固本補(bǔ)腎口服液的總黃酮含量測(cè)定方法研究

韋瑀龍，黃小鷗，藍(lán)曉慶

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固本補(bǔ)腎口服液的總黃酮含量測(cè)定方法研究

韋瑀龍1，黃小鷗1，藍(lán)曉慶2

目的 建立固本補(bǔ)腎口服液總黃酮的含量測(cè)定方法。方法 比較HCl-Mg法、AlCl3法、NaNO2-AlNO3-NaOH法3種不同顯色方法，以及槲皮素、淫羊藿苷、蘆丁3種對(duì)照品的波長(zhǎng)掃描圖譜，確定測(cè)定條件。結(jié)果 以NaNO2-AlNO3-NaOH法顯色，蘆丁為對(duì)照品，508 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定，蘆丁在0.105 5～1.107 5 mg/mL間線性關(guān)系良好(R2=1.000 0)，樣品平均回收率98.83% (RSD=1.17%)。結(jié)論 NaNO2-AlNO3-NaOH法顯色適用于固本補(bǔ)腎口服液總黃酮含量的初步測(cè)定。

固本補(bǔ)腎口服液；總黃酮；NaNO2-AlNO3-NaOH顯色

0 引言

固本補(bǔ)腎口服液由黃芪、淫羊藿、枸杞、桑寄生、麥冬、牛膝、菟絲子、杜仲、黃精組方而成，具有固本培元、補(bǔ)腎生精等功效，主要用于腎虛陽(yáng)痿、早泄、精液異常，為廣西名老中醫(yī)荀建寧教授臨床驗(yàn)方，其主要藥味黃芪、淫羊藿、桑寄生的主要化學(xué)成分之一均為黃酮。本文擬通過(guò)研究固本補(bǔ)腎口服液中總黃酮的含量測(cè)定方法，為建立其質(zhì)量控制方法奠定基礎(chǔ)。近年來(lái)金屬離子絡(luò)合法已成為測(cè)定總黃酮含量應(yīng)用最廣泛的方法，其原理是在一定條件下，金屬離子與黃酮發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，形成有顏色的螯合物，用比色法測(cè)定總黃酮的含量，其最常用的顯色方法有HCl-Mg法、AlCl3法、NaNO2-AlNO3-NaOH法，本文通過(guò)對(duì)這3種方法條件下槲皮素、淫羊藿苷、蘆丁3種對(duì)照品的考察，建立適用于本品的總黃酮含量測(cè)定方法。

1 儀器與試藥

CQ-250超聲波清洗機(jī)(上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠)，53WBI微機(jī)型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司)，電子分析天平(GR-202，日本)，槲皮素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100081-200907)，淫羊藿苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：0737-9910)，蘆丁對(duì)照品(成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-15091104，供UV測(cè)定用)，固本補(bǔ)腎口服液(廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院制劑室，20 mL/支，批號(hào)：20151222、20151226、20151228)，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備 精密吸取本品4.0 mL，置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取稀釋液1.0 mL置10 mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻，離心，取上清液，即得。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對(duì)照品42.1 mg，置100 mL量瓶中，加70%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.421 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3 測(cè)定法 精密吸取供試品溶液2.0 mL置25 mL 量瓶中，加水至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以未加入硝酸鋁顯色的上述樣品液為參比空白，立即在508 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(蘆丁對(duì)照品的測(cè)定以相應(yīng)的試劑為空白)。

2.4 顯色方法及對(duì)照品考察

2.4.1 HCl-Mg法[1]精密吸取蘆丁、淫羊藿苷(0.420 mg/mL)、槲皮素(0.440 mg/mL)對(duì)照品溶液及供試品溶液各1.0 mL，分別置于加有鎂粉300 mg的試管中，將試管置冷水浴(約15 ℃)中，緩慢滴加濃鹽酸3 mL并不時(shí)振搖試管，加70%乙醇補(bǔ)足至10 mL，搖勻，置沸水浴中加熱約15 min，取出，迅速冷卻至室溫，以相應(yīng)試劑為空白，于400～700 nm 進(jìn)行波長(zhǎng)掃描。結(jié)果蘆丁、淫羊藿苷與供試品在此波長(zhǎng)段有相近的吸收峰值。但多次預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，該反應(yīng)過(guò)程劇烈，反應(yīng)液中含有的乙醇更使反應(yīng)結(jié)果的重復(fù)性難以控制。同時(shí)，該法對(duì)多數(shù)異黃酮類成分不顯色[2]，這與本品的主要藥味-黃芪主要含異黃酮類成分不相符[3]，故不宜采用此法作為本品總黃酮的測(cè)定方法。

2.4.2 AlCl3法[4]取“2.4.1”項(xiàng)下的供試品溶液、對(duì)照品溶液各1.0 mL，分別置于20 ℃水浴鍋中放置的10 mL量瓶中，加入0.1 mol/L AlCl3溶液3 mL，然后加入1 mol/L NaAc溶液4 mL，反應(yīng)2 min后取出，用70%乙醇定容，待溶液溫度降至室溫，供試品以未加AlCl3溶液的上述供試品測(cè)定液作為空白，對(duì)照品以相應(yīng)的試劑為空白，在400～700 nm 掃描。結(jié)果蘆丁與槲皮素在417 nm有最大吸收，而供試品在此波長(zhǎng)段無(wú)吸收峰。

2.4.3 NaNO2-AlNO3-NaOH法[5]取“2.4.1”項(xiàng)下的供試品溶液、對(duì)照品溶液各2.0 mL置25 mL量瓶中，加水至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，供試品以未加AlCl3溶液的上述供試品測(cè)定液作為空白，對(duì)照品以相應(yīng)的試劑為空白，立即在400～700 nm掃描。結(jié)果供試品與蘆丁在500 nm左右皆有吸收峰，且峰形對(duì)稱(見(jiàn)圖1)，而槲皮素、淫羊藿苷在此波長(zhǎng)段無(wú)吸收峰。蘆丁吸收峰值508 nm，供試品吸收峰值495 nm，故選擇以蘆丁為對(duì)照品在508 nm處測(cè)定供試品吸光度。

圖1 NaNO2-AlNO3-NaOH顯色波長(zhǎng)掃描圖譜

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性范圍考察 精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mL，分別置25 mL量瓶中，照“2.3”項(xiàng)下的方法，自“加水至6 mL”起依法操作，測(cè)定吸光度，以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=0.881 28X-0.000 01，R2=1.000 0，表明蘆丁在0.105 5～1.107 5 mg/mL線性關(guān)系良好。

2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品測(cè)定液，測(cè)定吸光度，結(jié)果總黃酮含量RSD=1.36%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.5.3 精密度試驗(yàn) 取同一供試品測(cè)定液連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果RSD=0.46%，表明儀器精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品測(cè)定液于0、5、10、15 min測(cè)定吸光度，結(jié)果RSD=2.07%，表明供試液在15 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取已知總黃酮含量(7.290 mg/mL)的樣品溶液4.0 mL，置10 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密吸取稀釋液0.5 mL置10 mL量瓶中，再精密加入蘆丁對(duì)照品1.684 mg，照“2.3”項(xiàng)下的方法，自“加水至6 mL”起依法操作，以上述未加硝酸鋁溶液的試液為參比空白測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.6 樣品測(cè)定 取3批固本補(bǔ)腎口服液，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.3”項(xiàng)下方法依法顯色、測(cè)定總黃酮含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

NaNO2-AlNO3-NaOH法顯色原理：亞硝酸鈉還原被氧化的酚羥基，使其能與鋁離子絡(luò)合，并提供一個(gè)堿性環(huán)境(酸性環(huán)境中鋁離子不與鄰二酚羥基絡(luò)合)，絡(luò)合之后，產(chǎn)生一個(gè)穩(wěn)定的特征吸收峰，再加入氫氧化鈉使酚羥基解離，形成p-π共軛，使吸收峰紅移至可見(jiàn)光區(qū)，避免雜質(zhì)干擾(雜質(zhì)不紅移)。鄰二酚羥基是該反應(yīng)的關(guān)鍵功能基團(tuán)，而且鄰二酚羥基的鄰位無(wú)取代基也是必需條件之一[6]。

供試品溶液NaNO2-AlNO3-NaOH顯色后，穩(wěn)定性較差，顯色后室溫下放置5、10、15 min后，吸光度分別降低0%、2.0%、4.3%，15 min時(shí)RSD>2%，因此，顯色后應(yīng)盡快測(cè)定樣品。這與《中國(guó)藥典》中采用該法測(cè)定總黃酮時(shí)，要求顯色完成后“立即照紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定”相符，而與部分文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)不一致[7-8]。

表2 三批樣品測(cè)定結(jié)果

中藥供試品往往因成分復(fù)雜，不經(jīng)顯色處理在測(cè)定波長(zhǎng)下也有一定的吸光度，依據(jù)本法的顯色原理，文中采用未加絡(luò)合離子(AlNO3)的供試品溶液作為供試品測(cè)定液的空白，以消除本底及其他成分對(duì)亞硝酸鈉、氫氧化鈉顯色的影響。

[1] 黨曉芳,曹颯,祁娟娟,等.鬼箭羽總黃酮含量測(cè)定方法的建立[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2014,20(9):96-98.

[2] 匡海學(xué).中藥化學(xué)[M].北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社,2011.

[3] 李春紅,田吉,何兵,等.紫外分光光度法測(cè)定黃芪總黃酮的含量[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2011,36(8):954-956.

[4] 張明,陳華國(guó),趙超,等.杠板歸中總黃酮的含量測(cè)定[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2012,18(18):77-80.

[5] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015.

[6] 郭亞健,范莉,王曉強(qiáng),等.關(guān)于NaNO2-AlNO3-NaOH比色法測(cè)定總黃酮方法的探討[J].藥物分析雜志,2002,22(2):97-99.

[7] 李春紅,田吉,何兵,等.紫外分光光度法測(cè)定黃芪總黃酮的含量[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2011,36(8):954-965.

[8] 常飛,吳文能,曹暉.白補(bǔ)藥總黃酮含量測(cè)定該法的建立[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),2016,28(82):71-76.

Optimization of determination for total flavonoids in Guben bushen oral liquid

WEI Yu-long1,HUANG Xiao-ou1,LAN Xiao-qing2

(1.Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning 530001,China;2.Guangxi Jia Ye Technology Co.Ltd,Nanning 530001,China)

Objective To establish a method for the determination of the content of total flavonoids in Guben bushen oral liquid.Methods Both three coloration methods and three

ubstances were studied to find the ideal coloration method and determination conditions.Results The sample was detected at 508 nm wavelength by NaNO2-AlNO3-NaOH reaction with Botanic as reference substance.Botanic had a liner relationship with absorbance in the range of 0.105 5～1.107 5 mg/mL(R2=1.000 0),and the average recovery rate was 98.83% withRSDof 1.17%.Conclusion The NaNO2-AlNO3-NaOH coloration method is applicable for the determination of total flavonoids in Guben bushen oral liquid.

Guben bushen oral liquid;Total flavonoids;NaNO2-AlNO3-NaOH coloration method

2016-03-08

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，南寧 530001；2.廣西佳業(yè)科技有限公司，南寧 530001

廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科技專項(xiàng)(GZZJ13-11)

10.14053/j.cnki.ppcr.201610020