Survivin、NRP1在胃癌中的表達(dá)及其對(duì)胃癌預(yù)后的影響

張益明++趙茂森　朱仁武　顧葉春

[摘要] 目的 探討存活素（Survivin）、神經(jīng)纖維網(wǎng)蛋白1（NRP1）在胃癌中的表達(dá)及其對(duì)胃癌預(yù)后的影響。 方法 應(yīng)用免疫組化法測(cè)定60例胃癌組織及60例正常胃黏膜組織中Survivin、NRP1表達(dá)情況，應(yīng)用Kaplan-Meier計(jì)算Survivin陽(yáng)性、NRP1陽(yáng)性患者5年生存率，以Cox風(fēng)險(xiǎn)模型分析影響胃癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。 結(jié)果 胃癌組織中Survivin陽(yáng)性表達(dá)率為86.67%，NRP1陽(yáng)性表達(dá)率為83.33%，而在胃正常黏膜組織中的表達(dá)分別為6.67%、5.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Survivin陽(yáng)性表達(dá)率與TNM分期、累及漿膜層、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05）。NRP1陽(yáng)性表達(dá)率與TNM分期、浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05）。60例胃癌患者術(shù)后隨訪5年，共56例獲得隨訪，5年存活為25例，5年存活率為44.64%，其中Survivin陽(yáng)性存活率35.42%（17/56），NRP1陽(yáng)性存活率為32.61%（15/56）。經(jīng)Cox風(fēng)險(xiǎn)分析可知，Survivin陽(yáng)性、NRP1陽(yáng)性是影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。 結(jié)論Survivin、NRP1可能與胃癌發(fā)生及進(jìn)展相關(guān)。Survivin、NRP1表達(dá)狀態(tài)是胃癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，其陽(yáng)性表達(dá)可提示患者預(yù)后不良。

[關(guān)鍵詞] 存活素；神經(jīng)纖維網(wǎng)蛋白；胃癌；預(yù)后

[中圖分類號(hào)] R735.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2016）25-0008-04

The impact of Survivin， NRP1 in gastric cancer and its prognosis of gastric cancer

ZHANG Yiming ZHAO Maosen ZHU Renwu GU Yechun

Department of General Surgery， Wenzhou Hospital of Interated Traditional Chinese and Werstern Medicine in Zhejiang Province， Wenzhou 325001， China

[Abstract] Objective To investigate the expression of Survivin， nerve fiber web protein 1（NRP1）in gastric and its impact on the prognosis of gastric. Methods The Survivin， NRP1 of 60 cases of gastric cancer and 60 cases of normal gastric mucosa were detected with immunohistochemistry method. The 5-year survival rate of Survivin positive， NRP1 positive were applicated with Kaplan-Meier.The risk factors of patients with gastric cancer were analyzed with Cox hazard regression model. Results Survivin expression in gastric cancer was 86.67%， NRP1 positive rate was 83.33%， while expression in normal gastric mucosa were 6.67%， 5.00%（P<0.05）. Survivin expression rate was related with TNM stage， involving the serosa， depth of invasion and lymph node metastasis（P<0.05）. NRP1 positive expression rate was related with TNM stage， depth of invasion and lymph node metastasis（P<0.05）. 60 gastric cancer patients were followed up for 5 years， 56 patients were followed up， 5-year survival of 25 cases， 5-year survival rate was 44.64%， which Survivin positive survival rate 35.42%（17/56）， NRP1 positive survival rate was 32.61%（15/56）. Survivin positive， NRP1 positives were independent risk factors for gastric cancer prognosis with Cox risk analysis. Conclusion Survivin， NRP1 may occur with gastric cancer and related progress. Survivin， NRP1 expression status is an independent predictor of prognosis of gastric cancer， and its expression may indicate a poor prognosis.

[Key words] Survivin； Neuropil protein； Gastric cancer； Prognosis

胃癌的死亡率居我國(guó)惡性腫瘤的首位，癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胃癌死亡的重要因素之一，因此對(duì)影響胃癌侵襲及轉(zhuǎn)移的相關(guān)因素進(jìn)行分析對(duì)預(yù)測(cè)胃癌預(yù)后具有重要的意義[1-2]。近年來(lái)研究指出[3]，通過(guò)檢測(cè)胃癌相關(guān)蛋白凋亡及表達(dá)情況對(duì)預(yù)測(cè)胃癌侵襲及轉(zhuǎn)移具有一定的作用。存活素（Survivin）屬凋亡抑制因子IAPs家族中一員，具有廣譜惡性腫瘤表達(dá)特效。Survivin蛋白表達(dá)與多種惡性腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)[4-5]。神經(jīng)纖維網(wǎng)蛋白1（NRP1）是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）新型的受體，在多種惡性腫瘤細(xì)胞中均為高表達(dá)，且參與惡性腫瘤發(fā)生及進(jìn)展過(guò)程[6-7]。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胃癌組織Survivin、NRP1表達(dá)情況，并結(jié)合臨床病理特征，探討Survivin、NRP1表達(dá)與胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2010年6月～2011年6月本院普外科胃癌根治手術(shù)60例患者的臨床資料，患者術(shù)前均未接受過(guò)放化療治療，其中男35例，女25例，年齡48～74歲，平均（56.8±2.2）歲。腫瘤直徑< 5 cm 22例，≥5 cm 38例，累及漿膜層 35例，低分化腺癌30例，中高分化腺癌30例。TNM分期：Ⅰ期 20例，Ⅱ期18例，Ⅲ期 14例，Ⅳ期 8例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 32例。腫瘤浸潤(rùn)：T1～T2 32例，T3 28例。病理組織的臨床分類參照WHO胃癌臨床病理學(xué)分類，每份病理標(biāo)本均留取腫瘤組織及距腫瘤5 cm以上的正常胃黏膜組織，病理組織離體后迅速將其置于液氮中保存以便行病理組織學(xué)分析。

1.2 免疫組織化學(xué)法

應(yīng)用免疫組化法測(cè)定Survivin、NRP1蛋白表達(dá)，Survivin鼠抗人單克隆抗體購(gòu)于Sigma公司，NRP1鼠抗人單克隆抗體購(gòu)于NeoMarkers公司，Survivin試劑盒購(gòu)于上海酶聯(lián)實(shí)業(yè)有限公司，NRP1試劑盒購(gòu)于上海鈺博生物科技有限公司。染色步驟具體如下：將胃癌組織及正常胃黏膜組織標(biāo)本蠟塊切成4 μm厚切片，常溫下乙醇梯度脫水，二甲苯脫蠟，應(yīng)用3%過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，采用0.01 mol/L磷酸緩沖液沖洗標(biāo)本2次，常溫下應(yīng)用正常羊血清工作液封閉樣本10 min，依次加入Survivin鼠抗人單克隆抗體及NRP1鼠抗人單克隆抗體，采用磷酸緩沖液沖洗標(biāo)本2次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素工作液，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中（型號(hào)：DNP-9022；上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）孵育25 min，經(jīng)磷酸緩沖液沖洗后，經(jīng)DAB染色，蘇木素復(fù)染，采用中性樹膠封固。

結(jié)果判定參考相關(guān)文獻(xiàn)[8]：胞漿內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色為Survivin陽(yáng)性，呈現(xiàn)紅褐色熒光為NRP1陽(yáng)性。根據(jù)染色深度及染色面積進(jìn)行計(jì)分，Survivin染色深度評(píng)分：0分為無(wú)顯色或顯色不清，1分為淺黃色，2分為深黃色，3分為褐黃色。染色面積：0分：0%～5%，1分：>5%～35%，2分：>35%～65%，3分：>65%。染色深度與面積之和≥1分則為Survivin免疫組化法染色陽(yáng)性。NRP1染色深度評(píng)分：0分為無(wú)顯色或顯色不清，1分為淺紅色，2分為深紅色，3分為紅褐色。染色面積：0分：0%～5%，1分：>5%～35%，2分：>35%～65%，3分：>65%。染色深度與面積之和≥1分則為NRP1免疫組化法染色陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗(yàn)，應(yīng)用Kaplan-Meier計(jì)算生存率，影響胃癌術(shù)后預(yù)后的危險(xiǎn)因素應(yīng)用Cox回歸分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Survivin、NRP1在胃癌組織及正常胃黏膜組織中的表達(dá)

胃癌組織中Survivin陽(yáng)性表達(dá)率為86.67%，NRP1陽(yáng)性表達(dá)率為83.33%，而在胃正常黏膜組織中的表達(dá)分別為6.67%、5.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 Survivin、NRP1表達(dá)與胃癌組織臨床特征的關(guān)系

Survivin陽(yáng)性表達(dá)率與TNM分期、累及漿膜層、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05）。NRP1陽(yáng)性表達(dá)率與TNM分期、浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05）。

2.3 Survivin、NRP1陽(yáng)性患者預(yù)后因素分析

60例胃癌患者術(shù)后隨訪5年，共56例獲得隨訪，5年存活為25例，5年存活率為44.64%，其中Survivin陽(yáng)性存活率35.42%（17/56），NRP1陽(yáng)性存活率32.61%（15/56）。腫瘤直徑、累及漿膜層、浸潤(rùn)深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Survivin陽(yáng)性、NRP1陽(yáng)性與胃癌5年生存率顯著相關(guān)（P<0.05）。

2.4 影響胃癌術(shù)后生存率的Cox多因素分析

經(jīng)Cox多因素分析，患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Survivin陽(yáng)性、NRP1陽(yáng)性是影響胃癌遠(yuǎn)期預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

3 討論

Survivin是目前發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凋亡抑制因子，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂及抑制細(xì)胞凋亡的雙重作用。大量研究發(fā)現(xiàn)[9-12]，Survivin與惡性腫瘤發(fā)生及進(jìn)展有密切的關(guān)系，Survivin不僅能抑制凋亡蛋白酶活性，阻斷凋亡信號(hào)傳導(dǎo)，而且能在細(xì)胞有絲分裂前期特異性結(jié)合紡錘體微管導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞異常分裂及增殖。孫娟等[13]研究指出Survivin在所有能被檢測(cè)的惡性腫瘤組織中均有不同程度的表達(dá)，且與多種腫瘤生物學(xué)特征有密切的關(guān)系。Cheng等[14]研究指出，Survivin在胃癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為85.2%，且Survivin陽(yáng)性表達(dá)與胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移及淋巴管浸潤(rùn)有密切的關(guān)系。本研究應(yīng)用免疫組化法測(cè)定胃癌組織中Survivin表達(dá)情況，結(jié)果顯示，60例胃癌組織患者中Survivin陽(yáng)性表達(dá)率為86.67%，而在胃正常黏膜組織中的表達(dá)分別為6.67%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且Survivin陽(yáng)性表達(dá)率與TNM分期、累及漿膜層、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，因此通過(guò)檢測(cè)胃癌組織中Survivin表達(dá)能有效判斷胃癌發(fā)生及進(jìn)展情況。本研究發(fā)現(xiàn)，Survivin表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等傳統(tǒng)病理學(xué)指標(biāo)一樣，是影響胃癌術(shù)后5年生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，因此，作為TNM及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的補(bǔ)充，可將Survivin陽(yáng)性表達(dá)作為判斷胃癌預(yù)后的有價(jià)值指標(biāo)之一。

NRP1在腫瘤發(fā)生及病情進(jìn)展中的作用機(jī)制非常復(fù)雜[15]。Shahrabi等[16]發(fā)現(xiàn)NRP1除了在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)外，還可在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，從而提示NRP1可能在這兩個(gè)位置發(fā)揮作用。在內(nèi)皮細(xì)胞中，NRP1作為受體，可與VEGF結(jié)合，并增加其活性，從而增強(qiáng)VEGF誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂及細(xì)胞趨化性，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤血管生成[17]。研究發(fā)現(xiàn)[18]，部分腫瘤細(xì)胞中無(wú)VEGF表達(dá)，因此NRP1在腫瘤細(xì)胞中可通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)途徑或與VEGF結(jié)合形成相關(guān)配體從而實(shí)現(xiàn)腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移過(guò)程。Talagas等[19]也發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤細(xì)胞中NRP1可通過(guò)調(diào)控P13K/AKT信號(hào)通路及上調(diào)VEGF表達(dá)水平等途徑同時(shí)影響肺癌的遠(yuǎn)期預(yù)后。Shahrabi等[20]研究指出，NRP1表達(dá)與腫瘤細(xì)胞微血管生成及VEGF表達(dá)水平上調(diào)有密切的關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，正常胃黏膜組織中NRP1水平顯著低于胃癌組織，NRP1水平與胃癌NRP1mRNA表達(dá)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期等臨床特征有關(guān)，表明NRP1高表達(dá)水平可促進(jìn)腫瘤微血管生成并與胃癌侵襲及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為關(guān)系密切，通過(guò)測(cè)定胃癌組織中NRP1表達(dá)可判斷胃癌侵襲性及轉(zhuǎn)移性。此外，本研究經(jīng)Cox風(fēng)險(xiǎn)模型分析顯示，NRP1陽(yáng)性表達(dá)是影響胃癌患者術(shù)后預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，可作為評(píng)價(jià)胃癌病情發(fā)生、進(jìn)展及預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

綜上所述，Survivin、NRP1可能與胃癌發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)。Survivin、NRP1表達(dá)狀態(tài)是胃癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，其陽(yáng)性表達(dá)可提示患者預(yù)后不良。

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（收稿日期：2016-07-01）