姜黃素治療大鼠腦出血后血清IL-6、IL-1β、TNF-α變化的實驗研究

楊凡慧，曹齡之，黃曉紅，張春銀，楊朝鮮

（1.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院核醫(yī)學科，四川南充637000；2.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院核醫(yī)學科，四川瀘州646000；西南醫(yī)科大學神經(jīng)生物學研究室，四川瀘州646000）

姜黃素治療大鼠腦出血后血清IL-6、IL-1β、TNF-α變化的實驗研究

楊凡慧1，曹齡之1，黃曉紅1，張春銀2，楊朝鮮3

（1.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院核醫(yī)學科，四川南充637000；2.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院核醫(yī)學科，四川瀘州646000；西南醫(yī)科大學神經(jīng)生物學研究室，四川瀘州646000）

目的 本研究旨在探索大鼠腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）用姜黃素治療后血清IL-6、IL-1β、TNF-α變化情況，評價姜黃素在治療腦出血中的抗炎價值，從而為臨床應用姜黃素治療腦出血提供科學的實驗數(shù)據(jù)。方法 24只健康雄性成年SD大鼠，單純隨機分為術(shù)前正常對照組（A組），腦出血姜黃素治療組（B組），腦出血空白對照組（C組），假手術(shù)組（D組），每組6只大鼠。立體定位下右側(cè)基底節(jié)注射膠原酶法制備大鼠腦出血模型。于建模成功后6h、24h、48h、3d、5d、7d、14d，給各組大鼠尾靜脈取血測IL-6、IL-1β、TNF-α。將B組與C組、D組的IL-6、IL-1β、TNF-α值行兩樣本t檢驗比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果 B組的神經(jīng)生物學評分較相應時期的C組低，較相應時期的D組高，差異有統(tǒng)計學意義。B組的血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平在術(shù)后6h即升高，3d達最高水平，隨后開始逐漸恢復，且各個時期的血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平均較同時期C組低，較同時期的D組高，差異均有統(tǒng)計學意義。結(jié)果 姜黃素能加快大鼠腦出血后血清炎癥因子的吸收，對大鼠腦出血有抗炎作用。

腦出血； 姜黃素； IL-6； IL-1β； TNF-α

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是腦卒中最具破壞性的一種類型，在30天內(nèi)的病死率高達30% ～40%，一年內(nèi)的病死率達47%［1-2］。迄今為止尚未見有明確療效的方法治療該疾病，從而造成很大的社會問題和經(jīng)濟問題。姜黃素（curcumin，Cur）是從姜科植物姜黃（curcuma longa L.）中提取出來的一種酚類化合物，最新研究表明它有抗炎、抗氧化、神經(jīng)保護等作用［3］。本研究旨在觀察大鼠腦出血用姜黃素治療后血清炎癥因子白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）變化情況，評價姜黃素在治療腦出血中的抗炎價值，從而為臨床應用姜黃素有效治療腦出血提供科學的實驗數(shù)據(jù)。

材料與方法

1 動物

選取24只健康雄性成年SD大鼠（西南醫(yī)科大學動物中心提供，清潔級Ⅱ級，動物許可證號SCXK（川）2013-17），2～3月齡，體重250～350g。自由進食、進水，12h明暗交替光照。實驗過程均按西南醫(yī)科大學實驗倫理學要求進行，盡可能的減少動物的使用數(shù)量，最大程度的較少動物遭受的痛苦。

2 試劑

2.1姜黃素 購于成都格雷西亞化學技術(shù)有限公司。產(chǎn)品規(guī)格AR。分子式：C21H20O6。分子量：368.37?；瘜W性質(zhì)：橙黃色結(jié)晶粉末，溶于冰醋酸、乙醇，淺黃色沉淀和姜黃素在堿沉淀，在濃硫酸中有紅色和黃色的可溶性，不溶于水。貯存條件-20℃。溶解度（ethanol）：10 mg/mL。色指數(shù)：75300。熔點：183℃。密度：0.93。折射率：1.4155-1.4175。

2.2膠原酶Ⅳ 購于北京Solarbio科技有限公司提供。產(chǎn)品規(guī)格 BR。CAS號：9001-12-1。儲存條件-20℃。產(chǎn)品編號：C8160（分裝于C5138）。

3 儀器

3.1電動吸引器 類型：YB·DX30/0.09，由天津市醫(yī)療器械生產(chǎn)二廠生產(chǎn)。

3.2湘儀離心機 型號：DL-6M，尺寸：730cm ×840cm×1200cm，最大容量：6×1000mL，最大轉(zhuǎn)速6000r/min，儀器種類：大容量/低速冷凍，由湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司生產(chǎn)。

3.3γ放射免疫計數(shù)器 型號：SN-695，由上海核所日環(huán)光電儀器有限公司提供。

4 實驗方法

4.1大鼠腦出血模型制備 大鼠腦出血模型采用膠原酶Ⅳ緩慢注射右側(cè)基底節(jié)區(qū)出血模型。按照Takamatsu Y等［4］的方法進行改進，常溫下給予大鼠1%的戊巴比妥鈉（60mg/kg）腹腔內(nèi)麻醉，待呼吸平穩(wěn)后，俯臥位固定腦于立體定位儀上，保持前囟和后囟在同一水平，頭頂部剪毛、消毒，頭皮正中切口10mm，5μL微量進樣器固定在定位儀上，以前囟為原點，定位進針（前囟前0.2mm，頭尾正中線右側(cè)旁開3mm），并做一記號。取下微量進樣器，用顱鉆在記號處鉆孔達硬腦膜表面。5μL微量進樣器抽取Ⅳ型膠原酶2μL（0.125 U/μL），重新固定在腦立體定位儀上，沿著鉆孔進針，并以顱骨外板為零點垂直進針6mm。手動緩慢（0.5μL/min）將Ⅳ膠原酶溶液推注入基底節(jié)區(qū)，留針10min，緩慢退針（0.5μL/ min）。骨蠟封閉鉆孔，縫合頭皮，待大鼠蘇醒后放回籠子。術(shù)中無菌操作。

4.2實驗分組 建模成功后（神經(jīng)生物學評分在～3分），采用單純隨機抽樣法分組，將大鼠分為3組，即姜黃素治療組（B組），腦出血空白對照組（C組），假手術(shù)組（D組），每組6只大鼠。同時隨機選用6只同級別同月齡的正常大鼠作為正常對照組（A組）。①姜黃素治療組（B組）在腦出血模型成功后立即腹腔注射姜黃素（150mg/kg，2mL，姜黃素溶于玉米油）。②空白對照組（C組）腦出血建模后，以同等體積（2 mL）的玉米油給予腹腔注射，余操作同姜黃素治療組（B組）。③假手術(shù)組（D組）用0.9%的生理鹽水代替膠原酶Ⅳ，不予治療處理，余操作同腦出血姜黃素治療組（B組）。④正常對照組（A組）不予處理。

4.3神經(jīng)生物學評分 術(shù)后6h、24h、48h、3d、5d、7d、14d對各組大鼠行神經(jīng)生物學評分。采用神經(jīng)損傷嚴重缺損評分（neurological severity scores，NSS）［7］：0分：神經(jīng)功能正常；1分：輕度神經(jīng)功能缺損（提尾時左前肢屈曲）；2分：中度神經(jīng)功能缺損（行走時向左側(cè)旋轉(zhuǎn)）；3分：重度神經(jīng)功能缺損（行走時向左側(cè)傾斜）；4分：無自發(fā)行走，意識減退；5分：與出血有關(guān)的死亡

4.4炎癥因子的測定 于建模成功后6h、24h、48h、3天、5天、7天、14天，分別給A組、B組、C組、D組尾靜脈取血約1mL，離心（3500轉(zhuǎn)/分鐘）留血清，儲存在-20℃，用放射免疫法測IL-6、IL-1β、TNF-α（碘［125I］物理半衰期：60天）。

5 統(tǒng)計學處理

結(jié)果

1 實驗大鼠行為學評價結(jié)果

大鼠腦出血模型建成后大鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)精神癥狀，表現(xiàn)為精神萎靡不振，食欲欠佳，運動緩慢，左側(cè)肢體癱瘓，行走時向左側(cè)內(nèi)旋轉(zhuǎn)甚至伴有全身震顫等。神經(jīng)功能損害評分：單因素方差分析，F(xiàn)= 15.253，P＜0.05，說明四組大鼠神經(jīng)功能損害程度不全相同；姜黃素治療組（B組）在24h最嚴重，以后隨著時間的推移開始逐漸恢復，5d以后基本恢復正常，LSD法組間比較可知，姜黃素治療組（B組）比空白對照組（C組）各時間點的評分均低（P=0.002），比假手術(shù)組（D組）相應時間點評分均高（P= 0.042），差異均有統(tǒng)計學意義（表1、圖1）。

表1　神經(jīng)功能損害評分（±s）

表1　神經(jīng)功能損害評分（±s）

注：A組為正常對照組，B組為姜黃素治療組，C組為腦出血空白對照組，D組為假手術(shù)組；每組大鼠6只

組別6h24h48h3d5d7d14d A 0000000 B1.25±0.411.92±0.311.17±0.050.75±0.280.33±0.0900 C2.17±0.323.25±0.642.67±0.232.25±0.471.50±0.361.08±0.210.50±0.09 D0.42±0.030.17±0.0400000

2 炎癥因子結(jié)果

單因素方差分析，四組大鼠血清的IL-6、IL-1β、TNF-α水平分別不全相同，其F值依次為：11.380、24.078、15.067，均P＜0.05。姜黃素治療組（B組）的血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平在術(shù)后6h升高，3d達最高水平，隨后開始恢復，LSD法組間比較可知，姜黃素治療組（B組）各個時期的血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平均較同時期空白對照組（C組）低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；較假手術(shù)組（D組）高，差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）（表2、表3、表4和圖2、圖3、圖4）。

表2　I４L-6水平變化（±s）

表2　I４L-6水平變化（±s）

注：姜黃素治療組（B組）血清IL-6水平均較同時期空白對照組（C組）低，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.002）；較假手術(shù)組（D組）高，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.0220）

組別6h24h48h3d5d7d14d A125.48±5.12122.01±8.49134.28±14.93124.86±11.56122.30±11.91127.39±9.89125.97±9.52 B138.82±10.24158.17±11.33182.91±13.40208.24±18.12173.62±20.56127.80±9.4097.95±9.49 C181.77±16.64228.42±27.04245.89±28.41301.49±29.10225.31±20.15175.74±14.20151.34±6.32 D153.14±6.840137.17±11.00124.87±5.11131.43±12.59134.46±14.90125.31±15.03131.28±7.48

表3　IL-1β水平變化（±s）

表3　IL-1β水平變化（±s）

注：姜黃素治療組（B組）血清IL-1β水平均較同時期空白對照組（C組）低，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.0001）；較假手術(shù)組（D組）高，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.136）

組別6h24h48h3d5d7d14d A0.22±0.020.14±0.050.09±0.030.13±0.010.21±0.020.13±0.040.17±0.03 B0.42±0.070.31±0.080.22±0.100.56±0.130.32±0.060.23±0.040.16±0.05 C0.53±0.060.56±0.080.62±0.111.05±0.120.85±0.050.73±0.090.49±0.07 D0.36±0.050.25±0.040.14±0.060.22±0.030.19±0.030.16±0.020.15±0.06

表4　TNF-α水平變化（±s，fmol/mL）

表4　TNF-α水平變化（±s，fmol/mL）

注：姜黃素治療組（B組）血清TNF-α水平均較同時期空白對照組（C組）低，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.0001）；較假手術(shù)組（D組）高，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.218）

6h24h48h3d5d7d14d A23.39±2.0213.7±1.5617.65±1.4825.91±1.5220.40±0.9715.63±1.2218.74±1.34 B37.38±1.3628.02±1.2730.87±1.6734.23±2.0325.03±1.9720.11±1.4719.38±1.54 C43.78±2.1246.21±1.9650.59±2.2056.38±1.6749.37±1.8734.52±1.8626.62±2.05 D37.78±1.9925.52±1.5718.76±1.1322.23±2.0519.43±1.4817.82±1.9318.43±1.84

討論

腦出血后導致大腦的損傷有初次損傷和二次損傷，其中炎癥反應在二次損傷中起重要作用。腦出血后炎癥細胞被激活聚集，血液中的白細胞、紅細胞、巨噬細胞等直接滲透到大腦損傷部位，通過炎癥介質(zhì)的釋放、蛋白酶激活、小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的激活促發(fā)一系列炎癥反應［5］。有研究表明，大鼠腦出血后可引起血腫周圍腦組織繼發(fā)性炎癥損傷與激活的NF-kB息息相關(guān)［6］，因為Toll樣受體（tolllike receptor 4，TLR4）可通過跨膜結(jié)構(gòu)把信號轉(zhuǎn)導入細胞，引起一系列級聯(lián)信號反應，啟動TNF-α、IL-6、IL-1β等促炎細胞因子的表達［7］，而核因子-kB（nuclear factor-kappaB，NF-kB）位于TLR4下游信號通路的樞紐位置，其活化水平直接反映了TLR4的配體識別和信號傳導能力［8］。促炎細胞因子TNF-α、IL-1β等還可導致腦出血后血腦屏障的通透性的增高并加重血管源性腦水腫的發(fā)生［9］。且已有一些關(guān)于腦出血后血清中促炎細胞因子的臨床研究［10］，均表明急性期腦出血患者血清中TNF-α、IL-6、IL-1β等促炎細胞因子有不同程度的升高，其升高水平與腦出血疾病的嚴重程度及患者預后情況關(guān)系密切，但其作用機理尚不是很清楚。我們觀察到用姜黃素治療腦出血后6h到14d內(nèi)血清炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平均得到明顯改善，且差異有統(tǒng)計學意義。根據(jù)姜黃素治療前后大鼠腦出血模型中血清中TNF-α、IL-6、IL-1β等促炎細胞因子的變化規(guī)律，與相關(guān)的臨床研究結(jié)果聯(lián)系分析，可為TNF-α、IL-6、IL-1β等促炎細胞因子作為腦出血患者病情及預后狀況的檢測指標進入臨床做前期準備。

目前已有大量關(guān)于姜黃素治療腦出血的臨床研究和基礎(chǔ)研究，如陳秀［11］等研究表明姜黃素具有抗炎作用，對急性、亞急性和慢性炎癥都具有抗炎作用，可減輕炎性組織中的中性粒細胞浸潤，抑制炎性細胞前炎癥細胞因子，如TNF-α、IL-6、IL-1β的產(chǎn)生。King MD［12］等研究表明姜黃素通過減少促炎癥介質(zhì)、TNF-α、IL-6、IL-1β的表達，減輕血腦屏障的破壞及血管源性水腫，從而改善了腦出血治療情況。小神經(jīng)膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的炎癥細胞，過度激活的小神經(jīng)膠質(zhì)細胞可導致各種促炎細胞因子的釋放，如TNF-α、IL-6、IL-1β等［13］。有研究表明姜黃素通過抑制小神經(jīng)膠質(zhì)細胞和NF-kB的激活從而抑制TNF-α、IL-6、IL-1β等細胞因子的釋放，達到抗炎的作用［14］。

綜上，姜黃素作為一中古老的藥材，對腦出血后的抗炎作用是肯定的，隨著其治療機制的日趨完善，可向臨床治療轉(zhuǎn)化。姜黃素能加快腦出血后炎癥因子的吸收，對大鼠腦出血抗炎作用明確。

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（李 凌編輯）

The Effect of Curcumin on Inflammatory Factors in a Rat Model of Intracerebral Hemorrhage

YANG Fan-hui，CAO Ling-zhi，HUANG Xiao-hong，ZHANG Chun-yin，YANG Chao-xian
（Department of Nuclear Medicine，the Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College，Nanchong 637000，China）

Objective To investigate the changes of interleukin-6（IL-6，interleukin-1β（IL-1β）and tumor necrosis factor alpha（TNF-α）expressions in rats with intracerebral hemorrhage（ICH）after curcumin treatment. Toevaluate the therapeutic effect of curcumin and to provide scientificdatafor the clinical application of curcumin on ICH.Methods A total of 24 healthy adult male rats were randomly divided into 4 groups：normal group（group A），ICH+curcumin group（group B），ICH+vehicle group（group C），and sham operated group（group D），6 rats in each group.Animal ICH model was made by injecting collagenase 2μl（0.125 u/ul）into the right caudate nucleus of rats.Every rat was withdrew blood serum from the tail vien for IL-6、IL-1β、TNF-αat 6h，24h，48h，3d，5d，7dand14d after the model was built successfully following anesthesia.The data were analyzed by Student's t test to identify the changes of levels of IL-6，IL-1β and TNF-α between group B and group C，group B and the contralateral side，group B and group D.Results At the acute stage of ICH，the neurological severity scoresin group B was significantly lower than that in group C，and but it was higher than group D.In group B：After 6 h，the levels of IL-6，IL-1β，TNF-α increased and peaked at 3 d，and decreased at the next time points.Each time point of the levels of IL-6，IL-1β，TNF-α in group B was lower significantly than group C，and but it was higher than group D.Conclusion Curcuminshowedeffect of anti-inflammation on ICH.It might be related to the reduced the levels of IL-6，IL-1β and TNF-α after treatment.

Intracerebral hemorrhage； Curcumin； IL-6； IL-1β； TNF-α

10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.09.018

2016-03-18；

2016-04-23

四川省科學技術(shù)廳與瀘州市人民政府、瀘州醫(yī)學院聯(lián)合科研專項資金計劃項目（14JC0131）

張春銀，Email：zhangchunyin345@sina.com