陣列紙芯片比色法檢測堿性磷酸酶

陳熙 陳錦 張慧妍 汪付兵 王方方 吉邢虎 何治柯

摘 要 采用5溴4氯3吲哚磷酸鹽（BCIP）/氯化硝基四氮唑藍（NBT）顯色體系，構(gòu)建了陣列紙芯片比色檢測堿性磷酸酶（ALP）的方法。首先，借助烘干處理方式在光刻法制備的陣列紙芯片微孔中固定顯色試劑，然后加入ALP進行顯色反應，最后，采用凝膠成像儀和普通照相機成像，讀取顯色強度（灰度值）進行比色檢測。詳細考察了顯色條件對檢測結(jié)果的影響，探討了人血清白蛋白對ALP檢測的增色效應，在最佳實驗條件下，ALP檢測的線性范圍為1.5～20 U/L，檢出限（3

SymbolsA@ ）為0.78 U/L（n=18），比文獻報道中紙芯片上檢測ALP方法的檢出限低約兩個數(shù)量級。本方法成功用于實際血清樣品檢測，測定結(jié)果與臨床值一致。在此基礎上，構(gòu)建了雙色陣列紙芯片，通過顏色的變化實現(xiàn)了ALP的可視化半定量檢測。

關(guān)鍵詞 陣列紙芯片；比色法；堿性磷酸酶

1 引 言

堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase， ALP）是一種水解酶，可催化水解底物分子中的磷酸單酯，廣泛存在于細菌、真菌及動物中[1]。血清中ALP水平是診斷肝癌、肝硬化、慢性肝炎等肝類疾病的指標，也是原發(fā)性肝癌的腫瘤標志物之一[2，3]。ALP也是酶聯(lián)免疫吸附分析中常用的一種標記酶[4]。因此，建立一種快速、方便、廉價的堿性磷酸酶檢測器件，具有重要的理論意義和實際應用價值。常規(guī)的ALP檢測方法包括顯色法[5]、電化學法[6]、熒光法[7]、化學發(fā)光法[8]、表面增強拉曼光譜法[9]等。電化學法快速準確，但是難以用于復雜樣品的分析，且需要外加電源；熒光法檢測裝置復雜，需要濾光片及外加光源等；化學發(fā)光檢測線性范圍寬，但缺乏穩(wěn)定性；而使用拉曼光譜法需要專門的儀器，價格昂貴。

紙芯片是近年來備受關(guān)注的一種具有廣闊應用前景的微流控分析器件，具有價格低廉、可便攜式、生物相容性好、高通量、簡單快速、試劑消耗量小等優(yōu)點[10～13]。隨著紙芯片制作方法的不斷完善，基于紙芯片的分析檢測方法也得到了不斷發(fā)展[14～18]。其中，顯色法直觀、快速、穩(wěn)定，不需要附加光源、電能等復雜儀器設備，研究報道數(shù)量最多。

目前，基于紙芯片的ALP顯色檢測方法也有相關(guān)報道。Li等[19]借助BCIP（5溴4氯3吲哚基磷酸鹽）/NBT（氯化硝基四氮唑藍）顯色體系開展了紙芯片上顯色法檢測ALP的可行性研究。Cheng等[20]基于ALP顯色體系，構(gòu)建了紙芯片ELISA檢測新方法，實現(xiàn)了IgG和HIV1病原蛋白的分析檢測。 Vella等[21]將紙芯片用于肝臟疾病指示物的分析檢測，借助紙芯片中濾膜的分離功能，實現(xiàn)了全血中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、ALP以及總血清蛋白的分析檢測。ALP的檢出限為15 U/L，檢測靈敏度有待進一步提高。

本研究基于陣列紙芯片比色法檢測ALP，通過優(yōu)化顯色反應條件，借助烘干處理方法降低背景信號以及人血清白蛋白增色效應等方式，提高了檢測靈敏度。該方法用于實際血清樣品的檢測，檢測結(jié)果與臨床結(jié)果相一致。此外，借助雙色陣列紙芯片開展了ALP可視化半定量分析檢測研究。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

G17光刻機（成都鑫南光機械設備有限公司），PDCM等離子體清洗器（成都銘恒科技發(fā)展有限公司），KQ2200超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），PB10酸度計（Sartorius），KW4H350烤膠機（上海凱美特功能陶瓷技術(shù)有限公司），HZQF160立式全溫振蕩培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司），凝膠成像系統(tǒng)（CHEMIDOC XRS，BIORAD），COOLPIX 5400尼康相機，MilliQ Advantage A10超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

牛小腸堿性磷酸酶（ALP，TaKaRa生物科技有限公司），5溴4氯3吲哚磷酸鹽（BCIP，TCI化成工業(yè)發(fā)展有限公司），氯化硝基四氮唑藍（NBT，北京經(jīng)科宏達公司），氯化鎂、氯化鈉和Tris購自Sigma公司。人血清白蛋白（HSA，Biosharp公司），牛血清白蛋白（BSA，Roche文瀚科技），葡萄糖氧化酶（GOD，Amresco公司），辣根過氧化物酶（HRP，武漢博士德生物工程有限公司），胰蛋白酶和溶菌酶（Amresco公司），木瓜蛋白酶（昆明杰輝生物技術(shù)有限公司），SU8 2010光刻膠（MicroChem Corp.），TX609濾紙（深圳市慶高實業(yè)有限公司）。新鮮人血清由中南醫(yī)院提供。實驗用水為超純水（18.0 MΩ·cm，25℃）。

2.2 實驗方法

采用光刻法[22，23]在濾紙上制作一維陣列式紙芯片，陣列微孔分布為3 × 9，共27個微孔，孔徑為2.5 mm。首先配制顯色儲備液，將2 μL儲備液預先滴加于微孔中，放于37℃培養(yǎng)箱中烘干約10 min，然后加入ALP標準溶液進行顯色反應，采用凝膠成像儀和普通照相機成像，以顯色強度（灰度值）進行比色檢測。所配制的BCIP/NBT顯色液應放于4℃冰箱避光保存，并且現(xiàn)配現(xiàn)用。顯色液的迅速烘干可減少吲哚中間物與空氣的接觸時間，從而大大降低背景信號。

3 結(jié)果與討論

3.1 檢測原理

5溴4氯3吲哚基磷酸鹽（BCIP）被堿性磷酸酶水解后生成還原性強的吲哚中間體，NBT作為顯色指示劑，能夠與吲哚中間體反應生成深藍紫色的不溶性甲臜。該顯色反應用于堿性磷酸酶顯色檢測時顏色幾乎由無色變?yōu)樯钏{色甚至黑色，顯色快速，操作簡單，是生物分析檢測常用的顯色反應體系[24]?；诩埿酒谋壬珯z測法由于紙芯片的富集和濃縮，顯色更為明顯、快速，有利于增強體系的顯色信號。

3.2 反應條件對顯色強度的影響

3.2.1 緩沖液pH值對顯色強度的影響 堿性磷酸酶是一種堿性酶，其適合的反應條件是堿性條件。在實驗過程中，用0.1 mol/L不同pH值的TrisHCl緩沖液配制顯色液以及標準溶液。實驗結(jié)果表明，緩沖溶液的pH值從8.0增加到9.5時，顯色強度逐漸增強；而當pH>9.5繼續(xù)增大時，顯色強度降低。該體系最佳反應pH=9.5。在后續(xù)的實驗中，使用0.1 mol/L TrisHCl緩沖液（pH 9.5）配制所有溶液。

3.2.2 BCIP/NBT對顯色強度的影響 BCIP/NBT是一組常用的堿性磷酸酶顯色劑。BCIP是堿性磷酸酶的水解底物，其濃度大小對酶促反應有影響。當BCIP的濃度非常低時，酶分子沒有被底物飽和，反應速率與BCIP的濃度相關(guān)，為一級反應；當BCIP的濃度達到一定水平使酶分子飽和時，反應速率與底物濃度無關(guān)，為零級反應。但是當?shù)孜锏臐舛冗^高時，過量的底物會抑制酶的活性。實驗結(jié)果表明，當BCIP濃度由1.0 mmol/L增大到4.0 mmol/L時，顯色強度變大；而濃度繼續(xù)增加時，顯色反而變淺。當濃度為3～4 mmol/L時，顯色強度達到最大，在后續(xù)的實驗中，BCIP的濃度確定為3 mmol/L。NBT是一種藍色染料，參與顯色反應，能與吲哚基中間體反應生成深藍紫色的沉淀。實驗結(jié)果表明，BCIP/NBT的比值對于顯色強度有影響。隨著BCIP/NBT比值從1.5增大到4.5，顯色強度變大；當BCIP/NBT比值在4.5～7.5之間時，顯色強度達到最大值；而當BCIP/NBT比值從7.5增大到9.0時，顯色逐漸減弱。因此，顯色體系最佳BCIP/NBT比例選擇5.0。

3.2.3 金屬離子對顯色強度的影響 研究表明，某些金屬離子可以影響ALP的催化活性。Mg2+是堿性磷酸酶的一種激活劑，能提高堿性磷酸酶的催化活性，增強顯色結(jié)果。實驗結(jié)果表明，Mg2+濃度在2～7 mmol/L時， 顯色強度基本保持不變；Mg2+濃度達到8 mmol/L時，顯色強度開始下降。后續(xù)實驗中Mg2+使用濃度為6 mmol/L。Zn2+對ALP顯色反應也具有一定增強作用，實驗中選擇Zn2+濃度為16 μmol/L。顯色反應通常加入NaCl保持離子強度以改善顯色結(jié)果。實驗結(jié)果表明，當NaCl濃度為0.1 mol/L時，顯色強度最佳。

3.2.4 反應時間對顯色強度的影響 顯色反應過程中，顯色強度隨反應時間而變化。考察顯色反應5～70 min，實驗結(jié)果表明，顯色強度在30 min時達到最大值，顏色最深。顯色時間選擇30 min。

3.2.5 反應溫度對顯色強度的影響 溫度是影響酶活性的一個重要因素，不同的酶都有其活性的最適溫度。考察溫度對堿性磷酸酶顯色反應的影響，結(jié)果表明，在15～25℃范圍內(nèi)，酶的活性隨著溫度的升高而升高；當溫度達到30℃以上時，放于培養(yǎng)箱中的紙芯片上的反應溶液在未達到足夠反應時間前，就已經(jīng)完全干燥，無法進行反應。因此，顯色反應溫度設定為25℃。

3.2.6 堿性磷酸酶檢測的選擇性

實驗借助酶促反應顯色，利用了酶催化特異性、專一性的優(yōu)點，

圖1 堿性磷酸酶（ALP）檢測的選擇性

Fig.1 Specificity of 5bromo4chbro3indolyl phosphat disodium salt/nitro blue tetrazolium （BCIP/NBT） system for alkaline phosphatas （ALP） biosensor保證了顯色檢測的選擇性和特異性。本實驗采用BSA、葡萄糖氧化酶（GOD）、辣根過氧化物酶（HRP）、胰蛋白酶（Trypsin）、溶菌酶（Lysozyme）、木瓜蛋白酶（Papain）6種酶/蛋白進行選擇性驗證，實驗結(jié)果如圖1所示，堿性磷酸酶的顯色遠遠高于其它酶/蛋白，結(jié)果表明，利用BCIP作為顯色底物的檢測體系具有良好的選擇性。

3.2.7 血清HSA對顯色強度的影響 血清中含有大量的白蛋白，其中人血清白蛋白（HSA）的存在對檢測體系干擾很大，因此，在對實際樣品進行檢測之前，需考察HSA對檢測體系的影響。研究發(fā)現(xiàn)，HSA對顯色反應有增強作用。實驗結(jié)果表明（如圖2所示），當HSA濃度在0.5～2 mg/mL之間變化時，對于顯色的增強效果較好。

圖2 人血清白蛋白（HSA）對ALP顯色反應的影響結(jié)果：（A）HSA濃度分別為1， 3， 5， 8， 10， 15和20 mg/mL；（B）HSA濃度分別為0.2， 0.5， 1.0， 1.5， 2.0， 2.5 mg/mL。

Fig.2 Influence of HSA on intensity for ALP detection. （A） Curve and photographs of ALP detection （30 U/L） in the presence of 1， 3， 5， 8， 10， 15 and 20 mg/mL HSA （high concentration）. （B） Curve and photographs of ALP detection （30 U/L） in the presence of 0.2， 0.5， 1.0， 1.5， 2.0， and 2.5 mg/mL HSA （low concentration）.

3.3 ALP檢測的線性范圍和檢出限

在最佳實驗條件下，比較了緩沖體系及HSA存在條件下的ALP檢測的線性范圍和檢出限，結(jié)果如圖3所示。緩沖體系中（圖3A），ALP檢測的線性范圍5～30 U/L，回歸方程為y=176.59+25x， y為顯色強度，x為ALP濃度， R2=0.996（n=3），檢出限（3

SymbolsA@ ）為2.43 U/L（n=18）。在含有1 mg/mL HSA的條件下（圖3B），其線性范圍為1.5～20 U/L，回歸方程為y=173.99+78.15x， R2=0.997（n=3），檢出限（3

SymbolsA@ ）為0.78 U/L （n=18）。

3.4 血清中ALP的檢測

堿性磷酸酶在正常成年男性血清中的含量為55～125 U/L，而在成年女性血清中的正常值范圍為40～100 U/L。血清中HSA的含量約為40～60 mg/mL，在實際樣品的檢測中，利用其本身已有的HSA對顯色進行增色。樣品處理方法是將血清稀釋40～100倍使HSA濃度在0.5～1.5 mg/mL之間，同時減弱了血清本身顏色的干擾，然后進行加標檢測。血清樣品從中南醫(yī)院獲得，檢測結(jié)果如表1所示，本方法檢測值與中南醫(yī)院臨床檢測參考值具有較好的一致性。

3.5 陣列紙芯片可視化半定量檢測ALP

發(fā)展方便、快捷、直觀的檢測方法，尤其是不借助儀器設備的可視化檢測方法，對于ALP的檢測具有重要的實際意義。由于裸眼對同一種顏色深淺變化的分辨能力遠遠弱于對于不同顏色之間的識別力，因此加入一種背景色，可使得檢測結(jié)果更容易被裸眼識別。基于這一原理，在陣列紙芯片中添加背景色，與BCIP/ NBT體系的深藍紫色混合來指示ALP的濃度，檢測結(jié)果如圖4所示。

與比色檢測結(jié)果相比，增加背景色后可視化檢測結(jié)果更直觀，當ALP的濃度超過30 U/L時，呈現(xiàn)明顯的紫黑色，通過顏色的變化可半定量判斷ALP的濃度范圍。

4 結(jié) 論

本研究構(gòu)建了陣列紙芯片比色檢測法，成功用于堿性磷酸酶的分析檢測。通過優(yōu)化5溴4氯3吲哚磷酸鹽（BCIP）/氯化硝基四氮唑藍（NBT）顯色體系的反應條件，借助人血清白蛋白（HSA）的增色效應，提高了堿性磷酸酶的檢測靈敏度，達到0.78 U/L，比文獻報道中紙芯片上檢測堿性磷酸酶的檢出限約低兩個數(shù)量級。本方法用于實際血清樣品加標檢測，結(jié)果比較理想。在此基礎上，構(gòu)建了雙色陣列紙芯片，通過顏色的變化實現(xiàn)了堿性磷酸酶的可視化半定量檢測。紙芯片比色檢測方法簡便、結(jié)果直觀、靈敏度高，為疾病相關(guān)指標的檢測提供了一種廉價的技術(shù)平臺，尤其是不借助儀器設備的可視化檢測方法的發(fā)展，將有利于該技術(shù)平臺在實際分析中的應用。

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Colorimetic Detection of Alkaline Phosphatase on Microfluidic

Paperbased Analysis Devices

CHEN Xi1， CHEN Jin1， ZHANG HuiYan1， WANG FuBing2， WANG FangFang1， JI XingHu*1， HE ZhiKe1

1（Key Laboratory of Analytical Chemistry for Biology and Medicine， Ministry of Education，

College of Chemistry and Molecular Sciences， Wuhan University， Wuhan 430072， China）

2（Department of Laboratory Medicine， Zhongnan Hospital of Wuhan University， Wuhan 430071， China）

Abstract A lowcost， simple and sensitive colorimetric detection method of alkaline phosphatase （ALP） has been developed on microfluidic paperbased analysis devices. In a typical colorimetric detection， 5bromo4chloro3indolyl phosphate disodium salt （BCIP） and nitro blue tetrazolium （NBT） were firstly added onto the circle array zones of paper devices. Then ALP solutions were spotted to the array zones to perform the colorimetric reaction. The color results were recorded by both Gel Documentation systems and a common camera， and analyzed with Quantity One software. All the reaction conditions were aptimized. Under the optimal conditions， the colorimetric intensity showed a linear correlation to the concentration of ALP in the range of 1.5 to 20 U/L with the limit of detection （LOD） of 0.78 U/L（3σ）， which was about two orders of magnitude lower than that of the reported method on μPADs. Besides， it could be applied in spiked real sample analysis with a satisfactory result. In addition， a dualcolor arraybased paper strip has been fabricated for the semiquantitative detection of ALP. The approximate activity of ALP could be simply distinguished by observing the color change with naked eyes.

Keywords Microfluidic paperbased analysis devices； Colorimetric detection； Alkaline phosphatase

（Received 25 February 2016； accepted 7 March 2015）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 21205089） and the Specialized Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education of China （No. 20120141120036）.