感染T細胞斑點試驗在耐多藥肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用價值

胡鈺卿　潘愛珍　王靜　朱敏

[摘要] 目的 分析探討感染T細胞斑點試驗（T-SPOT.TB）在耐多藥肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用價值。 方法 選擇2014年1月～2016年1月我院收治的耐多藥肺結(jié)核患者71例，另選擇35例同期健康體檢者作為對照組，比較各種檢測方法診斷的陽性率，并采用敏感性、特異性、準(zhǔn)確度作為診斷試驗的評價指標(biāo)。 結(jié)果 T-SPOT.TB檢測診斷耐多藥肺結(jié)核陽性率最高，達95.8%，顯著高于其他各項檢測方法，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）?？顾釛U菌涂片、結(jié)核菌培養(yǎng)、T-SPOT.TB檢測用于診斷耐多藥肺結(jié)核的敏感性較高，達90%以上。T-SPOT.TB檢測用于診斷耐多藥肺結(jié)核的特異性最高，達91.9%，顯著高于其他各項檢測方法，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。T-SPOT.TB檢測用于診斷耐多藥肺結(jié)核的準(zhǔn)確度最高，達96.2%，顯著高于其他各項檢測方法，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 與其他檢查方法相比，感染T細胞斑點試驗對診斷耐多藥肺結(jié)核具有特異性高、準(zhǔn)確度高的優(yōu)點，值得廣泛推廣和應(yīng)用。

[關(guān)鍵詞] 耐多藥肺結(jié)核；感染T細胞斑點試驗； 敏感性；特異性

[中圖分類號] R521 [文獻標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2016）25-0070-04

Application value of T-SPOT.TB test in the diagnosis of multi-drug resistant tuberculosis

HU Yuqing1 PAN Aizhen2 WANG Jing1 ZHU Min1

1.Tuberculosis Laboratory， Hangzhou Red Cross Hospital， Hangzhou 310003， China； 2.Tuberculosis Laboratory， Center for Tuberculosis Prevention and Control， Zhejiang Center for Disease Control， Hangzhou 310051， China

[Abstract] Objective To analyze the application value of T-SPOT.TB test in the diagnosis of multi-drug resistant tuberculosis. Methods A total of 71 patients with multi-drug resistant tuberculosis who were admitted to our hospital from January 2014 to January 2016 were selected. Another 35 healthy subjects were selected as the control group. The diagnosis positive rate of each test method was compared， and sensitivity， specificity and accuracy were applied as the evaluation indicators of the diagnostic test. Results The positive rate of T-SPOT.TB test in the diagnosis of multi-drug resistant tuberculosis was the highest， reaching up to 95.8%， significantly higher than that of other test methods， and the differences were statistically significant（P<0.05）. The sensitivity of acid-fast bacillus test， tuberculous bacillus culture and T-SPOT.TB test in the diagnosis of multi-drug resistant tuberculosis was higher， reaching over 90%. The specificity of T-SPOT.TB test in the diagnosis of multi-drug resistant tuberculosis was the highest， reaching up to 91.9%， significantly higher than that of other test methods， and the differences were statistically significant（P<0.05）. The accuracy of T-SPOT.TB test in the diagnosis of multi-drug resistant tuberculosis was the highest， reaching up to 96.2%， significantly higher than that of other test methods， and the differences were statistically significant（P<0.05）. Conclusion Compared with other test methods， T-SPOT.TB test in the diagnosis of multi-drug resistant tuberculosis has advantages of high specificity and high accuracy， which is worthy of wide promotion and application.

[Key words] Multi-drug resistant tuberculosis； T-SPOT.TB test； Sensitivity； Specificity

結(jié)核病是一種慢性傳染病，是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的疾病，其中最為常見的是肺部結(jié)核。近年來全球結(jié)核病疫情呈回升狀態(tài)，耐藥結(jié)核菌發(fā)生率不斷增加[1，2]。其中，耐多藥肺結(jié)核指結(jié)核菌至少同時對利福平、異煙肼兩種抗結(jié)核藥物耐藥，發(fā)病率較高，約占全世界25.0%，還存在持續(xù)向外播散耐多藥結(jié)核菌情況。耐多藥肺結(jié)核治療難度大，治療周期長，治愈率低，因此，尋找特異的檢測方法，快速且準(zhǔn)確診斷是結(jié)核病控制的關(guān)鍵問題，且對于監(jiān)測結(jié)核病的發(fā)展、轉(zhuǎn)歸及臨床治療具有重要意義。結(jié)核菌素試驗（purified protein derivative tuberculin，PPD）為診斷結(jié)核病的主要方法，但假陽性率較高。結(jié)核感染T細胞斑點試驗（TB infection of T cells spot test，T-SPOT.TB）為一種新型的診斷方法，敏感性和特異性水平較高。本研究選取耐多藥肺結(jié)核病例行T-SPOT.TB試驗，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2014年1月～2016年1月我院收治的耐多藥肺結(jié)核患者71例，入選研究對象均知情同意，均排除合并嚴(yán)重心、腦、肝、腎、消化系統(tǒng)等疾病者。其中男38例，女33例；年齡22～67歲，平均（41.2±6.2）歲；病史0.5～3年，平均（14.1±3.2）個月。疾病類型：原發(fā)性肺結(jié)核15例，繼發(fā)性肺結(jié)核40例，血型播散型肺結(jié)核16例。另選擇35例同期健康體檢者作為對照組，其中男18例，女17例；年齡20～58歲，平均（42.3±5.4）歲。兩組的性別、年齡等比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 檢測方法

1.2.1 T-SPOT.TB試驗 取枸櫞酸鈉抗凝的靜脈血5 mL，分離外周血單核細胞（PBMC）放在包被IFN-7抗體的微孔板，加入結(jié)核分枝桿菌特異性抗原早期分泌靶向抗原（ESAT-6）和培養(yǎng)基濾過蛋白（CFP-10）作為抗原，37℃溫箱培養(yǎng)24 h后，洗去抗原致敏效應(yīng)T淋巴細胞，加入生物素標(biāo)記的二抗，再經(jīng)酶聯(lián)顯色，在細胞因子分泌的地方形成斑點，通過記錄斑點數(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌特異抗原致敏的效應(yīng)T淋巴細胞數(shù)量。

1.2.2 結(jié)果判斷 當(dāng)空白對照孔內(nèi)斑點數(shù)<6時，任一實驗孔斑點數(shù)減去空白孔斑點數(shù)≥6，結(jié)果即為陽性；若空白對照孔斑點數(shù)>6，任一實驗孔斑點數(shù)大于空白孔斑點數(shù)的2倍，結(jié)果也表示陽性[3]。

1.2.3 其他檢查方法 （1）PPD試驗：采用Mantoux法，取PPD 0.1 mL（含5單位結(jié)核菌素）行前臂尺側(cè)皮內(nèi)試驗，48～72 h后觀察結(jié)果。硬結(jié)直徑≥10 mm為TST陽性結(jié)果[4]。（2）血清結(jié)核抗體檢測：采用酶標(biāo)儀讀取光密度值（OD值），并在標(biāo)準(zhǔn)滴度曲線表中查找出相應(yīng)標(biāo)本中抗結(jié)核抗體滴度，陽性為>400 U/mL[5]。試劑盒為南京大淵代理的蛋白芯片試劑盒，嚴(yán)格按照說明書進行操作。（3）結(jié)核PCR：結(jié)核DNA檢測。（4）抗酸桿菌涂片。（5）結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)。

1.3 評價指標(biāo)

采用敏感性、特異性、準(zhǔn)確度作為診斷試驗的評價指標(biāo)。①敏感性=真陽性例數(shù)/（真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100%；②特異性=真陰性例數(shù)/（真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù)）×100%；③準(zhǔn)確度=（真陽性+真陰性）/（真陽性+真陰性+假陽性+假陰性）×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行處理和分析，其中計數(shù)資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 T-SPOT.TB檢測與其他各項檢測方法診斷耐多藥肺結(jié)核陽性率比較

PPD、結(jié)核PCR、結(jié)核菌培養(yǎng)、T-SPOT.TB檢測方法用于耐多藥肺結(jié)核檢測的陽性率顯著高于對照組，組間比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。T-SPOT.TB檢測診斷耐多藥肺結(jié)核陽性率最高，達95.8%，顯著高于其他各項檢測方法，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 T-SPOT.TB檢測與其他各項檢測方法診斷耐多藥肺結(jié)核的敏感性、特異性、準(zhǔn)確度比較

抗酸桿菌涂片、結(jié)核菌培養(yǎng)、T-SPOT.TB檢測用于診斷耐多藥肺結(jié)核的敏感性較高，達90%以上。T-SPOT.TB檢測用于診斷耐多藥肺結(jié)核的特異性最高，達91.9%，顯著高于其他各項檢測方法，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=12.532、15.832、18.235、17.643、13.643，P<0.05）。T-SPOT.TB檢測用于診斷耐多藥肺結(jié)核的準(zhǔn)確度最高，達96.2%，顯著高于其他各項檢測方法，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=10.542、16.127、13.633、15.211、12.452，P<0.05）。

3討論

結(jié)核病是全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一，據(jù)WHO估計，全球約有20億人感染結(jié)核分枝桿菌，每年有約200萬人死于結(jié)核。我國是結(jié)核病高發(fā)國家之一，2000年全國結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查顯示，全國受結(jié)核菌感染人數(shù)約5.5億，其中傳染性肺結(jié)核病患者150萬人，每年因結(jié)核病死亡的人數(shù)達13萬人。近年來結(jié)核病的發(fā)病率有上升趨勢，且耐藥趨勢較嚴(yán)重。因此，如何及早發(fā)現(xiàn)疾病并快速精準(zhǔn)地進行診斷成為臨床研究的重點[6-11]。

結(jié)核菌素試驗（TST）是目前臨床常用于結(jié)核篩查的常用方法之一，但假陽性率高，且易受患者身體狀況影響結(jié)果。因此尋求一種快捷、敏感、特異性強的結(jié)核診斷方法十分重要。體外核酸擴增技術(shù)即聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）自1989年法國學(xué)者Brissonneol等首先報道用于診斷結(jié)核病，為結(jié)核病的快速診斷開辟了新途徑，但由于其假陽性率較高影響了結(jié)果的可靠性[12-18]。

結(jié)核抗體檢測試驗敏感性較差，對潛伏性肺結(jié)核的篩查意義不大，價格昂貴。結(jié)核感染T細胞斑點試驗技術(shù)通過計算斑點的數(shù)量推測出患者體內(nèi)結(jié)核桿菌產(chǎn)生反應(yīng)的效應(yīng)T細胞是否存在。T.SPOT實驗結(jié)合酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)（即ELISPOT技術(shù)）與γ-干擾素釋放試驗，通過檢測受結(jié)核分枝桿菌抗原刺激而活化的效應(yīng)T細胞來診斷結(jié)核感染。結(jié)核感染后體內(nèi)長期存在抗原特異性T細胞，當(dāng)再次遇到抗原刺激時，能迅速活化增殖，釋放γ-干擾素。實驗中利用ESAT-6和CFP-10兩種結(jié)核特異性抗原刺激外周血中結(jié)核特異性T淋巴細胞分泌γ-干擾素，并通過ELISPOT方法檢測γ-干擾素的釋放水平，從而判斷機體是否感染結(jié)核桿菌，對活動性結(jié)核分枝桿菌感染具有較高的敏感性。且結(jié)核感染T細胞斑點試驗的檢測價格便宜、簡單易行[19-26]。將結(jié)核感染T細胞斑點試驗與PPD試驗相比，結(jié)核感染T細胞斑點試驗屬于體外試驗，PPD試驗屬于體內(nèi)試驗；PPD試驗的結(jié)果受多重因素制約，其臨床應(yīng)用受到一定的局限性，在肺結(jié)核感染的高發(fā)地帶為患者進行PPD 試驗的假陽性呈不斷增多趨勢。本研究選擇71例耐多藥肺結(jié)核患者作為研究對象，另選擇35例同期健康體檢者作為對照組，比較各種檢測方法診斷的陽性率，并采用敏感性、特異性、準(zhǔn)確度作為診斷試驗的評價指標(biāo)。結(jié)果證實，T-SPOT.TB檢測診斷耐多藥肺結(jié)核陽性率最高，達95.8%，T-SPOT.TB檢測用于診斷耐多藥肺結(jié)核的特異性最高，達91.9%，T-SPOT.TB檢測用于診斷耐多藥肺結(jié)核的準(zhǔn)確度最高，達96.2%，顯著高于其他各項檢測方法，差異具有顯著性（P<0.05），與張玉平等[24]報道的觀點是相符的，證實與其他檢查方法相比，感染T細胞斑點試驗對診斷耐多藥肺結(jié)核具有特異性高、準(zhǔn)確度高的優(yōu)點，值得廣泛推廣和應(yīng)用。

[參考文獻]

[1] 王立紅，付秀華，張桂芝，等. 結(jié)核感染T細胞斑點試驗在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用價值[J]. 中國防癆雜志，2013， 35（12）：992-996.

[2] 陳旭君，黃溢華，崔會芳，等. 52例結(jié)核感染T細胞斑點試驗與痰結(jié)核菌檢測及CT診斷肺結(jié)核病的對比觀察分析[J]. 中華肺部疾病雜志（電子版），2014，7（4）：8-10.

[3] Kobashi Y，Shimizu H，Ohue Y，et al. Comparison of T-cell integer-on-gamma release assays for Mycobaeterium tuberculosis specific antigens in patient with active and latent tuberculosis[J]. Lung，2010，188（4）：283-287.

[4] Sun L，Xiao J，Li HM，et al. Evaluation of the tuberculin skin test and the whole-blood interferon-γ assay for diagnosis of latent tuberculosis infection in children[J]. Chin J Evid Based Pediatr，2010，5（3）：201-206.

[5] 余亞麗，劉紅. T-SPOT. TB在肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用價值[J].中國實用醫(yī)刊，2015，42（7）：123-124.

[6] Dai Y，F(xiàn)eng Y，Xu R，et al. Evaluation of interferon-gamma release assays for the diagnosis of tuberculosis：An updated meta-analysis[J]. Eur J Clin Mierobiol Infect Dis，2012，31（11）：3127-3137.

[7] 張瑛，孫亞蒙，徐欣暉，等. 結(jié)核感染T細胞斑點試驗在結(jié)核性疾病中的診斷價值[J/CD]. 中華臨床醫(yī)師雜志：電子版，2010，4（12）：2431-2434.

[8] 陶學(xué)芳，王建華. 結(jié)核感染T細胞酶聯(lián)免疫癍點試驗在肺結(jié)核及肺外結(jié)核診斷中的價值[J]. 浙江預(yù)防醫(yī)學(xué)，2012，24（11）：4-7.

[9] 孫海柏，張立，劉佳慶，等. 結(jié)核分枝桿茵T細胞斑點實驗在肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用[J]. 山東醫(yī)藥，2013，53（43）：75-77.

[10] 中國防癆協(xié)會基礎(chǔ)專業(yè)委員會. 結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程[M]. 北京：中國教育文化出版社，2006：30-96.

[11] Nicol MP，Davies MA，Wood K. et al. Comparison of T-SPOT. TB assay and tuberculin skin test for the evaluation of young children at high risk for tuberculosis in community setting[J]. Pediatrics，2009，123（1）：38-43.

[12] Chee CB，Barkham TM，Khinmar KW，et al. Quantitative T-cell interferon-gamma responses to Mycobacterium tuberculosis-specific anti-gens in active and latent tuberculosis[J]. Eur J Clin Mtierobiol Infect Dis，2009，28（6）：667-670.

[13] 李明武，朱惠瓊，劉永莉，等. T-SPOT. TB、TB-DNA、PPD、TB-DOT/TB-CK檢測在結(jié)核病診斷中的臨床價值[J]. 昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2011，（8）：78-80.

[14] 李卓. Tsport在肺結(jié)核及肺外結(jié)核診斷中的價值[J]. 中國實用醫(yī)藥，2016，11（5）：65-66.

[15] 榮蘭香，馬淑紅，艾清，等. T-spot.TB試驗與PPD試驗對結(jié)核病患者診斷價值相關(guān)性比較[J]. 中國實驗診斷學(xué)，2013，17（8）：1475-1476.

[16] 肖倩，黃旭峰. T-spot.TB試驗快速檢測結(jié)核桿菌感染的臨床應(yīng)用研究[J]. 實驗與檢驗醫(yī)學(xué)，2009，27（3）：272-274.

[17] 李林陽，陳林利，李琦. 結(jié)核感染T細胞斑點試驗對肺結(jié)核的臨床診斷價值[J]. 中華肺部疾病雜志（電子版），2014，7（6）：32-33.

[18] 梁瑞霞，李鑫. 結(jié)核感染T細胞斑點試驗在結(jié)核診斷中的應(yīng)用[J]. 中國實用醫(yī)刊，2015，42（8）：24-28.

[19] 楊新婷，郭超，梁清濤，等. 結(jié)核感染T細胞斑點試驗檢測對老年活動性肺結(jié)核的診斷價值[J]. 結(jié)核病與胸部腫瘤，2015，48：240-280.

[20] 曾誼，馮梟，宋梅梅，等. 酶聯(lián)免疫斑點試驗在菌陰肺結(jié)核診斷中的價值[J]. 中國防癆雜志，2012，34（2）：100-101.

[21] 陳忠南，譚云洪. T-SPOT. TB檢測試劑盒在診斷老年結(jié)核病中的臨床應(yīng)用研究[J]. 實用預(yù)防科學(xué)，2012，19（12）：185-186.

[22] 樂軍，梁莉，李蘇輝. 酶聯(lián)免疫斑點試驗快速診斷結(jié)核分枝桿菌感染的臨床應(yīng)用價值[J]. 中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2012，29（11）：1005-1008.

[23] 陶臻，曾娟. 結(jié)核感染T細胞斑點試驗在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用價值[J]. 臨床肺科雜志，2012，17（9）：704-707.

[24] 張玉平，丁顯平，張麗媛，等. T-SPOT.TB、痰涂片和TB-DNA 檢測在肺結(jié)核診斷中的比較研究[J]. 成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2013，8（1）：49-51.

[25] 施麗斌. 結(jié)核感染T細胞斑點試驗對兒童結(jié)核病的診斷價值[J]. 中外醫(yī)學(xué)研究，2016，（11）：50-52.

[26] 葉猛，徐貴，何月. T細胞酶聯(lián)免疫斑點試驗在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用[J]. 中外醫(yī)學(xué)研究，2015，（30）：57-58.

（收稿日期：2016-04-29）