復發(fā)難治B系淋巴瘤CAR-T治療后細胞因子變化

蔣卉男，王洪濤，李迎春，張 歡，劉卓剛

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復發(fā)難治B系淋巴瘤CAR-T治療后細胞因子變化

蔣卉男，王洪濤，李迎春，張 歡，劉卓剛*

目的 分析于我中心行CAR-T治療患者治療前后細胞因子變化，評估相關細胞因子在免疫治療中的作用及相關機制。方法 分別在復發(fā)難治B系淋巴瘤患者CAR-T細胞回輸前及回輸后4、7、14 d采集外周血，利用流式細胞術監(jiān)測患者相關細胞因子(Th1、Th17、Foxp3、TNF-α、TGF-β、IL-10、IFN-γ、T抑制細胞、NK細胞及CRP)水平，分析變化趨勢。結果 4次CAR-T細胞回輸數(shù)目分別為：8×107、10×107、9.6×107、10×107。CAR-T細胞回輸前及回輸后4、7、14 d，Th1、Th17及CRP變化趨勢與臨床療效相關，NK細胞、CD8+細胞未見明顯相關性，而Tregs細胞作用尚未明確。結論 應用CAR-T細胞回輸后，Th1、Th17相關效應性T細胞細胞因子上升趨勢與臨床療效密切相關，NK細胞、CD8+T細胞未見明顯相關性，而Tregs細胞作用尚未明確。關于CAR-T治療前后序貫治療、移植與CAR-T治療的關系，是否可以應用細胞因子制劑促進CAR-T細胞的擴增與效應，仍有待進行相關大樣本臨床研究。

復發(fā)難治B系淋巴瘤；CAR-T；細胞因子

0 引言

嵌合抗原受體轉(zhuǎn)導的T細胞(Chimeric antigen receptor T cells，CAR-T)是一類能夠同時具有抗體特異性靶向識別的特點以及T細胞強大的效應機制的基因工程細胞。鑒于CAR-T不依賴MHC限制性、無需抗原呈遞、雙信號系統(tǒng)激活、共刺激作用等特點，避開傳統(tǒng)腫瘤耐受機制，可用于化療耐藥、酪氨酸激酶抑制劑耐藥以及造血干細胞移植后復發(fā)、供者細胞輸注無效的病例。CAR 由胞外特異性腫瘤抗原識別區(qū)、鉸鏈、跨膜區(qū)及胞內(nèi)信號傳導域4個部分組成。其中，胞外特異性腫瘤抗原識別區(qū)結合了針對腫瘤細胞抗原特異性抗體的抗原識別區(qū)的重鏈及輕鏈，能夠直接識別腫瘤相關抗原，進而通過胞內(nèi)信號域傳導信號、活化效應T細胞產(chǎn)生特異性抗腫瘤效應。CAR通過基因工程的方法表達于T細胞表面，通過體外擴增后過繼輸注給患者體內(nèi)的療法稱為CAR-T療法?；罨蟮腃AR-T細胞能夠分泌多種細胞因子對抗腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制，從而提高T細胞的抗腫瘤效應。CAR-T作為新興免疫治療方法從開展以來就受到了國內(nèi)外的廣泛關注，其療效評估更是廣大研究者的討論熱點。我中心擬評估復發(fā)難治B系淋巴瘤患者CAR-T治療后相關細胞因子表達對腫瘤細胞的影響，同時研究其作用機制，進而指導臨床治療。

1 研究對象

患者，男，41歲，于2013年10月發(fā)現(xiàn)雙側(cè)頸部腫大，伴盜汗、納差，行骨髓穿刺術及左側(cè)頸部淋巴結活檢術，確診慢性淋巴細胞白血病轉(zhuǎn)化為非霍奇金淋巴瘤(彌漫大B細胞型，非生發(fā)中心型)Ritcher綜合征Ⅳ期B組IPI4分。行PET-CT示病灶侵及雙側(cè)頸部、雙側(cè)頜下、雙側(cè)鎖骨上淋巴結、雙側(cè)腋窩淋巴結，鼻咽、右側(cè)咽旁間隙、縱隔、雙肺門淋巴結、胰腺后方、腹主動脈淋巴結、雙側(cè)盆壁、雙側(cè)腹股溝淋巴結，SUV介于2.4～6.3，并有骨髓浸潤，SUVmax=4.5。行R-CHOP方案化療5個周期(第1次應用美羅華后包塊明顯減小)，第3周期化療前復查骨髓象有核細胞形態(tài)未見明顯異常，療效判定為PR。后行HyperCVAD-MA方案2個周期，出現(xiàn)Ⅳ度骨髓抑制；R-GEMOX方案2個周期，GEMOX方案1個周期。之后于2014年10月腋下新發(fā)包塊提示疾病復發(fā)，行美羅華聯(lián)合化療2個周期，無好轉(zhuǎn)，再次行PET-CT檢查，提示：右腋窩多枚腫大淋巴結，F(xiàn)DG代謝水平異常升高，較大者3.0 cm×1.7 cm，SUVmax=5.6；雙肺下葉FDG高代謝灶，SUVmax=4.6，考慮淋巴瘤浸潤；左側(cè)髂骨及骶骨近左側(cè)骶髂關節(jié)處局部骨質(zhì)呈FDG異常高代謝，SUVmax=5.8；部分小腸、乙狀結腸及直腸腸壁略厚，腸壁及腸腔內(nèi)FDG代謝水平較高，SUVmax=8.7。

2015年3月患者為行CAR-T細胞治療前往我中心診治。患者入院時右側(cè)腋下觸及腫大淋巴結，質(zhì)硬，無觸痛，大小約17 cm，無活動性，其余查體無明顯異常，周身疼痛明顯。該患者分別于2015年3月10日、3月13日、5月12日、5月19日于我中心輸注CD19標靶的CAR-T細胞，回輸前3 d予FC方案預處理。具體用藥：氟達拉濱30 mg/m2(3d)，環(huán)磷酰胺150 mg/m2(d2～d3)，回輸細胞量分別為：8×107、10×107、9.6×107、10×107?；颊哂诘?次回輸后第4天即發(fā)現(xiàn)腋下包塊明顯減小，回輸后第8天出現(xiàn)高熱，體溫超過39 ℃，予退熱栓退熱，伴腹瀉2 d及咽喉部不適，對癥處理后上述癥狀好轉(zhuǎn)。第3次回輸后第8天出現(xiàn)發(fā)熱，最高38 ℃，伴咽喉部不適，發(fā)熱1 d后癥狀好轉(zhuǎn)。4次細胞回輸后患者于2015年6月8日再次行PET-CT提示，原腋窩FDG高代謝淋巴結本次掃面明顯減小，SUVmax=1.2；原雙肺下葉近胸膜下類圓形FDG高代謝灶，本次掃描消失；原髂骨、骶骨及骶髂關節(jié)處FDG高代謝灶，本次掃描明顯減低，SUVmax=3.1。行骨髓穿刺術提示，未見淋巴瘤細胞，評估患者療效達到PR。之后患者于2015年8月在我院行自體造血干細胞移植，現(xiàn)患者狀態(tài)平穩(wěn)，病情控制穩(wěn)定，生活質(zhì)量良好。

2 方法

本中心分別于患者CAR-T細胞回輸前及回輸后4、7、14 d采集外周血，利用流式細胞術監(jiān)測患者相關細胞因子水平。

3 結果

患者4次CAR-T細胞輸注數(shù)量見表1，流式細胞術監(jiān)測細胞因子水平變化見表2。

表1 患者4次輸注CAR-T細胞數(shù)量

由表2可見，Th1、Th17相關效應性T細胞細胞因子及CRP變化趨勢與臨床療效相關，NK細胞、CD8+細胞未見明顯相關性，而Tregs細胞作用尚未明確。

4 討論

腫瘤相關的免疫治療在近幾年的腫瘤治療中取得了突飛猛進的進展。腫瘤微環(huán)境的免疫平衡理論受到關注，免疫增強因子的減少與免疫抑制因子的增多成為腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素，并由此產(chǎn)生了靶向治療腫瘤的新方法。

近年來，CAR-T在免疫治療中的作用得到學者的關注。CAR-T治療后GM-CSF的表達[1]，聯(lián)合IFN-r、IL-6、CRP，腫瘤大小，已被證實為評估CAR-T療效的重要依據(jù)。我中心通過1例治療成功CAR-T患者案例得出初步結論，應用CAR-T細胞回輸后，Th1、Th17相關效應性T細胞細胞因子上升趨勢與臨床療效密切相關，NK細胞、CD8+T細胞未見明顯相關性，而Tregs細胞作用尚未明確。

表2 CAR-T輸注前后細胞因子監(jiān)測

注：—由于外周血中細胞含量少，通過流式細胞術檢測未獲得

研究顯示，T細胞通過不同的分化途徑生成不同T細胞，產(chǎn)生特殊性能。CD4+T細胞亞群中[2]，Thl主要分泌IL-2、IFN-γ和 TNF等，Th2主要分泌IL-4、IL-5、 IL-10、IL-13等。正常穩(wěn)態(tài)下，機體 Th1/Th2 處于平衡狀態(tài)，若平衡失調(diào)則稱為Th1/Th2漂移。在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中，免疫格局多偏向 Th2，削弱Th1，有助于腫瘤細胞的免疫逃逸[3]。若能通過免疫治療逆轉(zhuǎn)這種漂移狀態(tài)，則可以對腫瘤細胞起到強有力的殺傷作用[4-5]。本研究中，針對復發(fā)難治B系腫瘤患者，T細胞無法正常啟動、維持對腫瘤細胞及其他抗原的免疫應答。因此，將經(jīng)過基因工程處理的CAR-T細胞回輸至患者體內(nèi)，成功啟動免疫反應，可以克服體內(nèi)原有T細胞的功能缺陷，從而起到腫瘤殺傷作用。

CAR-T療法在產(chǎn)生腫瘤細胞殺傷作用的同時，也會因為細胞因子的過度釋放導致細胞因子風暴的發(fā)生。此時，患者可能會發(fā)生高熱、呼吸困難、急性呼吸窘迫綜合征、嚴重心律失常，甚至多器官功能衰竭。已有研究表明，CD19CAR-T可以產(chǎn)生劑量相關性急性細胞毒性作用，而且高水平分泌Th2可以誘導肉芽腫反應，從而產(chǎn)生慢性的細胞毒效應[6]。目前，已有研究發(fā)現(xiàn)，細胞因子風暴多與IL-6及IFN-γ等細胞因子的高循環(huán)水平相關。癥狀多于開始輸注細胞的數(shù)分鐘至數(shù)小時出現(xiàn)，癥狀出現(xiàn)的機會及嚴重程度與前期誘導藥物、機體免疫細胞活化程度及腫瘤負荷密切相關。在患者出現(xiàn)上述癥狀時，及時地判斷及處理尤為關鍵。主要的處理措施包括：①對癥治療：控制體溫在39 ℃以下，對于出現(xiàn)循環(huán)衰竭患者，注意循環(huán)支持及腎功能保護；②拮抗劑使用：出現(xiàn)低氧血癥的患者，可以給予TNFα拮抗劑及IL-6拮抗劑，用藥時注意低劑量起始，密切觀察藥物的后續(xù)免疫抑制作用；③處理腫瘤溶解綜合征：注意監(jiān)測患者血象、尿酸、腎功能及相關系統(tǒng)征象，水化、堿化治療。此外，同時，目前已有小分子制劑作為CAR-T細胞的自殺制劑應用于臨床，對于危及生命的細胞因子風暴反應或者長期B細胞功能缺陷的患者，可以應用該制劑撤除體內(nèi)CAR-T，終止CAR-T免疫反應。

在CAR-T產(chǎn)生的免疫反應中，Tregs是具有免疫調(diào)節(jié)功能的T細胞，能夠在免疫應答負調(diào)節(jié)以及自身免疫耐受中發(fā)揮重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn)[5]，腫瘤發(fā)生免疫逃逸的重要機制之一是Tregs對抗腫瘤免疫應答的抑制作用。因此，降低腫瘤患者體內(nèi)Tregs的表達或降低其活性可能提高免疫治療的療效。且已有研究表明，在彌漫大B細胞淋巴瘤患者中，高水平的Tregs細胞與CD4/CD8比值較低、不成熟樹突狀細胞增多正相關，預示不良預后[7]；另有研究證實，在慢性淋巴細胞白血病、急性髓細胞白血病患者中，Tregs可以作為量化預后的指標[8]，代表Tregs的CD4、CD25、CD127在常規(guī)實驗室即可化驗，其高低與患者預后、化療達到CR的時間成正比。目前，已有研究者重點研究利用Tregs細胞提供的微環(huán)境，在繼免疫治療自身免疫疾病和異基因造血干細胞移植后出現(xiàn)的排斥反應。同時，在腫瘤治療方面，已經(jīng)出現(xiàn)可以改變Tregs介導的局部免疫抑制微環(huán)境的方法，如抑制可以促進Tregs分化的吲哚胺2,3-雙加氧酶1(IDO)，從而逆轉(zhuǎn)Tregs在腫瘤患者細胞中的增殖。

NK細胞是機體固有免疫反應中重要的效應細胞，與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)密切相關。NK細胞具有無需抗原致敏直接殺傷腫瘤細胞的作用[9]。其中，NKG2D是NK細胞產(chǎn)生殺傷作用的關鍵的活化型受體，其能夠識別腫瘤細胞過表達的NKG2D配體。Parkhurst等[10]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者自身的NK細胞具有和健康人相似的增殖性，但是這些細胞僅低水平表達NKG2D，并且需要外源IL-2二次活化，對腫瘤轉(zhuǎn)歸無明顯作用。Bachanova等[11]前期研究也證實了自體NK細胞對于腫瘤患者并無臨床療效。目前并沒有相關研究證實NK細胞與CAR-T作用前后的變化及相關意義。

腫瘤免疫治療雖然在近年來成為研究的熱點，但仍存在許多亟待解決的問題。免疫治療療效的評估及相關輔助用藥、治療機制仍尚不明確。本中心目前接受CAR-T治療的患者例數(shù)仍有限，尚不足以形成細胞因子評估預后量化標準，有待結合多中心治療結果系統(tǒng)評價。關于CAR-T治療的前后序貫治療、移植與CAR-T治療的關系、是否可以應用細胞因子制劑促進CAR-T細胞的擴增與效應仍有待進行相關大樣本臨床試驗，從而得出統(tǒng)計學數(shù)據(jù)，指導臨床治療方案的確定。

志謝：感謝北京美康優(yōu)娃生物科技有限公司為我中心提供CAR-T細胞制備的技術支持。

[1] Lorentzen CL,Straten PT.CD19-chimeric antigen receptor T cells for treatment of chronic lymphocytic leukaemia and acute lymphoblastic leukaemia[J].Scand J Immunol,2015,82(4):307-319.

[2] Bettelli E,Carrier Y,Gao W,et al.Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells[J].Nature,2006,441(7090):235-238.

[3] Feng P,Yan R,Dai X,et al.The alteration and clinical significance of Th1/Th2/Th17/Treg cells in patients with multiple myeloma[J].Inflammation,2015,38(2):705-09.

[4] Guo JR,Xu F,Jin XJ,et al.Impact of allogenic and autologous transfusion on immune function in patients with tumors[J].Asian Pac J Cancer Prev,2014,15(1):467-474.

[5] Jensen SM,Twitty CG,Maston LD,et al.Increased frequency of suppressive regulatory T cells and T cell-mediated antigen loss results in murine melanoma recurrence[J].J Immunol,2012,189(2):767-776

[6] Cheadle EJ,Sheard V,Rothwell DG,et al.Differential role of Th1 and Th2 cytokines in autotoxicity driven by CD19-specific second-generation chimeric antigen receptor T cells in a mouse model[J].J Immunol,2014,192(8):3654-3665.

[7] Chang C,Wu SY,Kang YW,et al.High levels of regulatory T cells in blood are a poor prognostic factor in patients with diffuse large B-cell lymphoma[J].Am J Clin Pathol,2015,144(6):935-944.

[8] Dasgupta A,Mahapatra M,Saxena R.A study for proposal of use of regulatory T cells as a prognostic marker and establishing an optimal threshold level for their expression in chronic lymphocytic leukemia[J].Leuk Lymphoma,2015,56(6):1831-1838.

[9] Cai LL,Yang Y,Yang B,et al.Short-term curative efficacy of autologous cytokine induced killer cells combined with low-dose il-2 regimen containing immune enhancement by thymic peptide in elderly patients with B-cell chronic lymphocytic leukemia[J].J Exp Hematol,2012,20(3):564-570.

[10]Parkhurst MR,Riley JP,Dudley ME,et al.Adoptive transfer of autologous natural killer cells leads to high levels of circulating natural killer cells but does not mediate tumor regression[J].Clin Cancer Res,2011,17(19):6287-6297.

[11]Bachanova V,Miller JS.NK cells in therapy of cancer[J].Crit Rev Oncol,2014,19(1-2):133-141.

Changes in cytokines after CAR-T treatment for relapsed and refractory B-cell lymphoma

JIANG Hui-nan,WANG Hong-tao,LI Ying-chun,ZHANG Huan,LIU Zhuo-gang*

(Department of Hematology,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110020,China)

Objective To investigate the effect and mechanism of the changes in cytokines after CAR-T treatment for relapsed and refractory B-cell lymphoma.Methods The blood of patients with refractory and relapsed B-cell lymphoma was collected before and at 4,7,14 d after CAR-T.The changes in cytokines were detected by flow cytometry.Results The number of the CAR-T cells was 8×107,10×107,9.6×107and 10×107,respectively.The changes in Th1,Th17 and CRP were related to the clinical efficacy,while no relationship was found between NK cells and CD8+cells,and the effect of Tregs was still not clear.Conclusion The upward of levels of Th1,Th17 and CRP is related to the clinical efficacy,while NK cells and CD8+cells has no relationship with it,and the relationship of Tregs with clinical efficacy is still not clear.Clinical trials with large sample size should be performed to clarify the relationship of sequential therapy before and after CAR-T and transplantation with CAR-T,and whether cytokines can promote the amplification efficiency.

Refractory and replased B-cell lymphoma;CAR-T;Cytokines

2016-01-20

中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院血液科，沈陽 110020

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201610017