HPLC測定及比較大青葉與板藍根中靛玉紅含量

梁青云　梁真寶　黎艷光　李海怡　李喜蘭

（吉林大學珠海學院，廣東珠?！?19100）

HPLC測定及比較大青葉與板藍根中靛玉紅含量

梁青云梁真寶黎艷光李海怡李喜蘭*

（吉林大學珠海學院，廣東珠海519100）

目的：采用了高效液相色譜法對大青葉和板藍根中的靛玉紅進行測定并測定靛玉紅在大青葉及板藍根中的含量，再對兩者的靛玉紅含量進行比較。方法：采用反相C18色譜柱（4.6mm×15cm），柱溫30℃，流動相為甲醇-水（65：35），檢測波長285nm，進樣量10μl。結果：檢測出在大青葉和板藍根中均可提取出靛玉紅成份，而大青葉中靛玉紅含量多于板藍根中的靛玉紅含量近乎4倍。結論：在今后對于靛玉紅的研究不再僅限于板藍根之中，大青葉也可以作為很好的研究藥材對象。

大青葉板藍根菘藍靛玉紅高效液相色譜法

0　引言

大青葉與板藍根均屬十字花科植物——菘藍（Isatis indigotica Fortune），大青葉即為菘藍的干燥葉，臨床上大青葉可用于治療各種病毒性流行性感冒、乙肝腦炎和流行性腮腺炎等傳染性疾?。?］。板藍根即為菘藍的干燥根，可用于治療溫病發(fā)熱、發(fā)斑、咽喉腫痛、流行性乙型腦炎等癥，近年來現(xiàn)代藥理也明確了板藍根在抗細菌內毒素、抗炎抑菌、抗病毒等方面的作用［1］［2］。而靛玉紅作為大青葉與板藍根抑菌、抗炎作用的有效成份之一，靛玉紅就有具有抑菌、解熱、抗炎等作用，且能夠治療慢性粒細胞白血病、抗腫瘤等。本實驗將采用四氫呋喃分別提取大青葉和板藍根中的有效成份，以靛玉紅標準樣品為對照品并用HPLC對大青葉和板藍根的提取液進行測定，同時對測得兩者靛玉紅的含量進行比較。

另外，劉遠［3］鑒定的靛玉紅結構數(shù)據(jù)：紫紅色針狀結晶（氯仿），m p＞300℃。ESI-MS m/z：547［2M+Na］+。H-NMR（400MHz，DMSO-d6）δ：10.99（1H，s，NH）、10.87（1H，s，NH）、8.75（1H，d， J=7.8H z，H-4'）、7.64（1H，d，J=7.6H z，H-4）、7.56（1H，t，J=7.8Hz，H-6'）、7.40（1H，d，J=7.8Hz，H-7'）、7.24（1H，t，J=7. 6Hz，H-6）、7.00（2H，t，J=7.8Hz，H-5，5'）、6.89（1H，d，J=7.6 Hz，H-7）；13C-NMR（100MH z，DMSO-d6）δ：188.6（C-3）、170.9（C-2'）、152.5（C-7a）、140.9（C-7'a）、138.3（C-2）、137.1（C-6）、129.3（C-4'）、124.6（C-4）、124.3（C-6'）、121.4（C-3' a）、121.2（C-5，C-5'）、119.0（C-3a）、113.4（C-7）、109.6（C-T）、106.5（C-3'）等提供了更多關于靛玉紅結構信息，在以下試驗中更有效地采用適當?shù)脑囼灧椒ㄟM行。

靛玉紅化學結構如圖1：

1　材料與方法

1.1材料

大青葉（安徽）；板藍根（安徽）。

1.2試劑

靛玉紅標準品（含量97%，上海源葉生物科技有限公司）；四氫呋喃（GR，上海晶純生化科技股份有限公司）；四氫呋喃（AR，鄭州廣杰化工有限公司）；甲醇（GR，廣州市昱浩貿(mào)易有限公司）。

1.3儀器

高效液相色譜儀（日本島津公司）；DHG-9140A型恒熱鼓風干燥箱（上海一恒科技儀器有限公司）；DHT型磁力攪拌電熱套（山東省菏澤市祥龍電子科技有限公司）；蒸餾裝置（實驗室自制）；索氏提取器裝置（實驗室自制）。

1.4樣品配制

（1）大青葉中有效成份的提取。精密稱取10g干燥大青葉，濾紙包好裝入搭好的索氏提取裝置，在500m L平底燒瓶加入250m L四氫呋喃溶液（AR），采用連續(xù)回流的方法回流4h。得到的提取液減壓蒸餾至粘稠狀，定容至5m L，為葉提取液。（2）板藍根中有效成份的提取。取足夠的干燥板藍根攪碎成粗粉，過40目篩，精密稱取10g板藍根粉，加入25m L四氫呋喃溶液（AR），回流4h。減壓過濾得到的提取液蒸餾濃縮至粘稠狀，用四氫呋喃（AR）定容至5m L，為根提取液。（3）HPLC靛玉紅標準溶液的配制。稱取5mg靛玉紅標準品，加入四氫呋喃（GR）溶解定容至100m L。分別取上述靛玉紅溶液1.0、2.0、3.0、4. 0、5.0m L于5個5m L容量瓶中，用四氫呋喃（GR）定容，即得濃度分別為10、20、30、40、50μg/m L的靛玉紅標準溶液。

表1　HPLC測定靛玉紅標準曲線數(shù)據(jù)表Tab.1　HPLC determ ination of indirubin standard curve data tab le

1.5HPLC測定

（1）實驗條件［4］色譜柱：反相C18柱4.6mm×15cm，流動相：甲醇-水（65：35），檢測波長：285nm，進樣量：10μL，柱溫：30℃。（2）制作靛玉紅標準曲線。在上述色譜條件下，分別精密吸取制得各不同濃度的靛玉紅標準溶液注入高效液相色譜儀中，測定峰面積，以峰面積對濃度作圖得出靛玉紅的回歸方程。（3）HPLC標準曲線求出大青葉與板藍根中靛玉紅含量。分別將葉提取液、根提取液通過微孔濾膜（0.45μm）濾過，得到濾液。分別吸取濾液10μL注入高效液相色譜儀，按已確定的色譜條件記錄峰面積，代入HPLC求得的靛玉紅標準曲線回歸方程中計算靛玉紅的含量。

2　結果

如表1所示，在高效液相色譜檢測中，標準樣品靛玉紅在14m in左右的時間出峰，而檢測根提取液和葉提取液時在14m in左右也有較高峰出現(xiàn)，即靛玉紅成分。以標準樣品靛玉紅的濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得出靛玉紅的回歸方程為y=24841x-23869，且R^2=0.99939，因此靛玉紅在10-20μg/m L范圍內有良好的線性關系。而HPLC測得的試樣中靛玉紅濃度可通過該回歸方程求得如表2所示。

通過表2可得出，靛玉紅在大青葉中的含量比在板藍根中的含量高。由HPLC測得的實驗數(shù)據(jù)，在測定標準樣品中靛玉紅的色譜圖在可以確定大青葉及板藍根中含有靛玉紅成份，而通過大青葉和板藍根提取液中靛玉紅含量的測定和比較，可明顯得出靛玉紅在大青葉的含量均高于其在板藍根中的含量，甚至是多出4倍以上。

3　討論

在實驗中可以發(fā)現(xiàn)靛玉紅在板藍根中的含量是很少的，反而大青葉中靛玉紅的含量相對多，因此在今后對于靛玉紅的研究不再僅限于板藍根之中，大青葉也可以作為很好的研究藥材對象。另外在查閱了許多文獻之后，發(fā)現(xiàn)大部分都是用蒸煮法提取大青葉或者板藍根的有效成份，故本次實驗通過索氏提取器裝置等連續(xù)回流方法對大青葉的提取，既減少了提取溶液的過濾純化繁瑣步驟，又能保證大青葉和板藍根中有效成份的提取完全。另外在對于靛玉紅的提取及檢測在時間、提取儀器精密性檢查及改變提取溶劑等方面仍可有再進一步探索和改進。

4　致謝

感謝廣東大學生科技創(chuàng)新培育基金及吉林大學珠海學院對本研究的大力支持，讓我們能夠在優(yōu)良的實驗條件下順利完成本次實驗。感謝吉林大學珠海學院化學與藥學系的各位老師及輔導員在學習和生活上為我們提供便利和幫助。

［1］王虹霞，梁劍平，李雪虎，等.HPLC法測定大青葉中靛玉紅的含量［J］.湖南農(nóng)業(yè)科學，2012，（03）：87-89.

［2］李霞.板藍根化學成分及質量控制研究［D］.山西：山西醫(yī)科大學，201 0.

［3］劉遠.馬藍葉化學成分研究［J］.沈陽：沈陽藥科大學，2009.

［4］馬莉，孫琴，李友，等.HPLC法測定板藍根藥材及制劑中靛藍和靛玉紅含量［J］.藥物分析雜志，2010，30（9）：1642-1645.

［5］熊麗，干國平.復方板藍根顆粒中靛藍和靛玉紅的含量測定［J］.中國藥師，2007，10（10）：1047-1048.

［6］董娟娥，龔明貴，梁宗鎖.板藍根、大青葉中靛藍和靛玉紅的測定方法比較［J］.西北農(nóng)林科技大學學報（自然科學版），2007，35（2）：215-21 9.

Objective：Used HPLC to determ ine the indirubin content in and to measure the indirubin of Folium Isatidis and Radix Isatidis.Then we compared the both contents of indirubin.Method：The chromatographic separation was performed w ith reversed phase C18chromatographic column（4.6mm× 15cm）and column temperature of30℃.The mobile phase consisted of methanol-water（65：35），the detection wavelength was285nm and10μl of the sample volume.Result：By the HPLC，it can extract the indirubin from.

Folium Isatidis；Radix Isatidis；Isatis indigotica Fortune；indirubin；HPLC

廣東省大學生科技創(chuàng)新培育專項基金（NO：pdjh2015b0931）；2015年度大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃院級項目（NO：DC2015007）

梁青云（1994—），女，廣東茂名人，在讀本科生，就讀專業(yè)為藥物制劑，主要研究方向為藥物檢測。

★李喜蘭（1980—），女，大學講師，主要研究方向為精細化學品。E-mail：405689962@qq.com。