黑豆皮中花青素大孔吸附樹脂分離純化工藝研究

吳艷立，丁之恩，閆晗，董敏，?；郏航鹦?/p>

（安徽農業(yè)大學，安徽合肥230036）

黑豆皮中花青素大孔吸附樹脂分離純化工藝研究

吳艷立，丁之恩*，閆晗，董敏，?；郏航鹦?/p>

（安徽農業(yè)大學，安徽合肥230036）

不同的大孔樹脂對花青素的吸附能力不同，本試驗依據花青素的特征，大孔樹脂的特性，篩選出DM301、ADS-17、HPD-417 3種不同型號的大孔樹脂，以吸附率α和解吸率β為評價指標，選擇兩種大孔樹脂進行組合，對黑豆皮花青素粗提物進行吸附與解吸試驗，采用UPLC-MS對純化物進行檢測。結果表明：最佳的樹脂比例組合是DM301：HPD-417為4∶1（質量比），乙醇溶液體積分數65%，解吸液pH 3.5，動態(tài)吸附上樣流速0.5 mL/min，洗脫液流速1.5 mL/min是最佳的選擇，純化的花青素主要成分為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷。

黑豆皮；提?。换ㄇ嗨?；大孔樹脂；組合；純化；檢測

黑豆在我國產量豐富［1］，其皮富含花青素［2］，大量研究證實，花青素具有抗突變［3］、抗腫瘤［4］、抗過敏［5］、抗氧化［6］、清除氧自由基及抑制脂質過氧化［7］、抑制血小板凝固、預防血栓、心臟?。?］、保護胃粘膜、降低血糖［9］等多種生理功能。

鑒于花青素的保健作用，越來越多的商家在投入對花青素的生產。花青素粗提物中通常含蛋白質、還原糖等，它們對花青素的穩(wěn)定性及品質有很大程度的影響，因此有必要對花青素粗提物進行純化。

1　材料與方法

1.1材料、儀器與試劑

黑豆：市售，產地為山東。

ML204/02精密電子天平：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；UV-1800紫外可見分光光度計：上海美諾達儀器有限公司；SHA-B雙功能水浴恒溫振蕩器：金壇市杰瑞爾電器有限公司；FDU-2100真空冷凍干燥機：上海愛朗儀器有限公司；錐形瓶；層析柱（內徑1 cm，徑高20 cm）：上海煊盛生化科技有限公司）；Agilent6460+1290超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質譜聯(lián)用儀：美國Agilent公司。

檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液：北京雷根生物技術有限公司；無水乙醇、乙腈（色譜純）、甲酸（色譜純）：國藥集團化學試劑有限公司；DM301型大孔吸附樹脂：天津市海光化工有限公司；ADS-17型大孔吸附樹脂、HPD-417型大孔吸附樹脂：滄州寶恩化工有限公司。大孔吸附樹脂的物理性能見表1。

表1　吸附樹脂的物理性能Table 1 Physical properties of adsorption resins

1.2方法

1.2.1黑豆皮花青素的提取

用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液（pH為3）在提取溫度50℃，提取時間100 min，液料比20∶1（mL/g）條件下對黑豆皮花青素進行恒溫水浴振蕩提取，并將提取液濃縮后用真空冷凍干燥機冷凍干燥，備用。

1.2.2大孔樹脂預處理

將型號為DM301、ADS-17、HPD-417的大孔樹脂分別先用95%的乙醇溶液浸泡24 h，用去離子水洗至中性無醇味；再5%NaOH溶液浸泡12 h，去離子水洗至中性；最后用5%的鹽酸浸泡12 h，去離子水洗至中性，備用［10-11］。

1.2.3大孔樹脂吸附率、解吸率的測定

準確稱取一定量花青素粗提物，置于三角瓶中加V0mL去離子水，波長530 nm測其吸光值A0。取足量經預處理的大孔樹脂加入到三角瓶中，置恒溫振蕩器上20℃、120 r/min振蕩24 h，充分吸附后，過濾，測濾液體積V1、吸光值A1。向濾出的樹脂中加入V0mL pH為3.0的60%乙醇溶液，20℃、120 r/min振蕩24 h，充分解吸后過濾，測濾液體積V2、吸光值A2，計算吸附率α和解吸率β［12］。

式中：A0為樣液吸附前的吸光度值；V0為樣液吸附前的體積，mL；A1為吸附過濾后濾液的吸光度值；V1為吸附過濾后濾液的體積，mL；A2解吸后濾液的吸光度值；V2解吸后濾液的體積，mL。

1.2.4靜態(tài)吸附與解吸試驗

1.2.4.1大孔樹脂的選擇

依據花青素的特征、大孔樹脂的特性及前人的研究成果［13-15］，選取DM301、ADS-17、HPD-417 3種不同型號的大孔樹脂進行試驗，記錄吸附率α和解吸率β，之后選擇其中兩種的組合進行試驗。

1.2.4.2乙醇溶液體積分數的選擇

取5份吸附花青素飽和的樹脂2g，分別加入pH 3.0，體積分數為45%、55%、65%、75%、85%的乙醇溶液25 mL，置水浴恒溫振蕩器上20℃、120 r/min振蕩24 h，分別過濾，530 nm處測濾液體積V2、吸光度值A2，計算解吸率。

1.2.4.3解吸液pH的選擇

條件步驟同1.2.4.2，其中pH分別為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5，乙醇溶液體積分數為65%，濾液體積V2、吸光度值A2。

1.2.5動態(tài)柱層析試驗

1.2.5.1上樣流速的選擇

選擇預處理后的大孔樹脂，濕法裝柱。將已測吸光度，濃度為10 mg/mL，pH為3.5的花青素粗提液2 mL，控制流速分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min常溫下通過層析柱，待樣液全部通過層析柱后，測流出液體積V1、吸光度值A1，計算吸附率。

1.2.5.2洗脫流速的選擇

將pH 3.5，體積分數65%的乙醇溶液以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min 5個流速梯度通過吸附飽和的樹脂柱，待洗脫完成后，測洗脫液體積V2、吸光值A2，計算解吸率。

1.2.6驗證性試驗

預處理后的DM301∶HPD-417=4∶1（質量比）的大孔樹脂組合濕法裝柱，10 mg/mL，pH為3.5的黑豆皮花青素粗提物以0.5 mL/min進行上樣，吸附飽和后，pH3.5，體積分數65%的乙醇溶液1.5 mL/min進行洗脫。收集25 mL～35 mL的洗脫液，冷凍干燥，測花青素純度，平行試驗5次。

1.2.7UPLC-MS的檢測

1.2.7.1色譜條件

流動相A：0.5%甲酸水溶液；流動相B：乙腈；洗脫參數見表2。

表2　梯度洗脫參數Table 2　Gradient elution parameters

1.2.7.2質譜方法

掃描方式：正離子掃描；氣溫：325℃；氣流量：6 L/min。

2　結果與分析

2.1靜態(tài)吸附與解吸試驗結果

2.1.1大孔樹脂的選擇結果

3種型號大孔樹脂對黑豆皮花青素的吸附率及解吸率如表3所示。

表3　3種型號大孔樹脂對黑豆皮花青素的吸附率及解吸率Table 3　The adsorption and desorption rate of 3 types of macroporous resin on black soybean hull anthocyanin

由表3可知，3種型號的大孔樹脂中，DM301的吸附率最高，解吸率最低，但與另兩種相差不大，HPD-417的解吸率最高，吸附率居中，因此，綜合考慮，選取DM301和HPD-417兩種大孔樹脂以不同比例組合，進行試驗。

DM301和HPD-417大孔樹脂組合對黑豆皮花青素的吸附率及解吸率如表4所示。

表4　DM301和HPD-417大孔樹脂組合對黑豆皮花青素的吸附率及解吸率Table 4　The adsorption and desorption rate of combination of DM301 and HPD-417 macroporous resin on black soybean hull anthocyanin

由表4可知，DM301∶HPD-417為4∶1（質量比）時吸附率最高，且解吸率與最高的解吸率相差不大，綜合考慮各大孔樹脂組合比例的吸附率與解吸率，選擇DM301∶HPD-417為4∶1（質量比）進行試驗。

2.1.2乙醇溶液體積分數的選擇結果

乙醇溶液體積分數對解吸率的影響見圖1。

圖1　乙醇溶液體積分數對解吸率的影響Fig.1　Effect of ethanol solution volume fraction on the desorption rate

由圖1可知，乙醇溶液體積分數為65%時，解吸效果最好。這是由于低濃度的乙醇溶液極性偏大，不能將大孔樹脂中黑豆皮花青素充分解吸，解吸效果較差，而高濃度的乙醇解吸率并無明顯提高，而解吸成本卻在增加，從節(jié)約成本及解吸效果角度講，65%的乙醇溶液是較好的選擇。

2.1.3解吸液pH的選擇結果

解吸液pH對解吸率的影響見圖2。

圖2　解吸液pH對解吸率的影響Fig.2　Effect of desorption agent pH on the desorption rate

由圖2可知，pH 3.5時，解吸液乙醇溶液對大孔樹脂中黑豆皮花青素的解吸效果最好，這是由于pH小于3.5時，被解吸出來的花青素結構可能遭到破壞，而pH大于3.5時，黑豆皮花青素不能被充分解吸出來，這都使解吸率有所降低。

2.2動態(tài)柱層析試驗結果

2.2.1上樣流速的選擇結果

上樣流速對吸附效果的影響見圖3。

圖3　上樣流速對吸附效果的影響Fig.3　Effect of flow rate on adsorption

由圖3可知，當上樣流速在0.5 mL/min～1.5 mL/min時，流速越低吸附效果越好，但吸附率相差不大，當流速大于1.5 mL/min時，吸附率有明顯下降，吸附效果不理想。因此，從節(jié)約成本角度出發(fā)，1.5 mL/min是較好的選擇，但如果比較重視吸附效果時，可采取較低的流速0.5 mL/min。

2.2.2洗脫流速的選擇結果

洗脫流速對洗脫效果的影響見圖4。

圖4　洗脫流速對洗脫效果的影響Fig.4　Effect of flow rate on elution

由圖4可知，0.5 mL/min～1.5 mL/min時，乙醇溶液對大孔樹脂中吸附的黑豆皮花青素的解吸率相差不大，解吸效果相當，當洗脫流速大于1.5 mL/min時，解吸率明顯下降，解吸效果較差。因此，從節(jié)約成本角度出發(fā)，可選擇1.5 mL/min的流速進行洗脫。

2.3驗證性試驗結果

5次試驗得到的花青素純度分別為82.14%、83.68%、82.75%、81.59%、84.02%。經計算，其標準差為0.009 119，變異系數為0.011 009，二者數值都較小，說明上述純化方法的重復性較好。

2.4UPLC-MS檢測結果

UPLC-MS檢測結果見圖5。

由圖5可知，一級MS檢測到花青素主要成分分子量為449.1，以449.1為母離子進行二級MS檢測，檢測到分子量為287.1的子離子，因此，純化后的黑豆皮花青素主要成分為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷。

圖5　UPLC-MS檢測結果Fig.5　The result of UPLC-MS detection

3　結論

采用大孔樹脂組合對黑豆皮花青素粗提物進行柱層析，適宜條件下，純化后的黑豆皮花青素純度較高，且主要成分為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷。

［1］常汝鎮(zhèn).中國黑豆資源及其營養(yǎng)和藥用價值［J］.中國食物與營養(yǎng)，1998（5）：38-39

［2］馬銅鎖，陳連文.黑豆色素的提取及理化性質的研究［J］.山西食品工業(yè)，2004，2（6）：19-21

［3］Narayan M S，Naidu K A，Ravishankar G A，et al.Antioxidant effect of anthocyanin on enzymatic and non-enzymatic lipid peroxidation［J］.Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids，1999，60（1）：1-4

［4］A Degenhardt.Separation and Purification of Anthocyanins by High-Speed Countercurrent Chromatography and Screening for Antioxidant Activity［J］.J Agric Food Chem，2000，48（2）：338-343

［5］Cignarella A，Nastasi M，Cavalli F，et al.Novel lipid-lowering properties of Yaccinium myrtillus L.leaves，atraditional antidiabetic treatment，in several models of ratdyslipidaemia：a comparison with ciprofibrate［J］.Thromb Res，1996，84（5）：311-322

［6］Gary Woodward，Paul Kroon，A edin Cassidy.Anthocyanin Stability and Recovery：Implications for the Analysis of Clinical and Experimental Samples［J］.Agricultural Food Chemistry，2009，57（12）：5271-5278

［7］Pacheco-Palencia L A，Talcott S T.Chemical stability of acai fruit（Euterpe oleracea Mart）anthocyanins as influenced by naturally occurring and externally added polyphenolic cofactors in model systems［J］.Food Chemistry，2010，118（1）：17-25

［8］TSUDA T.Antioxidative activity of anthocyanin pigments cyanidin3-o-β-D-glucoside and cyandin［J］.J Agrc Food Chem，1994，42：2407-2410

［9］LAPIDOT T，HUREL S，ARIRI B，et al.pH-dependent fornls of red wine anthocyanins as antioxidants［J］.J Agrc Food Chem，1999，47：67-70

［10］矯曉麗，董琦，遲曉峰，等.大孔樹脂分離純化藏藥白花龍膽花總黃酮的研究［J］.離子交換與吸附，2012，28（3）：231-239

［11］王巧娥，錢潔，任海毅，等.黑米花色苷的分離純化及其抗氧化性的研究［J］.食品工業(yè)科技，2015（2）：79-84

［12］郭慶啟，張娜，付立營，等.大孔樹脂法純化樹莓花色苷及初步鑒定［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36（6）：171-174

［13］趙麗萍，江巖.花青素分離純化方法研究進展［J］.食品工業(yè)，2014，35（4）：133-136

［14］王秋霜，凌彩金，劉淑媚，等.花青素分離純化及其組分鑒定研究進展［J］.食品工業(yè)科技，2013（3）：358-364

［15］劉金平，湯樹良，袁航，等.組合樹脂技術純化葛根中葛根素工藝研究［J］.天津藥學，2013，25（4）：8-11

Study on the Process of Macroporous Resin Isolate and Purify Anthocyanin from Black Soybean Hull

WU Yan-li，DING Zhi-en*，YAN Han，DONG Min，CHANG Hui，KANG Jin-xiu
（Anhui Agricultural University，Hefei 230036，Anhui，China）

Different macroporous resins have different abilities of adsorption for anthocyanin.According to the characteristics of anthocyanin and the characteristics of macroporous resin，three different types of macroporous（DM301，ADS-17，HPD-417）resins were selected in this experiment.，the adsorption rate α and desorption rate β were act as evaluation index，two kinds of macroporous resins were selected for adsorption and desorption experiment of black soybean hull anthocyanin extracts.At last，use UPLC-MS to detect the purified anthocyanin.The results showed that The best resin ratio combination is 4∶1 for DM301：HPD-417，the ethanol volume fraction 65%，the desorption liquid pH3.5，the dynamic adsorption on the sample flow rate 0.5 mL/min，the desorption flow rate 1.5 mL/min，the main component of the purified anthocyanins is Cyanidin-3-O-glucoside.

black soybean hull；extraction；anthocyanin；macroporous resin；combination；purification；detection

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.21.012

吳艷立（1989—），女（漢），碩士，主要研究方向：食品資源開發(fā)與利用。

丁之恩（1956—），男（漢），教授，主要研究方向：經濟林及產品加工的教學與研究。

2015-12-28