福林試劑法快速檢測(cè)藤倉(cāng)赤霉發(fā)酵液中赤霉酸含量

周圣驕， 宋志遠(yuǎn)， 聶志奎*

(1.江西新瑞豐生化有限公司，江西新干 331300；2.江西省植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑工程研究中心，江西新干 331300)

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福林試劑法快速檢測(cè)藤倉(cāng)赤霉發(fā)酵液中赤霉酸含量

周圣驕1,2， 宋志遠(yuǎn)1， 聶志奎1,2*

(1.江西新瑞豐生化有限公司，江西新干 331300；2.江西省植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑工程研究中心，江西新干 331300)

[目的]優(yōu)化福林試劑法的反應(yīng)條件。[方法]以從紫外誘變樣品中篩選獲得的1株高產(chǎn)藤倉(cāng)赤霉菌(G.fujikuroi) F12為研究對(duì)象，采用福林試劑法，通過(guò)溶液吸光值的變化定量檢測(cè)藤倉(cāng)赤霉菌發(fā)酵液中赤霉酸(GA3)的產(chǎn)量。[結(jié)果]當(dāng)福林試劑的用量為1.5 mL、鹽酸用量為3.0 mL、加熱時(shí)間為20 min時(shí)，所得溶液吸光值穩(wěn)定性最好，在4 h以內(nèi)基本保持不變。[結(jié)論]福林試劑法操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速準(zhǔn)確，可用于藤倉(cāng)赤霉菌發(fā)酵液中GA3的快速檢測(cè)。

赤霉酸;福林試劑;快速檢測(cè)法;藤倉(cāng)赤霉菌;吸光值

赤霉酸(GA3)屬于生物體內(nèi)的一類(lèi)四環(huán)二萜類(lèi)化合物，是一種天然的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，與生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、脫落酸、乙烯共稱(chēng)為植物的五大內(nèi)源激素[1-2]。由于GA3在植物生長(zhǎng)周期全過(guò)程中可促進(jìn)與調(diào)節(jié)各種發(fā)育過(guò)程，如種子萌發(fā)、莖的伸長(zhǎng)、性別表達(dá)和果實(shí)形成等[3-6]，它被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)、釀造業(yè)等各個(gè)行業(yè)，具有很大的經(jīng)濟(jì)效益和市場(chǎng)前景。

GA3的化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，雖然利用化學(xué)合成法也能生產(chǎn)GA3，但是存在步驟繁瑣、副產(chǎn)物多、分離困難等問(wèn)題，導(dǎo)致GA3價(jià)格非常高[7]。目前，GA3的工業(yè)化生產(chǎn)還是依賴于高產(chǎn)藤倉(cāng)赤霉菌(G.fujikuroi)作為發(fā)酵菌種的液體深層發(fā)酵法[8]。但GA3的工業(yè)化發(fā)酵產(chǎn)量較低，導(dǎo)致GA3一直無(wú)法進(jìn)行大規(guī)模應(yīng)用。為了進(jìn)一步提高GA3產(chǎn)量，大量的研究工作都圍繞著赤霉菌的誘變和篩選進(jìn)行。但是誘變篩菌操作繁瑣，誘變得到的菌株數(shù)量非常多，如果僅僅依靠液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定，每天只能測(cè)定70多個(gè)菌，工作量極大[9-10]。目前，關(guān)于福林試劑法快速檢測(cè)GA3含量的研究已有報(bào)道[11-13]，而且效果較好，可以對(duì)赤霉菌發(fā)酵液中的GA3進(jìn)行較精確的測(cè)量。該方法比較簡(jiǎn)單，在酶標(biāo)儀的操作下1 d可對(duì)上千個(gè)樣品進(jìn)行快速測(cè)定，從而節(jié)省大量時(shí)間。由于福林試劑與濃鹽酸的用量以及加熱時(shí)間不僅影響反應(yīng)后的吸光值，同時(shí)還影響吸光值的穩(wěn)定性，筆者采用福林試劑法快速檢測(cè)藤倉(cāng)赤霉菌發(fā)酵液中GA3含量，對(duì)該方法進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化，旨在為突變菌株的大規(guī)模篩選奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 出發(fā)菌株。藤倉(cāng)赤霉菌F12，為江西新瑞豐生化有限公司實(shí)驗(yàn)室紫外誘變篩選獲得。

1.1.2 試劑。GA3標(biāo)準(zhǔn)品、福林試劑、無(wú)水乙醇(分析純)、37%濃鹽酸均購(gòu)自Sigma試劑公司。

1.1.3 培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基：30.00 g/L葡萄糖，5.50 g/L酵母粉，0.20 g/L磷酸二氫鉀，0.20 g/L硫酸鎂,pH自然,115 ℃下滅菌30 min。發(fā)酵培養(yǎng)基：60.00 g/L葡萄糖，5.50 g/L酵母粉，0.20 g/L磷酸二氫鉀，0.20 g/L硫酸鎂，100 μL微量元素(0.10 g/L CaCl2，0.10 g/L FeCl3, 0.05 g/L MnCl2)，pH自然，115 ℃下滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵樣品處理。取3.0 mL發(fā)酵后菌液，先用濾紙過(guò)濾得到較澄清的濾液，然后用0.22 μm濾頭對(duì)濾液進(jìn)行過(guò)膜處理，得到澄清樣品，再進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)分析。

1.2.2 HPLC測(cè)定GA3含量。標(biāo)準(zhǔn)C18液相色譜柱250.0 mm×4.6 mm；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；流速1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相為100%甲醇與0.05%磷酸；柱溫28 ℃。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。將GA3標(biāo)準(zhǔn)品溶解于色譜純乙醇，配制成0.20 g/L的標(biāo)準(zhǔn)液，分別取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL的標(biāo)準(zhǔn)液于玻璃試管中，蒸發(fā)乙醇溶劑，再加入1.5 mL福林試劑與3.0 mL鹽酸，沸水浴反應(yīng)20 min，冷卻，定容至10.0 mL，680 nm波長(zhǎng)處比色。

1.2.4 赤霉素發(fā)酵液的測(cè)定。過(guò)膜樣品稀釋一定倍數(shù)后，取2.0 mL置于玻璃試管中，滴入0.5 mol的鹽酸調(diào)節(jié)pH為1～2，再加入2.0 mL乙酸乙酯，充分振蕩后靜置分層，取上層乙酸乙酯萃取液0.5 mL，加入試管中，先蒸去溶劑，再加入1.5 mL福林試劑與3.0 mL濃鹽酸，沸水浴20 min，冷卻，定容至10.0 mL，680 nm波長(zhǎng)處比色，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)GA3微克數(shù)(G)。

1.2.5 發(fā)酵液GA3含量測(cè)定計(jì)算方法。

式中,0.88表示水、乙酸乙酯比例為1∶2時(shí)乙酸乙酯對(duì)赤霉素的抽提率。

1.2.6 不同批次的GA3發(fā)酵液福林試劑法與HPLC檢測(cè)比對(duì)分析。對(duì)不同批次的GA3發(fā)酵液進(jìn)行處理后, 分別采用福林試劑法和HPLC檢測(cè)，對(duì)2種檢測(cè)方法進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 福林試劑用量對(duì)吸光值的影響 取0.5mLGA3標(biāo)準(zhǔn)品，分別加入3.0mL濃鹽酸與不同量福林試劑，反應(yīng)后測(cè)量吸光值。由表1可知，溶液反應(yīng)后，吸光值隨著福林試劑用量的增大先變大后變小，顏色先加深后變淺，推測(cè)原因是福林試劑把GA3降解物反應(yīng)完全后，剩余的福林試劑稀釋了反應(yīng)溶液，從而導(dǎo)致吸光值的降低、顏色的變淺。當(dāng)福林試劑的添加量為1.5mL時(shí)吸光值最大，因此，福林試劑的用量選擇1.5mL。

表1 福林試劑用量對(duì)吸光值的影響

Table1EffectofamountofFolin-Ciocalteu’sphenolreagentonabsorbance

福林試劑用量DosageofFolin?Ciocalteu’sphenolreagent∥mL吸光值A(chǔ)bsorbance顏色變化Changeincolor1．00．7832黃色轉(zhuǎn)為淺綠色1．50．9423黃色轉(zhuǎn)為墨綠色2．00．8777黃色轉(zhuǎn)為墨綠色2．50．7458黃色轉(zhuǎn)為淺綠色3．00．7251黃色轉(zhuǎn)為淺綠色3．50．6905黃色轉(zhuǎn)為淺綠色

2.2 鹽酸用量對(duì)吸光值的影響 取0.5 mL GA3標(biāo)準(zhǔn)品，分別加入不同量濃鹽酸與1.5 mL福林試劑，反應(yīng)后測(cè)量吸光值。由表2可知，隨著濃鹽酸加入量的增大，吸光值先增加后不變，顏色變化由淺到深。推測(cè)原因是鹽酸的量比較少時(shí)未和GA3完全反應(yīng)，隨著濃鹽酸用量的增大，GA3逐漸被降解，吸光值逐漸增大，當(dāng)GA3全部被鹽酸降解后吸光值基本保持不變。當(dāng)濃鹽酸用量增加到3.0 mL左右，吸光值變化非常緩慢，所以濃鹽酸的用量選擇3.0 mL。

表2 鹽酸用量對(duì)吸光值的影響

2.3 加熱時(shí)間對(duì)吸光值的影響 0.4 mL GA3標(biāo)準(zhǔn)樣品加入1.5 mL福林試劑和3.0 mL濃鹽酸后，必須經(jīng)過(guò)沸水浴才能使反應(yīng)完全進(jìn)行，因此，確定最佳的反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系的穩(wěn)定性非常重要。由圖1可知，吸光值隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)先變大后保持不變，推測(cè)原因，溶液反應(yīng)是在20 min時(shí)才基本結(jié)束，此時(shí)吸光值保持不變，所以選擇加熱時(shí)間為20 min。

圖1 加熱時(shí)間對(duì)吸光值的影響Fig.1 Effect of heating time on absorbance

2.4 穩(wěn)定性驗(yàn)證 確定了最佳鹽酸與福林試劑的添加量以及加熱時(shí)間后，對(duì)溶液的吸光值的穩(wěn)定性進(jìn)行考察。0.4與0.6 mL標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過(guò)顯色反應(yīng)后，在室溫下放置，每隔一段時(shí)間測(cè)量吸光值，發(fā)現(xiàn)當(dāng)取1.5 mL福林試劑與3.0 mL濃鹽酸時(shí)，溶液的穩(wěn)定性在4 h以內(nèi)較好，吸光值基本保持不變(表3)。

表3 穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線 由圖2可知,當(dāng)GA3質(zhì)量在40～240 μg時(shí),

圖2 GA3標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of GA3

吸光值基本上呈線性關(guān)系，在該濃度范圍內(nèi)得到吸光值與GA3的線性方程為：y=0.003 23x+0.550 22,R=0.990 1。

2.6 福林試劑法與HPLC檢測(cè)結(jié)果比較 由表4可知，福林試劑法與HPLC測(cè)試結(jié)果比較相似，說(shuō)明福林試劑法可用于發(fā)酵液中GA3的檢測(cè)。

表4 福林試劑法與HPLC測(cè)試結(jié)果比較

Table 4 The comparison of determination results by Folin-ciocalteu′s phenol reagent method and HPLC

樣品SamplesGA3含量GA3content∥mol/L福林試劑法Folin?ciocalteu′sphenolreagentmethod液相色譜法HPLC14203982443415347345444984895556521

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)福林試劑法快速檢測(cè)藤倉(cāng)赤霉菌發(fā)酵液中GA3進(jìn)行探討，優(yōu)化了影響吸光值的3個(gè)因素，提高了系統(tǒng)的穩(wěn)定性，并在此基礎(chǔ)上對(duì)福林試劑法和HPLC進(jìn)行了對(duì)比分析，從實(shí)踐上驗(yàn)證了福林試劑法檢測(cè)GA3的可行性。與HPLC相比，福林試劑法操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速準(zhǔn)確，大大降低了篩菌過(guò)程的工作量，對(duì)赤霉菌誘變育種工作中高產(chǎn)菌株的快速檢測(cè)以及GA3發(fā)酵過(guò)程的簡(jiǎn)易監(jiān)測(cè)有重要作用。

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Quick Detection of Gibberellins in Gibberella fujikuroi Fermentation Broth Using Folin-Ciocalteu’s Phenol Reagent

ZHOU Sheng-jiao1,2, SONG Zhi-yuan1, NIE Zhi-kui1,2*

(1. Jiangxi New Reyphon Biochemical Co. Ltd., Xingan, Jiangxi 331300; 2. Jiangxi Plant Growth Regulator Engineering Research Center, Xingan, Jiangxi 331300)

[Objective] The aim was to optimize reaction conditions of Folin-Ciocalteu’s phenol reagent. [Method] With high-yieldGibberellafujikuroiF12 as the research strain which was isolated from large quantities of UV mutation samples, Folin-Ciocalteu’s phenol reagent method was used to quickly detect the gibberellin acid (GA3) yield inGibberellafujikuroifermentation broth by the change of absorbance. [Result] When 1.5 mL Folin-Ciocalteu’s phenol reagent, 3.0 mL hydrochloric acid as well as 20 min heating time was selected, the final solution absorbance had the best stability and still remained basically unchanged within 4 h. [Conclusion] The optimized method can quickly and accurately detect the GA3yield inGibberellafujikuroifermentation broth.

GA3; Folin’s reagent; Quick detection;Gibberellafujikuroi; Absorbance

周圣驕(1979- )，男，湖北京山人，工程師，從事微生物代謝工程研究。*通訊作者，工程師，博士，從事微生物代謝工程研究。

2016-08-10

S 13

A

0517-6611(2016)28-0017-02