硒化桑葚多糖及其抗氧化活性研究

嚴(yán)婭娟　吳　暉　李雪松（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科昆明650032）

硒化桑葚多糖及其抗氧化活性研究

嚴(yán)婭娟吳暉李雪松*（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科昆明650032）

目的：通過(guò)硒化修飾改變桑葚多糖分子結(jié)構(gòu)，并對(duì)比研究其體內(nèi)抗氧化活性。方法：采用水提醇沉法提取桑葚多糖（FMP），硒化修飾FMP，得到桑葚多糖硒化衍生物（FMPs）；考察桑葚多糖的體內(nèi)抗氧化能力，測(cè)定小鼠血清和肝臟中MDA、肝臟T-AOC和CAT；建立高脂血癥大鼠抗氧化損傷模型，考察FMP及FMPs的抗氧化能力。結(jié)果：FMPs及FMP均可以顯著提高正常小鼠肝組織CAT活力及T-AOC，降低小鼠血清及肝臟MDA含量，F(xiàn)MPs抗氧化活性明顯優(yōu)于FMP。此外，F(xiàn)MPs及FMP還可以顯著降低四氧嘧啶致高脂大鼠的氧化損傷程度，提高其血清SOD活力及肝臟T-AOC，并降低其血清MDA含量。結(jié)論：硒化修飾可顯著提高桑葚多糖的抗氧化活性。

桑葚多糖 硒化 抗氧化

桑葚多糖（Fructus Mori polysaccharide，F(xiàn)MP）為桑科植物桑（Morus alba L.）的干燥果穗中的主要成分[1]?，F(xiàn)有報(bào)道表明桑葚多糖具有抗氧化、降糖、抗疲勞等作用[2～4]。天然來(lái)源的多糖具有低毒、無(wú)副作用的優(yōu)勢(shì)，但也存在一些不足：①天然多糖并不都具有生物學(xué)活性[5]；②有些多糖因?yàn)槔砘再|(zhì)或空間結(jié)構(gòu)等問(wèn)題從而限制藥理活性發(fā)揮；③一些多糖活性較弱，還需要改善[6]。目前國(guó)內(nèi)外已有大量文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于分子修飾多糖從而獲得理想的活性多糖。化學(xué)修飾是多糖分子修飾方法中運(yùn)用最廣的一類方法，該方法主要通過(guò)嫁接其他基團(tuán)或者元素，以改性多糖，化學(xué)修飾包括硫酸化、磷酸化、乙?；?、羧甲基化、硒化修飾等[7]。硒化修飾通過(guò)嫁接有機(jī)硒，可與多糖發(fā)揮二者協(xié)同作用，使機(jī)體避免無(wú)機(jī)硒中毒且能補(bǔ)充機(jī)體所需的硒元素[8]。目前尚無(wú)FMP硒化修飾研究。從其他關(guān)于多糖硒化的研究報(bào)道可以推測(cè)，硒化可使桑葚多糖增加有機(jī)硒具有的生物活性，包括提高抗氧化能力、提高免疫力及防癌抗癌能力等，從而改善多糖原本活性[9]。因此本文采用硒化修飾FMP，通過(guò)體內(nèi)抗氧化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)硒化FMP活性，為FMP相關(guān)藥品及功能保健品的開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1　材料與儀器

1.1材料與試劑：桑葚多糖由實(shí)驗(yàn)室自制[2]，苯酚硫酸法測(cè)定其多糖含量為91.3％。

總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、過(guò)氧化氫酶（CAT）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；DEAE-纖維素-52凝膠、Sephadex G-200凝膠（購(gòu)于Sigma公司）；亞硒酸鈉、吡啶、磷酸、無(wú)水乙醇均為分析純。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)KM小鼠，體重（20±2）g；SD大鼠，體重（200±20）g，中科院上海動(dòng)物中心提供。

1.2儀器：DL-6000B離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），F(xiàn)A2004電子天平（上海菁華科學(xué)儀器有限公司），UV-360紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司），RE52-4旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮公司），TAS-990原子吸收分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），XT-9900型智能微波消解儀（上海新拓微波溶樣測(cè)試技術(shù)有限公司）。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1FMP硒化衍生物制備：按文獻(xiàn)方法[10]，稱取1.5g FMP溶于100mL0.6％硝酸溶液中，充分溶解后滴加15mL吡啶，再加入2.0g亞硒酸鈉，反應(yīng)溫度為60℃，反應(yīng)24h后，濃縮至20mL，加入4倍量無(wú)水乙醇，充分?jǐn)嚢韬箪o置過(guò)夜，離心，沉淀物用95％乙醇洗滌兩次，再將沉淀物冷凍干燥后溶于100mL去蒸餾水中，3000Da透析袋透析72h，濃縮，醇沉，冷凍干燥即得FMP硒化衍生物FMPs。采用原子吸收分光光度法檢測(cè)硒化取代度[11]。

2.2FMPs對(duì)正常小鼠抗氧化能力的影響：60只昆明種小鼠隨機(jī)分成6組，即空白對(duì)照組：每天灌胃0.9％生理鹽水；陽(yáng)性對(duì)照組：Vc，500mg/kg BW，用前新鮮配制；FMP低劑量組：100mg/kg BW；FMP高劑量組：300mg/kg BW；FMPs低劑量組：100mg/kg BW；FMPs高劑量組：300mg/kg BW，連續(xù)灌胃給藥15d。末次給藥后摘眼球取血制備血清，頸椎脫臼法處死小鼠，取肝臟，按試劑盒說(shuō)明檢測(cè)血清和肝臟MDA、肝臟T-AOC和CAT。

2.3FMPs對(duì)高脂血癥大鼠抗氧化損傷能力的影響：采用自行配制的高脂飲食（豬油50％+膽固醇40％+膽鹽3號(hào)8％+丙基硫氧嘧啶2％）。取雌性SD大鼠，i.g，2mL/只，連續(xù)灌胃20d。根據(jù)血清甘油三酯含量，取48只雌性SD大鼠，隨機(jī)分為6組，陽(yáng)性對(duì)照組：血脂康200mg/kg；陰性對(duì)照組：0.9％生理鹽水；FMP低劑量組：100mg/kg BW；FMP高劑量組：300mg/kg BW；FMPs低劑量組：100mg/kg BW；FMPs高劑量組：300mg/kg BW；另取同批次未飼喂高脂飲食雌性SD大鼠8只作為正常對(duì)照組：生理鹽水。各組腹腔注射連續(xù)給藥40d。于d37，除正常對(duì)照組外，其他6組大鼠均腹腔注射四氧嘧啶，200mg/kg BW。72h后，用乙醚麻醉，腹腔主動(dòng)脈取血，檢測(cè)血清MDA與SOD以及肝臟的T-AOC。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：將所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel建立數(shù)據(jù)庫(kù)，運(yùn)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s）表示，選用t檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

3　結(jié)果與分析

3.1FMPs中硒含量測(cè)定：通過(guò)原子吸收分光光度法，在波長(zhǎng)為196.0nm，光譜通帶寬0.7nm進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得FMPs樣品中的硒含量為145mg/g。

3.2FMPs對(duì)正常小鼠抗氧化能力的影響

表1　FMPs對(duì)正常小鼠抗氧化能力的影響（±s，n=10）Table 1 Effect of FMPs on the antioxidant ability of normal mice（±s，n=10）

表1　FMPs對(duì)正常小鼠抗氧化能力的影響（±s，n=10）Table 1 Effect of FMPs on the antioxidant ability of normal mice（±s，n=10）

注：*與空白對(duì)照組相比，具有顯著差異（P＜0.05）；同一指標(biāo)中不同上標(biāo)字母表示互相之間具有顯著差異，P＜0.05。

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MDA是氧自由基損傷組織或細(xì)胞導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化的代謝產(chǎn)物，因此丙二醛濃度越低脂質(zhì)過(guò)氧化程度越低，機(jī)體抗氧化能力越強(qiáng)[12]。由表1可以看出，Vc組、FMP組及FMPs組血清和肝組織中的MDA濃度均明顯低于空白對(duì)照組（P<0.05），均有良好的抗氧化活性；FMP低劑量組與Vc組效果相當(dāng)，F(xiàn)MPs組效果明顯優(yōu)于FMP組。上述結(jié)果表明，F(xiàn)MP可有效抑制血清及肝組織中MDA的形成，硒化衍生物FMPs活性更強(qiáng)。

肝臟T-AOC測(cè)定結(jié)果顯示Vc、FMP及FMPs均可以顯著增強(qiáng)肝臟總抗氧化能力，F(xiàn)MPs效果優(yōu)于FMP。此外Vc、FMP及FMPs均可以顯著增強(qiáng)肝臟總抗氧化能力，F(xiàn)MPs效果顯著優(yōu)于FMP。

3.3FMPs對(duì)高脂血癥大鼠抗氧化損傷能力的影響

表2　FMPs對(duì)高脂血癥大鼠體內(nèi)抗氧化能力的影響（±s，n=8）Table 2 Effect of FMPs on antioxidation ability in Hyperlipidemia Rats（±s，n=8）

表2　FMPs對(duì)高脂血癥大鼠體內(nèi)抗氧化能力的影響（±s，n=8）Table 2 Effect of FMPs on antioxidation ability in Hyperlipidemia Rats（±s，n=8）

注：#與空白對(duì)照組相比，具有顯著差異（P＜0.05）；*與陰性對(duì)照組相比，具有顯著差異（P＜0.05）；同一指標(biāo)中不同上標(biāo)字母表示互相之間具有顯著差異，P＜0.05。

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對(duì)于血清SOD含量，陰性對(duì)照組顯著低于空白對(duì)照組，表明建模成功，F(xiàn)MP及FMPs均能顯著提高血清SOD活力，F(xiàn)MPs提高SOD含量活性雖優(yōu)于FMP，但無(wú)顯著差異。

血清中MDA含量檢測(cè)結(jié)果表明FMP及FMPs均能顯著改善高血脂癥大鼠血清MDA含量，F(xiàn)MP高劑量組與FMPs低劑量組效果相當(dāng)，但均優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組。肝臟總抗氧化能力測(cè)試結(jié)果表明FMP及FMPs均能顯著改善高血脂癥大鼠肝臟抗氧化能力，F(xiàn)MPs高、低劑量組均優(yōu)于FMP高、低劑量組，效果具有顯著差異，而FMPs高、低劑量組之間無(wú)顯著差異，F(xiàn)MP高、低劑量組之間亦無(wú)顯著差異。

4　結(jié)論與討論

FMPs及FMP均可以顯著提高正常小鼠肝組織CAT活力及T-AOC，降低小鼠血清及肝臟MDA含量，F(xiàn)MPs抗氧化活性明顯優(yōu)于FMP。此外，F(xiàn)MPs及FMP可以顯著降低四氧嘧啶致高脂大鼠的氧化損傷程度，提高其血清SOD活力及肝臟T-AOC，并降低其血清MDA含量。綜合表明硒化桑葚多糖的抗氧化活性顯著優(yōu)于未經(jīng)修飾的天然桑葚多糖，應(yīng)與有機(jī)硒元素可以提高機(jī)體抗氧化活性有關(guān)，從而提高FMPs活性。

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Solemnization of Fructus Mori polysaccharides and its antioxidant activity

Yan Yajuan Wu Hui Li Xuesong*（Department of pharmacy，the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming，PR China 650032）

Objective：Chemical modification of Fructus Mori polysaccharide（FMP），and investigate its antioxidant activity in vivo. Method：First，extracted FMP，solemnization then got the solemnization derivatives FMPs.Determine content of MDA in serum and liver，and T-AOC and CAT in liver.Establishment of antioxidative damage model of hyperlipidemia rats investigates the effects of antioxidant capacity of FMP and FMPs.Result：FMPs and FMP can significantly increase the activity of CAT and T-AOC in liver tissue of normal mice，reduce the serum and liver MDA content in mice，antioxidant activity of FMPs is better than FMP.In addition，F(xiàn)MPs and FMP can significantly reduce the oxidation degree of injury four alloxan induced by high fat rats，improve the activity of SOD in serum and liver T-AOC，and decrease the content of MDA in serum.Conclusion：Solemnization can significantly improve the antioxidant activity of Fructus Mori polysaccharide.

Fructus Mori polysaccharide Solemnization Antioxidant

R 285.5

B

1672-8351（2016）11-0127-03