異性條帶，然后純化回收2 種目的條帶、分別進行連接轉(zhuǎn)化、重組菌的挑取、重組質(zhì)粒的抽提和PCR鑒定(圖2)，兩種重組質(zhì)粒的載體通用引物(MR13-47/ RV-M)的PCR產(chǎn)物均稍大于其特異性引物的PCR產(chǎn)物，表明目的片段與pMD-19T載體連接成功，選取PCR鑒定陽性的重組質(zhì)粒進行序列測定，將測序結(jié)果BLAST分析顯示人工合成的基因片段、RT-PCR擴增片段分別與GenBank 中公布的RHDV2(KP129339)、RHDV(KF537692)序列同源性均為100%。表明成功克隆了RHDV2與RHDV兩種病毒的VP60基因靶片段，并將構(gòu)建的重組質(zhì)粒分別命名為pMD-19T-RHDV2和pMD-19T-RHDV。

M，DNA marker DL2000；1， RHDV2靶基因重疊PCR產(chǎn)物；2，RHDV靶基因RT-PCR產(chǎn)物；3，RHDV靶基因RT-PCR陰性對照M， DNA marker DL2000; 1， RHDV2 overlapping extension PCR products; 2， RHDV RT-PCR products; 3， RHDV RT-PCR negative control圖1 RHDV2和RHDV靶基因片段的克隆Fig.1 Amplification results of target DNA fragments of RHDV2 and RHDV

M，DNA marker DL2000；1，pMD-19T-RHDV 特異性引物(P1/P2)PCR產(chǎn)物；2，pMD-19T-RHDV 通用引物(MR13-47/ RV-M)PCR產(chǎn)物；3，pMD-19T-RHDV2特異性引物(F/R)PCR產(chǎn)物；4，pMD-19T-RHDV2通用引物(MR13-47/ RV-M)PCR產(chǎn)物；5，pMD-19T空載體通用引物(MR13-47/ RV-M)PCR產(chǎn)物M， DNA marker DL2000; 1， PCR products amplified from pMD-19T-RHDV(P1/P2); 2， PCR products amplified from pMD-19T-RHDV (MR13-47/ RV-M); 3， PCR products amplified from pMD-19T-RHDV2 (F/R); 4， PCR products amplified from pMD-19T-RHDV2 (MR13-47/RV-M); 5， PCR products amplified from pMD-19T vector (MR13-47/RV-M)圖2 兩種靶基因片段重組質(zhì)粒的PCR鑒定Fig.2 PCR identification results of 2 recombinant plasmids

2.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化

按照1.5節(jié)操作進行退火溫度的優(yōu)化，結(jié)果如圖3所示，每個退火溫度條件下均擴增出約435 bp的特異性DNA條帶，泳道1—4擴增產(chǎn)物量沒有明顯差異，都較泳道5—7條帶亮，因此泳道4(58 ℃)的退火溫度較理想，考慮反應(yīng)的特異性和反應(yīng)時間，將PCR反應(yīng)條件確定為95 ℃預(yù)變

M，DNA marker DL2000；1，54.0 ℃；2，55.2 ℃；3，56.3 ℃； 4，58.0 ℃； 5，58.8 ℃；6，59.5 ℃；7，60.0 ℃圖3 RHDV2 RT-PCR退火溫度的優(yōu)化Fig.3 Test results of annealing degree for RHDV2 RT-PCR

性5 min；95 ℃ 40 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。RT反應(yīng)的體系和條件按照PrimeScriptTMRT Reagent Kit說明書進行。

2.3 RHDV2 RT-PCR的敏感性和特異性

按照1.6節(jié)、1.7節(jié)操作抽提pMD-19T-RHDV2，分別進行RT-PCR的敏感性和特異性試驗。敏感性檢測結(jié)果如圖4所示，RHDV2檢測限度可達230個拷貝的目的基因(泳道4)；特異性檢測結(jié)果如圖5所示，除pMD-19T-RHDV2(泳道1)擴增出435 bp特異性目的條帶外，RHDV cDNA、pGM-T-EBHSV、兔巴氏桿菌、兔大腸埃希菌、兔沙門氏菌的PCR擴增均為陰性，表明了建立的RHDV2 RT-PCR 的良好特異性與敏感性。

2.4 樣品檢測

按照1.8節(jié)的操作對5份RHDV人工感染RHDV病料樣品和30份臨床收集的兔子病料進行了檢測，結(jié)果顯示所有檢樣的RHDV2VP60基因靶片段核酸均為陰性。

M， DNA marker DL2000；1， 2.3×105 copies；2， 2.3×104 copies；3， 2.3×103 copies；4， 2.3×102 copies；5， 23 copies；6， 陰性對照Negative control圖4 RHDV2 RT-PCR敏感性檢測結(jié)果Fig.4 The sensitivity assay results of RHDV2 RT-PCR

M，DNA marker DL2000；1，pMD-19T-RHDV2；2，RHDV；3，pGM-T-EBHSV；4，兔巴氏桿菌；5，兔大腸埃希菌；6，兔沙門氏菌；7，陰性對照(ddH2O模板)M， DNA marker DL2000; 1, pMD-19T-RHDV2; 2， RHDV; 3， pGM-T-EBHSV; 4， Pasteurella multocida; 5， Escherichia.coli; 6， Salmonella; 7， Negative control(ddH2O).圖5 RHDV2 RT-PCR特異性檢測結(jié)果Fig.5 Specificity assay results of RHDV2 RT-PCR

3 討論

RHDV于1984年被發(fā)現(xiàn)后，歸為嵌杯病毒科兔病毒屬。后來該屬成員不斷被發(fā)現(xiàn)，包括歐洲野兔綜合癥病毒(EBHSV)、包含RCV-A1株(澳大利亞)、MRCV株(美國)和06-11株(法國)等毒株的非致病(低毒)兔病毒(NP-LV)、其他病毒成員[7]，以及2010年以后出現(xiàn)RHDV2[4]，它們均為單鏈正股RNA病毒，具有相似的基因組成結(jié)構(gòu)與大小和一定的遺傳關(guān)系，VP60基因同源性分析顯示，RHDV2毒株間遺傳相對穩(wěn)定，其基因同源性在99%以上，RHDV2與RHDV的基因同源性為85%[7]，其他NP-LV毒株與RHDV毒株變異率低于20%，與EBHSV毒株間的變異率低于30%[12]。通過基因序列分析，研究者們根據(jù)基因同源性分析將RHDV不同毒株分為G1-G6 6個基因型(群)，目前，我國報道流行RHDV毒株主要為G6型毒株，屬于RHDVa型毒株[16]。雖然不同基因型RHDV毒株間也存在一定抗原性的改變，但仍屬一種血清型，可被傳統(tǒng)疫苗防控。RHDV2則可以感染致死傳統(tǒng)RHDV毒株疫苗免疫過的兔子[12]，因此加強RHDV2防控技術(shù)研究以加大檢疫力度將是防止其傳入我國的最為有效措施之一。2015年Margarida等[17]根據(jù)RHDV2VP60基因保守區(qū)建立了一種用于RHDV2檢測的TaqMan探針熒光RT-PCR，具有良好敏感性和特異性，但是需要專用設(shè)備熒光PCR儀，一般的實驗室無法進行。由于國內(nèi)沒有RHDV2感染的發(fā)生，獲取研究材料比較困難也有傳播風(fēng)險，國內(nèi)尚無相關(guān)研究的報道。本研究在對RHDV2分子生物學(xué)信息分析的基礎(chǔ)上采用重疊PCR技術(shù)人工合成了其VP60基因的保守區(qū)片段，并對RHDV2的RT-PCR方法進行了初步探索。

重疊PCR技術(shù)作為一種基因人工合成的生物工程技術(shù)可以根據(jù)已有的基因序列設(shè)計搭橋引物，利用重疊延伸和PCR獲取目的基因片段，方便可靠，已被用作缺少病原體和避免高危病原體擴散條件下的分子生物水平相關(guān)研究包括分子生物學(xué)診斷方法的研究[15，18-19]。本研究根據(jù)RHDV2一段435 bp 的VP60基因保守序列，設(shè)計合成10條重疊延伸引物和1對特異性引物(表1)利用重疊PCR技術(shù)成功對其進行了人工合成，為進行RT-PCR檢測方法的研究提供了模板?？紤]到無法進行RHDV2對建立RT-PCR方法實用性的驗證，我們同時根據(jù)RHDV2擴增靶片段在RHDVVP60基因相應(yīng)的位置設(shè)計了與RHDV2 RT-PCR引物對應(yīng)的RHDV擴增引物(P1/P2)，通過對RHDVVP60的與RHDV2靶基因片段對應(yīng)基因片段的成功RT-PCR來間接驗證了RHDV2 RT-PCR引物的可靠性，解決了缺乏RHDV2病毒材料驗證問題。同時本研究通過退火溫度的優(yōu)化確立了反應(yīng)條件，并進行了特異性檢測、敏感性試驗和臨床檢樣的初步應(yīng)用，結(jié)果顯示確立的RHDV2 RT-PCR反應(yīng)條件和體系檢測限度可達230個拷貝的RHDV2目的基因，除陽性對照能擴增出435 bp特異性DNA條帶外，檢測RHDV、pGM-T-EBHSV、兔巴氏桿菌、兔大腸埃希菌等主要病原均無特異性擴增，提示建立的RHDV2 RT-PCR 具有良好特異性與敏感性，這為我國進行RHDV2防控相關(guān)研究提供了科學(xué)參考，也為RHDV2檢驗檢疫和流行病學(xué)調(diào)查提供了一種快速檢測的技術(shù)儲備。

[1] 陳溥言.獸醫(yī)傳染病學(xué)[M].5版，北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2008: 410-412.

[2] JOANA A， WESSEL V L， JACQUES L P， et al. Rabbit haemorrhagic disease (RHD) and rabbit haemorhhagic disease virus (RHDV): A review[J].VeterinaryResearch, 2012， 43(6):12-31.

[3] 陳柳，云濤，劉光清，等. 兔出血癥病毒衣殼蛋白VP60在桿狀病毒表達系統(tǒng)中的表達及細胞內(nèi)定位[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010， 22(2)：135-139.

CHEN L， YUN T， LIU G Q， et al. Expression and localization analysis ofVP60 protein ofRabbithemorrhagicdiseasevirusin insect cells-baculovirus expression system[J].ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2010， 22(2)：135-139. (in Chinese with English abstract)

[4] LE GALL-RECULé G， ZWINGELSTEIN F， BOUCHER S， et al. Detection of a new variant of rabbit haemorrhagic disease virus in France[J].VeterinaryResearch，2011，168(5)：137-138.

[5] LE GALL-RECULé G， LAVAZZA A， MARCHANDEAU S， et al. Emergence of a new lagovirus related to rabbit haemorrhagic disease virus[J].VeterinaryResearch, 2013，44(1)：81-94.

[6] LE GALL-RECULé G， ZWINGELSTEIN F， LAURENT S， et al. Phylogenetic analysis of rabbit haemorrhagic disease virus in France between 1993 and 2000， and the characterisation of RHDV antigenic variants [J].ArchivesofVirology， 2003， 148(1)：65-81

[7] DUARTE M， CARVALHO C，BERNARDO S， et al， Rabbit haemorrhagic disease virus 2 (RHDV2) outbreak in Azores: Disclosure of common genetic markers and phylogenetic segregation within the European strains[J].Infection，GeneticsandEvolution， 2015， 35(10)：163-171.

[8] PUGGIONI G， CAVADINI P， MAESTRALE C， et al. The new French 2010 Rabbit Hemorrhagic Disease Virus causes an RHD-like disease in the Sardinian Cape hare (Lepuscapensismediterraneus)[J].VeterinaryResearch， 2013， 44(1)：96-103.

[9] CAMARDA A， PUGLIESE N， CAVADINI P， et al. Detection of the new emerging rabbit haemorrhagic disease type 2 virus (RHDV2) in Sicily from rabbit (Oryctolaguscuniculus) and Italian hare (Lepuscorsicanus)[J].ResearchinVeterinaryScience， 2014， 97(3)：642-645.

[10] WESTCOOT D G， FROSSARD J P， EVEREST D， et al. Incursion of RHDV2-like variant in Great Britain[J].VeterinaryRecord， 2014， 174(13)：333.

[11] DALTON K P， NICIEZA I， ABRANTES J， et al. Spread of new variant RHDV in domestic rabbits on the Iberian Peninsula[J].VeterinaryMicrobiology， 2014， 169(1/2)：67-73.

[12] LOPES A M， CORREIA J， ABRANTES J， et al. Is the new variant RHDV replacing genogroup 1 in Portuguese wild rabbit populations？ [J].Viruses， 2015， 7(1)：27-36.

[13] DALTON K P， ABRANTES J， LOPES A M， et al. Complete genome sequence of two rabbit hemorrhagic disease virus variant b isolates detected on the Iberian Peninsula[J].ArchivesofVirology， 2015， 160(3)：877-881.

[14] DUARTE M， HENRIQUES M， BARROS S C， et al. Detection of RHDV variant 2 in the Azores[J].VeterinaryRecord，2015，176(5)：130.

[15] YANG Z， WANG B， XU Q， et al. Designment and evaluation of the primers for Rift Valley Fever (RVF) virus RT-PCR detection[J].AdvancedMaterialsResearch， 2014， 989-994: 1115-1119.

[16] WANG X， HAO H， QIU L， et al. Phylogenetic analysis of rabbit hemorrhagic disease virus in China and the antigenic variation of new strains[J].ArchivesofVirology， 2012， 157(8)：1523-1530.

[17] DUARTE M D， CARVALHO C L， BARROS S C， et al. A real time Taqman RT-PCR for the detection of rabbit hemorrhagicdisease virus 2 (RHDV2) [J].JournalofVirologicalMethods，2015， 219: 90-95.

[18] 朱曉文，李林，桑曉宇，等. 裂谷熱病毒TaqMan熒光定量PCR檢測方法的建立[J]. 中國人獸共患病學(xué)報，2012，28(4)：315-318.

ZHU X W， LI L， SANG X Y， et al. Development of a TaqMan real-time fluorescent quantitative PCR assay for detection of Rift Valley Fever virus[J].ChineseJournalofZoonoses， 2012， 28(4)：315-318. (in Chinese with English abstract)

[19] 王印，楊澤曉，韓雪清，等. 兔出血癥病毒與歐洲野兔綜合征病毒復(fù)合RT-PCR檢測方法的建立[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué)， 2011， 41(11)：1165-1170.

WANG Y， YANG Z X， HAN X Q， et al. Development of a complex RT-PCR assay for the detection and differentiation of rabbit hemorrhagic disease virus and European brown hare syndrome virus[J].ChinaAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine， 2011， 41(11)：1165-1170. (in Chinese with English abstract)

(責(zé)任編輯 盧福莊)

Artificial synthesis ofVP60 conserved gene fragment of rabbit hemorrhagic disease virus type 2 and preliminary study of its RT-PCR detection method

YANG Ze-xiao1， ZHAO Xi-lun1， LI Yan2， WANG Bo1， YAO Xue-ping1， WANG Yin1，3，*， GENG Yi1， MENG Zheng-qun1， BAI Yu1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Wenjiang611130，China; 2.CollegeofAnimalScienceandTechnology，SichuanAgriculturalUniversity，Wenjiang611130，China; 3.KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandHumanHealthofSichuanProvince，Wenjiang611130，China)

In order to develop a rapid detection method for RHDV2， 4 specific primers and 10 overlapping oligo primers were designed to amplify the conserved RHDV2VP60 gene specific DNA fragment according to the genome sequences of RHDV and RHDV2 published in GenBank. Based on the synthesis of a conserved part of RHDV2 sequence using overlap extension PCR and the construction of recombinant plasmid， RT-PCR assay was firstly established and evaluated in China after a series of tests， including optimization of reaction conditions， sensitivity and specificity tests， and the application tests of 35 samples. It was shown that a 435 bp specific DNA fragment of the RHDV2 capsid protein (VP60) gene was synthesizedinvitroand the recombinant plasmid pMD-19T-RHDV2 was constructed. The sensitivity of the established RT-PCR detection method for RHDV2 could reach about 230 copies of cloned viral genomic fragments of RHDV2， and there was no amplification for RHDV， pGM-T-EBHSV，Pasteurellamultocida，EscherichiacoliandSalmonellafrom rabbits by this method. Besides， the application results showed that there were not RHDV2 in the experimental infection RHDV samples and clinical samples. The present research set basis for RHDV2 control study and supplied a back-up method for the rapid detection and prevention of RHDV2.

rabbit hemorrhagic disease; RHDV2; RT-PCR; overlap extension PCR

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.10.04

2016-01-11

國家自然科學(xué)基金項目(31402222)；“十二五”國家科技支撐計劃(2013BAD12B04)；教育部《“長江學(xué)者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃”》創(chuàng)新團隊項目(IRT0848)；四川農(nóng)業(yè)大學(xué)雙支計劃；四川省科技支撐計劃(2016N20002)

楊澤曉(1980—)，男，河南南陽人，博士，副教授，研究方向為動物疫病防治與獸醫(yī)公共衛(wèi)生。E-mail: yzxyang2003@126.com。

*通信作者，王印，E-mail: yaanwangyin@tom.com

S855.3;S829.1

A

1004-1524(2016)10-1650-07

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(10): 1650-1656

楊澤曉，趙希侖，李巖，等. 兔出血癥病毒2型的VP60基因保守區(qū)人工合成及RT-PCR檢測方法初探[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2016，28(10): 1650-1656.