AG490對膽囊癌細胞JAK2/STAT3信號傳導(dǎo)通路的抑制作用研究

傅麗霞　葉斌　施驊　潘俊娣

[摘要] 目的 研究JAK激酶抑制劑AG490對人膽囊癌細胞株GBC-SD生長增殖的影響，探討AG490對JAK2/STAT3信號傳導(dǎo)通路的抑制作用及其對膽囊癌治療的意義。 方法 培養(yǎng)GBC-SD細胞，根據(jù)研究目的設(shè)置實驗組和對照組，在第一項實驗中，實驗組以3個濃度梯度的AG490作用于GBC-SD細胞，對照組加入等量PBS，繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后以MTT法測定OD值，反映各組細胞的增殖活性；在第二項實驗中，實驗組以100 μmol/mol的AG490作用24 h，對照組平行培養(yǎng)，收集兩組細胞進行免疫印跡法檢測，觀察AG490對細胞中JAK2、STAT3蛋白表達的影響。 結(jié)果 AG490能有效抑制膽囊癌細胞增殖，且抑制作用呈濃度依賴性，即濃度越高，抑制作用越明顯，不同濃度組細胞增殖抑制率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；AG490作用后細胞中JAK2、STAT3蛋白濃度降低，與對照組比較差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 AG490可以抑制細胞中JAK2、STAT3蛋白的表達，通過抑制JAK2/STAT3信號傳導(dǎo)通路發(fā)揮抑制膽囊癌細胞增殖的作用。

[關(guān)鍵詞] 膽囊癌；JAK2；STAT3；抑制增殖

[中圖分類號] R735.8 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）25-0004-04

Inhibitory effect of AG490 on JAK2/STAT3 signal pathway in gallbladder carcinoma cells

FU Lixia YE Bin SHI Hua PAN Jundi

Lishui Central Hospital in Zhejiang Province， Lishui 323000， China

[Abstract] Objective To study the impact of JAK kinase inhibitor AG490 on the growth of human gallbladder carcinoma cell GBC-SD， and to investigate the inhibitory effect of AG490 on JAK2/STAT3 signaling pathway and its implications for the treatment of gallbladder cancer. Methods GBC-SD cell was cultivated and grouped into testing group and control group according to this project purpose. In the first part， 3 different concentrations of AG490 was used on GBC-SD cells of test group， while the control group was cultured normally PBS， MTT assay was used for testing cell proliferation OD after 24 hours to see its activity of proliferation. On the second part of experiment， the cells in testing group endured 100 μmol/mol of AG490 for 24 hours， after which cells in both groups were collected and handled， later， Western blot was performed to detect the impact of AG490 on the expression level of JAK and STAT3 protein. Results AG490 could inhibit cell proliferation in a concentration-dependent manner， the higher concentration resulted in higher inhibition， namely the inhibition rate of cell proliferation between different concentrations of groups was different， and the difference was statistically significant（P<0.05）. Another founding that JAK2 and STAT3 protein both reduced compared with the control group with statistically significant difference（P<0.05）. Conclusion AG490 can inhibit the proliferation of gallbladder cancer cells by inhibiting the expression of JAK2 and STAT3 protein， and it can interfere the JAK2/STAT3 signal pathway to perform its inhibition effect.

[Key words] Gallbladder carcinoma； JAK2； STAT3； Inhibition proliferation

近年來陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)酪氨酸激酶2/信號傳導(dǎo)子與激活子3（JAK2/STAT3）信號傳導(dǎo)通路的持續(xù)激活可致細胞發(fā)生異常增殖并導(dǎo)致其向惡性轉(zhuǎn)化，該信號通路活性激活的程度影響人類多種惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，據(jù)此推測，研究該信號通路的阻斷作用與機制將有利于腫瘤的治療[1，2]。AG490是一種JAK2/STAT3的特異性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)阻滯劑，被認(rèn)為能影響癌細胞的生物學(xué)活性，能夠抑制細胞增殖，降低腫瘤細胞的侵襲力，控制腫瘤生長等[3-5]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)膽囊癌組織中STAT3蛋白的表達水平上調(diào)，可能是引起腫瘤惡化、轉(zhuǎn)移的重要原因[6]，但關(guān)于AG490通過抑制膽囊癌細胞的JAK2/STAT3信號通路從而對膽囊癌發(fā)揮抑制作用研究尚少。本研究將AG490作用于人膽囊癌細胞株GBC-SD細胞，觀察AG490對JAK2/STAT3信號傳導(dǎo)通路的抑制作用，為進一步的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人膽囊癌細胞株GBC-SD購自ATCC，胎牛血清為杭州四季青生物工程有限公司產(chǎn)品，DEME（dulbeccos modified eagle medium）細胞培養(yǎng)基購自GIBCO，JAK抑制劑 AG490（CALBIOCHEM），人類單克隆JAK2、STAT3抗體購自Abcam 公司，蛋白定量試劑盒購自Sigma，實驗所需抗體購自Abcam，其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 AG490對細胞增殖活性影響研究 培養(yǎng)膽囊癌細胞株GBC-SD，在其生長狀態(tài)良好的情況下將其分為4組，即分別加入3個濃度AG490（10 μmol/mol、50 μmol/mol、100 μmol/mol）的實驗組（即AG490作用組）及加入等量磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）的對照組，作用24 h后，用3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]檢測各組細胞增殖狀況。MTT操作過程為：（1）用胰酶消化對數(shù)生長期的細胞，見細胞脫壁后終止消化，離心收集細胞并轉(zhuǎn)移到含有血清的培養(yǎng)基中，輕輕吹打混勻制成細胞懸液，用臺盼藍進行細胞計數(shù)后，調(diào)整細胞的密度至（5～10）×104/mL。（2）將細胞懸液制備好后，在加入96孔板之前再次輕輕混勻，每孔加入90 μL，使所用的GBC-SD細胞的生長密度為5000～10000/孔，位于邊緣的孔用無菌PBS填充。（3）將接種好的細胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細胞單層鋪滿96孔平底板的孔底，實驗組加入預(yù)先配置好的不同濃度的AG490，每個濃度做6個復(fù)孔，對照組細胞加入等量PBS。原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但常在前1 d下午鋪板，次日上午加藥，每孔10 μL，設(shè)3～6個復(fù)孔。本研究根據(jù)實驗設(shè)計設(shè)置了3個濃度梯度及未加藥物的對照組。（4）繼續(xù)培養(yǎng)：放置在5%CO2、37℃的細胞培養(yǎng)箱中孵育16～48 h，通過倒置顯微鏡觀察藥物對細胞的作用效果，當(dāng)發(fā)現(xiàn)細胞發(fā)生明顯的形態(tài)變化，在高濃度組可見死亡細胞時，作為培養(yǎng)終點，本實驗以加入AG490后24 h作為觀察點。（5）每孔加入10 μL MTT溶液（5 mg/mL，即0.5%MTT），放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。（6）終止培養(yǎng)，在各孔細胞中加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解結(jié)晶。每孔加入150 μL DMSO，手動震蕩或?qū)⑴囵B(yǎng)板置于搖床上低速振蕩10 min左右，待紫色的結(jié)晶物充分溶解后，通過酶聯(lián)免疫檢測儀在OD 492 nm處測量各孔的吸光值。（7）以O(shè)D值來反映細胞增殖活性。

1.2.2 AG490對細胞中JAK2、STAT3蛋白表達水平的影響研究 細胞株選擇及培養(yǎng)同上。根據(jù)是否進行干預(yù)分為AG490作用組和對照組，實驗組加入100 μmol/mL的AG490，作用24 h后分別收集兩組GBC-SD細胞并進行預(yù)處理，測定蛋白含量，繼而進行細胞免疫印跡（western blot，WB）分析，對兩組細胞表達的蛋白進行定量比較[7]，操作步驟依次為：（1）蛋白樣品準(zhǔn)備；（2）進行SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳；（3）濕盒-半干法轉(zhuǎn)膜：（4）免疫反應(yīng)；（5）底物反應(yīng)、顯影及定影；（6）成像，將膠片掃描或拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)蛋白條帶的分子量和凈光密度值。

1.3 觀察指標(biāo)

細胞經(jīng)AG490作用后以MTT測定OD值、細胞中JAK2、STAT3蛋白的表達水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS16.0進行數(shù)據(jù)錄入與分析，不同濃度組別細胞吸光度值為計量資料，組間比較采用單因素方差分析，兩組蛋白濃度也為計量資料，兩組之間比較采用成組t檢驗，α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AG490 對 GBC-SD 細胞增殖的影響

通過測定的OD值，可以間接反映細胞的增殖抑制情況，OD值越小，表明存活或增殖的細胞越少，即藥物或待測組分對細胞的抑制作用越強。本研究結(jié)果中，AG490的濃度越高，OD值越小，說明AG490可呈濃度依賴性抑制 GBC-SD細胞增殖，即AG490濃度越高， 其對 GBC-SD 細胞的增殖抑制作用越明顯。

2.2 STAT3、STAT3 蛋白表達

GBC-SD 細胞中加入AG490后，通過蛋白定量分析比較，發(fā)現(xiàn)JAK2、STAT3蛋白的表達水平均明顯低于各自對照組細胞中的蛋白表達量，AG490作用組兩種蛋白的表達量與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表 2?？梢?，AG490作用后，抑制了兩種蛋白的表達，從而可下調(diào)JAK2/STAT3信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)活性，抑制腫瘤細胞增殖。

3 討論

蛋白質(zhì)酪氨酸激酶（janus kinase，JAK）是一類非跨膜型的酪氨酸激酶，它既能磷酸化與其相結(jié)合的細胞因子受體，又能磷酸化多個含特定SH2結(jié)構(gòu)域的信號分子。STAT即信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）蛋白家族是能夠被不同的細胞因子受體激活的一組相關(guān)蛋白，它們在細胞因子-受體發(fā)生相互作用時充當(dāng)載體，發(fā)揮保證信號在細胞內(nèi)部傳遞的內(nèi)在特異性作用。在已有研究所揭曉的STAT蛋白當(dāng)中，STAT3由于被發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系較為密切，因此越來越受到研究者們的重視[7-9]。Jia L等[10]發(fā)現(xiàn)，STAT3在膽囊癌中呈現(xiàn)較高水平的表達。而諸多研究已證實，STAT3通過信號傳導(dǎo)的方式參與調(diào)節(jié)了正常細胞的生存、增殖、血管生成、免疫應(yīng)答、凋亡等過程[2，10，11]。

JAK-STAT信號通路是近年來發(fā)現(xiàn)的一條由細胞因子刺激的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與細胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等許多重要的生物學(xué)過程，與其他的信號通路比較，此條信號通路的傳遞過程相對簡單，主要包括三個組分，即酪氨酸激酶相關(guān)受體、酪氨酸激酶JAK以及轉(zhuǎn)錄因子STAT。JAK-STAT通路的過度激活卻會導(dǎo)致正常細胞向惡性轉(zhuǎn)化，該因子通過調(diào)控下游靶基因的表達促進腫瘤細胞的生長和抑制腫瘤細胞凋亡，應(yīng)用JAK/STAT抑制劑可有效抑制腫瘤細胞的生長[12-14]。

AG490是JAK2的特異性拮抗劑，為PTK抑制物之一，許多報道在體外試驗中開展AG490對JAK2的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控作用的研究[6，15]。作為JAK2/STAT3的信號通路特異性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)阻滯劑，其作用機制是抑制JAK2的磷酸化，進而抑制JAK2底物STAT3的磷酸化（以酪氨酸蛋白激酶的形式活化），從而阻滯細胞信號的傳導(dǎo)?；诖?，研究者們傾向于將JAK2/STAT3信號傳導(dǎo)通路阻滯劑AG490作為研究惡性腫瘤靶向治療的一個重要方向。諸多研究發(fā)現(xiàn)JAK2激酶抑制劑AG490以下調(diào)STAT3下游基因的表達的方式來抑制腫瘤細胞的生長及轉(zhuǎn)移[16，17]。

基于上述理論與實踐，加之已有研究證明STAT3在膽囊癌等多種癌組織中高表達[18-21]，但將JAK2/STAT3信號通路應(yīng)用于膽囊癌研究未見系統(tǒng)報道。本研究在充分考慮到可行性的前提下開展膽囊癌細胞JAK2/STAT3信號傳導(dǎo)通路的抑制作用研究，探討JAK2/STAT3信號對抑制膽囊癌的關(guān)聯(lián)及應(yīng)用前景。實驗結(jié)果表明，JAK2/STAT3與膽囊癌的發(fā)生發(fā)展存在關(guān)聯(lián)，應(yīng)用JAK2/STAT3抑制劑能有效抑制癌細胞增殖。應(yīng)用阻滯劑AG490后，膽囊癌細胞GBC-SD中JAK2和STAT3的蛋白表達量均較正常對照組下降，可以認(rèn)為AG490抑制了這兩種蛋白的表達。另一方面，AG490 作用后，GBC-SD細胞的生長與增殖活性受到抑制，且這種抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性，即AG490作用于細胞的濃度越高，細胞的增殖活性抑制率就越高。本研究提示，JAK2/STAT3與膽囊癌的發(fā)生、發(fā)展存在密切聯(lián)系，對JAK2/STAT3抑制劑的進一步研究及應(yīng)用將有助于膽囊癌的治療。

[參考文獻]

[1] 鄧雪松. JAK2/STAT3信號通路在胃癌發(fā)病機制中的作用及AG490干預(yù)研究[J]. 現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2013，29（5）：681-682.

[2] Fang J，Chu L，Li C，et al. JAK2 inhibitor blocks the inflammation and growth of esophageal squamous cell carcinoma in vitro through the JAK/STAT3 pathway[J]. Oncol Rep，2015，33（1）：494-502.

[3] 張寒冰，張道宮，解光，等. AG490對喉癌細胞STAT3信號傳導(dǎo)通路的抑制作用[J]. 山東大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2010， 48（12）：23-26.

[4] 許蓓. AG490對人視網(wǎng)膜母細胞瘤HXO-RB（44）細胞株JAK2/STAT3信號通路的影響[D]. 中南大學(xué)，2013.

[5] Li J，Gan S，Luo C，et al. AG490 inhibits the proliferation of human medullary thyroid carcinoma TT cells and increases their radiosensitivity[J]. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi，2015，31（6）：753-757.

[6] 柳鳳玲. STAT3、Bcl-2在膽囊癌中的表達及意義[D]. 遵義醫(yī)學(xué)院，2012.

[7] Harada Daijiro，Takigawa Nagio，Ochi Nobuaki，et al. JAK2-related pathway induces acquired erlotinib resistance in lung cancer cells harboring an epidermal growth factor receptor-activating mutation[J]. Cancer Sci，2012，103（10）：1795-1802.

[8] 楊衛(wèi)富，李德春，印山河. STAT3、Survivin在膽囊癌中的表達及意義[J]. 臨床肝膽病雜志，2011，27（9）：939-943.

[9] 包仕廷，桂水清. STAT3在膽囊癌組織中的表達及意義[J].河北醫(yī)學(xué)，2006，12（3）：245-246.

[10] Jia L，Song Q，Zhou C，et al. Dihydroartemisinin as a Putative STAT3 Inhibitor，Suppresses the Growth of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma by Targeting Jak2/STAT3 Signaling[J]. PLoS One，2016，11（1）：147-157.

[11] Looyenga BD，Hutchings D，Cherni I，et al. STAT3 is activated by JAK2 independent of key oncogenic driver mutations in non-small cell lung carcinoma[J]. PLoS One，2012，7（2）：308-320.

[12] 楊衛(wèi)富，吳紅艷，朱新國. JSI-124阻斷STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對人膽囊癌細胞生長的影響[J]. 江蘇醫(yī)藥，2014， 40（12）：1381-1384.

[13] 王俊閣，李曉明，路秀英. JAK激酶抑制劑AG490聯(lián)合順鉑對喉癌細胞STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制作用[J]. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2007，28（21）：1930-1932.

[14] Lv C，Huang Y，Liu ZX，et al. Salidroside reduces renal cell carcinoma proliferation by inhibiting JAK2/STAT3 signaling[J]. Cancer Biomark， 2016，17（1）：41-47.

[15] Kobayashi A，Tanizaki Y，Kimura A，et al. AG490，a Jak2 inhibitor， suppressed the progression of murine ovarian cancer[J]. Eur J Pharmacol，2015，766：63-75.

[16] 趙冀安，穆秀娥，董梁，等. AG490通過JAK2/STAT3信號通路對肝癌細胞裸鼠移植瘤的抑制作用及機制[J]. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2016，41（6）：580-586.

[17] Tsai CL，Chao A，Jung SM，et al. Stress-induced phosphoprotein-1 maintains the stability of JAK2 in cancer cells[J]. Oncotarget，2016.

[18] Wang X，Qiu W，Zhang G，et al. MicroRNA-204 targets JAK2 in breast cancer and induces cell apoptosis through the STAT3/BCl-2/survivin pathway[J]. Int J Clin Exp Pathol，2015，8（5）：5017-5025.

[19] Kandala PK. Srivastava，Regulation of Janus-activated kinase-2（JAK2）by diindolylmethane in ovarian cancer in vitro and in vivo[J]. Drug Discov Ther，2012，6（2）：94-101.

[20] Neradugomma NK，Subramaniam D，Tawfik OW，et al. Prolactin signaling enhances colon cancer stemness by modulating Notch signaling in a Jak2-STAT3/ERK manner[J]. Carcinogenesis，2014，35（4）：795-806.

[21] Fang Z，Tang Y，F(xiàn)ang J，et al. Simvastatin inhibits renal cancer cell growth and metastasis via AKT/mTOR，ERK and JAK2/STAT3 pathway[J]. PLoS One，2013，8（5）：1932-2603.

（收稿日期：2016-04-26）