植物丙二醛含量測(cè)定試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

李子芳+吳錫冬

摘 要：針對(duì)干旱脅迫對(duì)植物丙二醛和蛋白質(zhì)含量的影響試驗(yàn)進(jìn)行了試驗(yàn)設(shè)計(jì)，初步得出了一套可行的方案，并從試驗(yàn)步驟、試驗(yàn)項(xiàng)目的特色或創(chuàng)新、試驗(yàn)可行性分析等幾個(gè)方面進(jìn)行了詳細(xì)論述，以便統(tǒng)籌試驗(yàn)并為學(xué)生的具體操作提供理論指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案；丙二醛；蛋白質(zhì)

中圖分類號(hào)：Q94-3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.09.011

Abstract： The experimental design was carried out for measuring the effect of drought stress on the content of malondialdehyde and protein of plants. A feasible rough plan was made. It discussed the procedure， item feature， and feasibility analysis of the experiment. Therefore， the overall experiment was ready for the concrete details.

Key words： experimental design scheme； malondialdehyde； protein

干旱脅迫可使植物脫水，并破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，形成膜脂過氧化。通過測(cè)定丙二醛（MDA）含量可了解膜脂過氧化的程度，間接反映膜系統(tǒng)受損程度以及植物的抗逆性。

傳統(tǒng)檢測(cè)MDA含量試驗(yàn)測(cè)得的數(shù)據(jù)，既受學(xué)生動(dòng)手能力的影響，又受測(cè)定方式的局限，因此，很難真實(shí)有效。本項(xiàng)目擬采用測(cè)定方式嚴(yán)謹(jǐn)，在科研中廣泛采用的南京建成試劑盒，使試驗(yàn)條件更易控制，數(shù)據(jù)更為準(zhǔn)確；針對(duì)細(xì)胞破碎程度不同，在試驗(yàn)中引入蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，排除誤差干擾；使學(xué)生參與從植物脅迫、試劑配制到細(xì)胞破碎、反應(yīng)及數(shù)據(jù)采集等一系列操作過程中，提高學(xué)生參與試驗(yàn)的整體性。通過這一系列的手段，激發(fā)學(xué)生對(duì)試驗(yàn)的參與熱情，提升科研認(rèn)知度，提高動(dòng)手能力和創(chuàng)新意識(shí)[1-3]。

1 試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

1.1 試驗(yàn)設(shè)置及樣品數(shù)

本試驗(yàn)共計(jì)6學(xué)時(shí)，每4位同學(xué)1組，每組同學(xué)檢測(cè)兩種植物的正常及干旱脅迫樣品，每個(gè)樣品3次重復(fù)。

1.2 試驗(yàn)材料的培養(yǎng)與處理

選用吊蘭和穿心蓮兩種較常見的觀葉植物作為試驗(yàn)材料，以幼莖或分蘗在幾種培養(yǎng)基質(zhì)中進(jìn)行生根。結(jié)果表明，珍珠巖的吸水力較好，植物生根最多。

植株培養(yǎng)1個(gè)月后，將其分為兩類，一類做干旱處理，基質(zhì)含水量保持在10%左右，另一類正常給水作為對(duì)照。這兩類植物在培養(yǎng)7～10 d后即可作為試驗(yàn)對(duì)象使用。

1.3 試驗(yàn)前期準(zhǔn)備及課后調(diào)查

要求學(xué)生仔細(xì)閱讀試劑盒說明書，并作好預(yù)習(xí)報(bào)告；在試驗(yàn)前熟悉各種儀器的操作方法，如移液器、渦旋混合器、離心機(jī)及分光光度計(jì)等，并通過多次練習(xí)達(dá)到準(zhǔn)確使用的目的。

學(xué)生自行準(zhǔn)備試驗(yàn)材料和配制試劑，教師僅進(jìn)行必要的指導(dǎo)。

課后通過不記名的方式請(qǐng)學(xué)生寫下對(duì)該試驗(yàn)項(xiàng)目的建議和意見，以便于試驗(yàn)的改進(jìn)。

1.4 操作步驟

1.4.1 酶液制備 參考文獻(xiàn)[4]的方法，各植株均取用同一部位的老葉作為待測(cè)樣品。將各樣品洗凈后，分別稱取0.2 g置于預(yù)冷的研缽中，加入液氮研磨成粉末，再放入2 mL 50 mmol·L-1預(yù)冷的磷酸緩沖液，轉(zhuǎn)入離心管中在4 ℃、12 000 r·min-1下離心20 min，上清液即為待測(cè)酶液。

1.4.2 MDA含量測(cè)定 參考文獻(xiàn)[5]的方法，每組樣品取3支一次性試管，按表1取用各試劑并用旋渦混勻器混勻，試管口用保鮮薄膜扎緊，用針頭刺一小孔，在95 ℃水浴鍋中水浴40 min，樣品取出后流水冷卻，然后在4 000 r·min-1下離心10 min。提取上清液，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)532 nm處測(cè)定各管吸光度值。

按下列公式計(jì)算組織中MDA含量：

組織中MDA含量（nmol·mg-1蛋白）=（測(cè)定OD值-空白OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（10 nmol·mL-1）/待測(cè)樣本蛋白濃度（mg蛋白/mL蛋白）

1.4.3 蛋白定量測(cè)定 參考文獻(xiàn)[6]的方法，每組樣品取3支一次性試管，按表2取用各試劑并混勻，靜置10 min，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)595 nm處測(cè)定各管吸光度值。

按下列公式計(jì)算組織中的蛋白含量：

待測(cè)樣本蛋白濃度（g·L-1）=（測(cè)定OD值-空白OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（0.563 g·L-1）

2 試驗(yàn)結(jié)果

每個(gè)試驗(yàn)小組的測(cè)定結(jié)果均重復(fù)性較高，且趨勢(shì)一致。

通過各組數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及計(jì)算表明，干旱脅迫均對(duì)吊蘭和穿心蓮兩種植物的丙二醛和蛋白質(zhì)含量造成了影響，其含量均有一定程度的增加。其中，吊蘭的丙二醛含量較穿心蓮低而蛋白質(zhì)含量則較高，說明吊蘭的耐旱品質(zhì)要較穿心蓮為高。

3 試驗(yàn)方案可行性分析

（1）試驗(yàn)對(duì)象為幾種常見的室內(nèi)觀葉植物，取材方便，樣本量大。預(yù)備試驗(yàn)已用陶土、珍珠巖、石英砂等物質(zhì)為培養(yǎng)基質(zhì)，摸索出了較適宜進(jìn)行干旱脅迫的方式；并通過不同時(shí)間的干旱處理，確定了最佳干旱處理期限。

（2）與項(xiàng)目組成員探討如何合理有序地安排試驗(yàn)進(jìn)度。使學(xué)生既能從容操作，不因試驗(yàn)過于緊張而造成失誤，又不會(huì)使試驗(yàn)安排松散，分散精力。

（3）在試驗(yàn)過程中，使學(xué)生的樣本取用位置一致，設(shè)立對(duì)照和重復(fù)，排除試驗(yàn)誤差。樣品提取充分，能正確測(cè)定植物的丙二醛和蛋白質(zhì)含量。

（4）提交試驗(yàn)的預(yù)習(xí)和試驗(yàn)報(bào)告，完整再現(xiàn)試驗(yàn)的準(zhǔn)備和測(cè)定過程。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，分析植物的膜脂過氧化程度。指出試驗(yàn)中應(yīng)注意的事項(xiàng)，對(duì)試驗(yàn)中存在的潛在問題加以討論。

4 結(jié)論與討論

該試驗(yàn)方案的特色與創(chuàng)新為：（1）在試驗(yàn)的每一個(gè)過程中都由學(xué)生團(tuán)隊(duì)合作完成，教師僅對(duì)學(xué)生進(jìn)行必要的指導(dǎo)；（2）避免了使用如冰乙酸等傷害刺激性試劑，對(duì)操作人員無任何毒害，排除了傳統(tǒng)試驗(yàn)中沸水浴加熱時(shí)間不正確的問題；（3）采用綜合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方式，將丙二醛含量和細(xì)胞破碎程度綜合考量，對(duì)兩種植物的膜抗逆性能做出比較，提高了學(xué)生的科研認(rèn)知水平[7-9]。

使用試劑盒來測(cè)定植物樣本的丙二醛和蛋白質(zhì)含量，具有比傳統(tǒng)方法更加簡(jiǎn)便、快速，靈敏度和準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)。盡管在基礎(chǔ)理論知識(shí)層面和試驗(yàn)動(dòng)手操作技能方面，學(xué)生水平會(huì)表現(xiàn)出參差不齊[10]，但通過學(xué)生課上表現(xiàn)及調(diào)查試驗(yàn)課后的反饋發(fā)現(xiàn)，通過課前的充分準(zhǔn)備和練習(xí)，學(xué)生能積極參與試驗(yàn)并普遍對(duì)該試驗(yàn)認(rèn)同度較高。學(xué)生對(duì)精密試驗(yàn)儀器和高端測(cè)定方式感到新奇，因而激發(fā)了對(duì)試驗(yàn)的參與熱情，這不僅提升了科研認(rèn)知度，還在分工協(xié)作的過程中提高了動(dòng)手能力和創(chuàng)新意識(shí)。

回顧試驗(yàn)過程及學(xué)生反饋，本次試驗(yàn)項(xiàng)目的設(shè)立是一次積極有益的嘗試，將為以后此類試驗(yàn)項(xiàng)目的開設(shè)打下良好的基礎(chǔ)。

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