熒光RT-PCR檢測(cè)與ELISA檢測(cè)在戊肝臨床診斷效果的比較分析

蔡潔新，楊立杰，趙振杰

（1.北京市房山區(qū)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京102400；2.北京市第一中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院泌尿外科，北京100026）

·綜述·

熒光RT-PCR檢測(cè)與ELISA檢測(cè)在戊肝臨床診斷效果的比較分析

蔡潔新1，楊立杰2，趙振杰1

（1.北京市房山區(qū)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京102400；2.北京市第一中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院泌尿外科，北京100026）

目的 探討和比較熒光RT-PCR檢測(cè)與ELISA檢測(cè)在戊肝臨床診斷的效果。方法 從我院健康體檢中心2013年1月至2016年1月的50500血清標(biāo)本中隨機(jī)選擇100份作為研究標(biāo)本。通過(guò)采用酶聯(lián)免疫法對(duì)戊肝抗體的檢測(cè)，然后再通過(guò)熒光RT-PCR檢測(cè)法進(jìn)行確診，觀察和比較兩組檢測(cè)方法的檢查結(jié)果。結(jié)果 陽(yáng)性一致率為55%，陰性一致率為100%，總一致率為75%，Kappa值為0.59（0.4＜Kappa≤0.75），表示兩者一致性一般。ELISA陽(yáng)性檢出率為30%，PCR陽(yáng)性檢出率為50%，PCR陽(yáng)性檢出率明顯高于ELISA，數(shù)據(jù)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P=0.000＜0.005。結(jié)論 熒光RTPCR檢測(cè)和ELISA檢測(cè)在戊肝的診斷中都具有一定的檢查準(zhǔn)確度，同時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)的陽(yáng)性檢出率明顯高于ELISA檢測(cè)。由于ELISA檢測(cè)容易受到各方面因素的影響而發(fā)生漏診的情況，因此建議對(duì)于ELISA檢測(cè)出現(xiàn)可疑的標(biāo)本，使用RT-PCR進(jìn)行確診，使更具可靠性。

熒光RT-PCR檢測(cè)； ELISA檢測(cè)； 戊肝； 臨床診斷

戊型肝炎（HE），屬于一種非甲非乙型病毒性肝炎，主要由戊型肝炎病毒感染所導(dǎo)致，其發(fā)病者不僅僅限于人類(lèi)，還包括牲畜，傳播途徑主要有糞、口途徑［1-3］。目前，戊型肝炎在世界各國(guó)都有發(fā)病，主要集中在亞、非、拉等發(fā)展中國(guó)家，多發(fā)于青壯年人群，病死率達(dá)到0.1%～4.0%，孕婦病死率甚至高達(dá)25%［4-5］?，F(xiàn)如今，臨床檢測(cè)戊型肝炎的主要方法包括血清學(xué)抗體ELISA、和RT-PCR病原學(xué)檢測(cè)。在本文中主要通過(guò)對(duì)我院戊型肝炎患者的診斷資料進(jìn)行回顧性分析，探討和比較熒光RT-PCR檢測(cè)與ELISA檢測(cè)在戊肝臨床診斷效果。

材料和方法

1 一般資料

從我院健康體檢中心2013年1月至2016年1月的50500血清標(biāo)本中隨機(jī)選擇100份作為研究標(biāo)本。

2 研究方法

2.1檢測(cè)方法 通過(guò)采用酶聯(lián)免疫法對(duì)戊肝抗體進(jìn)行檢測(cè)，然后再通過(guò)熒光RT-PCR檢測(cè)法進(jìn)行確診，對(duì)兩種方式的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。

2.2檢測(cè)儀器和試劑 酶聯(lián)免疫法試劑盒，上海科華試劑盒；Anthos2010酶標(biāo)儀器設(shè)備，北京普朗生產(chǎn)；RNA提取試劑盒，產(chǎn)自QIAGEN公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器（型號(hào)：CFX96Touch，廠家：美國(guó)BIO-RAD公司）。

2.3酶聯(lián)免疫檢測(cè)法 按照酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)的試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)患者的血清標(biāo)本HEV-IgM抗體進(jìn)行檢測(cè)。如果患者Cutoff值比OD值小或者相當(dāng)OD值，那么應(yīng)當(dāng)評(píng)定為陽(yáng)性；如果患者Cutoff值比OD值更大，那么評(píng)定為陰性［6］。操作兩次，前后兩次皆為陽(yáng)性確診為陽(yáng)性，皆為陰性確診為陰性，兩次結(jié)果不一致則列為可疑病例。

2.4熒光RT-PCR檢測(cè)法 首先提取戊肝RNA，在提取的過(guò)程中必須按照RNA試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，然后采用熒光RT-PCR檢測(cè)HEV-RNA［1-2］。

PCR引物設(shè)計(jì)的原則如下：GC含量范圍為30%～80%，不能有6個(gè)相同堿基，避免二級(jí)結(jié)構(gòu)，在75～200bp范圍的產(chǎn)物內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，保證引物tm值低于探針tm值的百分之十，最后進(jìn)行序列同源性檢驗(yàn)。引物與探針是上?；瞪锇凑諏?zhuān)利CN101122563 A合成。根據(jù)專(zhuān)利CN101122563 A的要求，反應(yīng)體系必須滿足以下幾點(diǎn)條件：熒光探針設(shè)置為150nmol/L；上下游引物分別選擇0.4 μmol/L；二硝基酚，量為0.3mmol/L；氯化鎂，量為2 5 mmol/L；選擇5μL模板，5×Real-Time PCR Buffer 5 μL，ExTaq HS 0.025 U/μL。擴(kuò)增環(huán)境需在94℃的環(huán)境中進(jìn)行預(yù)變性2min，一共需要經(jīng)歷45個(gè)循環(huán)。當(dāng)CT值＞45，則評(píng)定為陽(yáng)性［7］。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

對(duì)熒光RT-PCR檢測(cè)與ELISA檢測(cè)戊肝的一致性進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)，在參考值為0～1的范圍檢驗(yàn)。如果Kappa值為1，則熒光RT-PCR檢測(cè)與ELISA檢測(cè)戊肝完全一致；如果Kappa取值范圍在0.75～0.99之間，則表示熒光RT-PCR檢測(cè)與ELISA檢測(cè)戊肝具有較理想的一致性；如果Kappa取值范圍在0.4～0.75之間，則表示熒光RT-PCR檢測(cè)與ELISA檢測(cè)戊肝的一致性一般；如果Kappa取值范圍在0～0.4之間，則表示熒光RT-PCR檢測(cè)與ELISA檢測(cè)戊肝的一致性較差。對(duì)熒光RT-PCR檢測(cè)與ELISA檢測(cè)戊肝的結(jié)果是否存在差異進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)，數(shù)據(jù)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 ELISA檢測(cè)結(jié)果

在100例標(biāo)本中，ELISA結(jié)果陽(yáng)性30例，陽(yáng)性檢出率為30%，陰性50例，陰性率檢出率50%，可疑病例20例。

2 熒光PCR檢測(cè)結(jié)果

在100例標(biāo)本中，熒光定量PCR結(jié)果陽(yáng)性 55例，陽(yáng)性檢出率為55%，陰性45例，陰性檢出率45%。

3 ELISA檢測(cè)vs熒光PCR檢測(cè)

ELISA檢測(cè)和熒光PCR檢測(cè)都為陽(yáng)性的結(jié)果30例（30%），都為陰性的結(jié)果45例（45%），一共有25例檢測(cè)結(jié)果不一致。其中5例（5%）ELISA檢測(cè)為陰性，熒光PCR檢測(cè)為陽(yáng)性；20例（20%）ELISA檢測(cè)為可疑病例，熒光PCR檢測(cè)為陽(yáng)性。

對(duì)ELISA和PCR做Kappa檢驗(yàn)，評(píng)價(jià)二者的一致性，得到如下結(jié)果：陽(yáng)性一致率為55%（30/55），陰性一致率為100%（45/45），總一致率為75%（30 +45+0/100），Kappa值為0.59（0.4＜Kappa≤0.75），表示兩者一致性一般。

對(duì)ELISA和PCR的結(jié)果做卡方檢驗(yàn)，評(píng)價(jià)二者的陽(yáng)性檢出率，計(jì)算可得：ELISA陽(yáng)性檢出率為30%，PCR陽(yáng)性檢出率為55%，PCR陽(yáng)性檢出率明顯高于ELISA，數(shù)據(jù)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P= 0.000＜0.005。

討論

1 ELISA檢測(cè)在戊肝診斷中的應(yīng)用

酶聯(lián)免疫法（ELISA），又稱(chēng)之為固相酶聯(lián)免疫法，利用化學(xué)反應(yīng)連接檢測(cè)對(duì)象和酶，然后利用免疫反應(yīng)結(jié)合檢測(cè)對(duì)象和固相載體上的抗原，最后把底物加進(jìn)去，對(duì)其顯示的顏色進(jìn)行觀察，并且根據(jù)顏色的深淺程度對(duì)抗體的水平進(jìn)行判斷。酶聯(lián)免疫檢測(cè)法目前在戊肝檢測(cè)中應(yīng)用極為廣泛，該種方法能夠?qū)ξ旄尾《具M(jìn)行定性檢測(cè)，其靈敏度高，特異度高，并且檢查成本低廉，無(wú)污染［8-9］。根據(jù)本文研究結(jié)果可見(jiàn)，采用ELISA檢測(cè)戊肝，其存在20例弱陽(yáng)性病例，究其原因，通常而言，采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)法對(duì)急性期發(fā)病患者的血清抗HEV-IgM抗體進(jìn)行檢測(cè)，其抗HEV-IgM抗體明顯升高，以此為診斷HEV。然而，該種檢測(cè)方法受到一些因素的影響：其一，采集血液標(biāo)本的患者正好處于HEV窗口期，此時(shí)病毒尚未陽(yáng)轉(zhuǎn)；其二，在發(fā)病早期抗HEV-IgM抗體較低，患者對(duì)該種病毒不產(chǎn)生應(yīng)答。上述的情況是導(dǎo)致HEV病毒感染血清標(biāo)志物顯示為陰性的重要原因，容易導(dǎo)致漏診的發(fā)生。

2 抗原RT-PCR檢測(cè)在戊肝診斷中的應(yīng)用

因?yàn)楦腥緜€(gè)體HEV的含量并不是無(wú)限的，所以，可以通過(guò)對(duì)靶病毒進(jìn)行擴(kuò)增來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。抗原RT-PCR因此被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)戊肝抗原病毒。戊肝病原定性檢測(cè)主要用在確診HEV感染的過(guò)程中，需要使用兼并引物，并且需要根據(jù)毒株的保守序列對(duì)引物進(jìn)行設(shè)計(jì)引物，從而實(shí)現(xiàn)RT-PCR的擴(kuò)增目的［10-12］。根據(jù)本文研究結(jié)果熒光定量PCR結(jié)果陽(yáng)性55例，陽(yáng)性檢出率為55%，陰性45例，陰性檢出率45%，可疑病例為0?？梢?jiàn)，采用熒光定量RTPCR檢測(cè)技術(shù)對(duì)戊型肝炎病毒進(jìn)行檢測(cè)，不僅具有較高的準(zhǔn)確度，而且檢出迅速，靈敏度高，重復(fù)性良好，有利于在戊型肝炎病毒感染早期進(jìn)行快速診 斷［13-14］。

3 比較RT-PCR檢測(cè)與ELISA檢測(cè)在戊肝診斷中的應(yīng)用

根據(jù)本文研究可知，Kappa值為0.59（0.4＜Kappa≤0.75），這兩種方法在檢測(cè)戊肝方面一致性一般；同時(shí)，與 ELISA檢測(cè)對(duì)比，PCR陽(yáng)性檢出率明顯更高（P=0.000）。究其原因，對(duì)于戊肝多采用ELISA檢測(cè)血清中抗HEV-IgM，因?yàn)椴煌a(chǎn)產(chǎn)家使用的試劑盒有所區(qū)別，因此檢出率存在一定的差異，這是導(dǎo)致漏檢發(fā)生的原因之一。除此之外，采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)法檢測(cè)HEV感染會(huì)受到一些因素的限制，例如診斷抗原包含的抗原表位數(shù)量較少等，這些因素會(huì)對(duì)ELISA檢測(cè)的靈敏度和特異度造成不良的影響。而采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)則具有高靈敏度和特異度的優(yōu)點(diǎn)，并且檢出速度快，具有良好的重復(fù)性［15］。

綜上所述，熒光RT-PCR檢測(cè)和ELISA檢測(cè)在戊肝的診斷中都具有一定的檢查準(zhǔn)確度，同時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)的陽(yáng)性檢出率明顯高于ELISA檢測(cè)。由于ELISA檢測(cè)容易受到各方面因素的影響而發(fā)生漏診的情況，因此建議對(duì)于ELISA檢測(cè)出現(xiàn)可疑的標(biāo)本，使用RT-PCR進(jìn)行確診，更具可靠度。

［1］劉啟文.豬戊型肝炎病毒表位的篩選及間接 ELISA方法的建立.上海師范大學(xué)，2011.

［2］葛勝祥，張軍，彭耿，等.基于多聚化重組抗原的檢測(cè)戊型肝炎病毒IgM與 IgG抗體的 ELISA的建立及初步評(píng)估.病毒學(xué)報(bào)，2003，19（1）：74-82.

［3］黃守杰.戊型肝炎病原學(xué)診斷策略初探及江蘇農(nóng)村地區(qū)戊型肝炎流行病學(xué)特征研究.廈門(mén)大學(xué)，2008.

［4］江永珍，田瑞光，魯建，等.我國(guó)戊型肝炎ELISA診斷試劑的質(zhì)量比較.中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2007，21（1）：59-61.

［5］鄭玲，柳麗娟，胡瑩盈，等.抗HEV包膜蛋白重組抗原E2-IgM是診斷急性戊型肝炎的敏感和特異的血清學(xué)指標(biāo).//肝病實(shí)驗(yàn)室診斷與臨床研究——肝病實(shí)驗(yàn)室診斷與臨床研究專(zhuān)題學(xué)術(shù)會(huì)議論文集.2004：51-53.

［6］吳海波，楊連華，洪艷，等.戊肝IgG抗體ELISA試劑盒診斷價(jià)值的評(píng)價(jià).中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2008，18（10）：2133-2134.

［7］孫俊紅，李雷花.戊型肝炎病毒檢測(cè)方法學(xué)評(píng)價(jià).中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2015，10（18）：91-92.

［8］孟慶玲，邱豐，沈立萍，等.戊型肝炎病毒TaqMan Real-time RTPCR法的建立及應(yīng)用.中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2012，26（6）：486-488.

［9］嚴(yán)艷，趙晨燕，李卓，等.實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)戊型肝炎病毒RNA的臨床應(yīng)用.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2009，32（2）：175-178.

［10］錢(qián)煒林，葉廣勝，王玉燕等.戊型肝炎病毒診斷方法概述.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，38（12）：111-112.

［11］李志士，梁海英，于天華，等.DNA微列陣技術(shù)檢測(cè)戊型肝炎病毒方法的建立及初步應(yīng)用.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2010，14（7）：996-998.

［12］趙晨燕，李卓，閻寶山，等.戊型肝炎病毒各生物標(biāo)志物之間關(guān)系分析.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2008，28（1）：6-9.

［13］葛勝祥，郭清順，李少偉，等.基因Ⅰ、Ⅳ型戊型肝炎病毒高靈敏度通用引物的設(shè)計(jì)和初步應(yīng)用.//肝病實(shí)驗(yàn)室診斷與臨床研究——肝病實(shí)驗(yàn)室診斷與臨床研究專(zhuān)題學(xué)術(shù)會(huì)議論文集. 2004：88-90.

［14］郝寶成，蘭喜，胡永浩，等.豬戊型肝炎病毒雙重RT-PCR檢測(cè)診斷方法的建立及其應(yīng)用.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2011，47（5）：35-36.

［15］曾航，張玉林，王麟等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)兔戊型肝炎病毒（HEV）的檢測(cè)及評(píng)估［J］.中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2015，31（7）：612-617.

（潘子昂編輯）

Comparative Analysis of RT-PCR and ELISA Detection in
Clinical Diagnosis of Hepatitis E

CAI Jie-xin，YANG Li-jie，ZHAO Zhen-jie
（Clinical Laboratory，the First Hospital of Beijing Fangshan，Beijing 102400，China）

Objective To explore and compare RT-PCR and ELISA detection on hepatitis E and clinical diagnostic value.Methods A total of 100 samples were randomly selected from 50500 serum samples in our hospital from January 2013 to January 2016.Samples were tested by ELISA，and then by RT-PCR.Results Were compared between the two groups.The positive agreement rate was 55%and negative agreement rate was 100%.The total agreement rate was 80%.Kappa value was 0.87（0.75＜kappa is less than or equal to 0.99），and the correlation between two was slightly above average.The positive rate of ELISA was 30%，the positive rate of PCR was 50%，the positive rate of ELISA was significantly higher than that of PCR，the difference was statistically significant，P=0.000＜0.005.Conclusion RT-PCR and ELISA in the diagnosis of hepatitis E show equally specific.RT-PCR has higher positive rate than that of ELISA.It is recommended that ELISA can be used as first choice of screeningof suspicious specimens，RT-PCR can be added as aconfirmation of the diagnosis.

RT-PCR fluorescence detection； ELISA detection； Hepatitis； Clinical diagnosis

10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.09.030

2016-05-16；

2016-06-02