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    pH示差法測(cè)定不同品系元寶楓葉片花青苷含量

    2016-11-17 11:20:26杜曉茜豐震楊麗娟許超喬謙任紅劍
    天津農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年9期
    關(guān)鍵詞:元寶楓

    杜曉茜+豐震+楊麗娟+許超+喬謙+任紅劍+安凱

    摘 要:采集秋季轉(zhuǎn)色后的元寶楓無性系葉片作為試驗(yàn)材料,采用pH示差法測(cè)定其不同品系葉片中花青苷的含量。結(jié)果顯示:用恒溫震蕩培養(yǎng)箱25 ℃震蕩提取6 h提取效果最好;pH示差法選定pH 值是1.0和4.5,提取液的平衡時(shí)間是60 min。試驗(yàn)的平均回收率是96.66%,由此可見,該方法能有效消除溶液中雜質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響,可用于元寶楓花青苷的定量分析。在所測(cè)量的5個(gè)品系中,花青苷含量最高的品系是1-7號(hào),含量為0.845 3 mg·g-1,5個(gè)品系的平均花青苷含量是0.482 1 mg·g-1。

    關(guān)鍵詞:元寶楓;pH示差法;花青苷

    中圖分類號(hào):Q946.83+6 文件標(biāo)識(shí)碼:A DOI 編碼:10.3969/j.issn.1006-6500.2016.09.008

    Abstract: In this study, the leaves of Acer truncatum Bunge were studied, and their total anthocyanin contents in different strains were investigated by pH-differential method. The results showed that using constant temperature oscillation incubator 25 ℃ oscillation extraction 6 hours it presented the best effect, and the pH selected were 1.0 and 4.0, and the buffering time was 60 minutes. By this method, the average recovery rate was 96.66%,therefore, this method can be used to the quantitative analysis of anthocyanins in Acer, and pH-differential method could eliminated the influence of impurities. Among the five strains,the content of anthocyanin in 1-7 was the highest ,which was 0.845 3 mg·g-1; the average anthocyanin content of these five strains was 0.482 1 mg·g-1.

    Key words: Acer truncatum Bunge; pH-differential method; anthocyanin

    元寶楓(Acer truncatum Bunge),槭樹科(Aceraceae)槭屬(Acer.L),是北方優(yōu)良的園林綠化樹種。秋季元寶楓葉色轉(zhuǎn)為黃色、橙色或鮮紅色,花青苷含量非常豐富[1]。本試驗(yàn)通過測(cè)定不同色系元寶楓葉片中花青苷含量,探討葉色與花青苷含量的關(guān)系,為高含量花青苷品系的開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

    花青苷廣泛存在于大多數(shù)彩色植物體內(nèi),是水溶性類黃酮物質(zhì)的一種,同時(shí)也是一種天然的食用色素,具有很多優(yōu)點(diǎn),如水溶性好、食用安全等,目前已普遍被消費(fèi)者所接受。此外,在健康養(yǎng)生方面花青苷也起到不可忽視的作用:能緩解視覺疲勞、增強(qiáng)記憶力,同時(shí)還能清除體內(nèi)過多的自由基[2],可以改善血液循環(huán)、預(yù)防心血管疾病、抗癌防癌[3]。元寶楓秋色葉中花青苷含量相當(dāng)豐富,葉片中花青苷的開發(fā)利用價(jià)值潛力無限。

    通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)花青苷的測(cè)定一般有3種方法:高效液相色譜法、單一pH法和pH示差法。高效液相色譜法具備高效、樣品不被破壞、靈敏度高、分析速度快、易回收等優(yōu)點(diǎn),且方法精密度高、重復(fù)性好,但在不明確樣品中的花青苷單體組成時(shí),該方法的使用受到限制;單一pH法雖操作簡(jiǎn)單,但靈敏度低; pH示差法不僅操作方法簡(jiǎn)便、設(shè)備儀器價(jià)格低廉、便于推廣,而且準(zhǔn)確度較高、重現(xiàn)性好[4]。所以,本試驗(yàn)用pH示差法測(cè)定新選育品系花青苷含量差異,以篩選出高含量品系,發(fā)掘高含量品系在食品及保健品方面的應(yīng)用潛力,為元寶楓新品系的育種推廣提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 材料與儀器

    試驗(yàn)材料:本試驗(yàn)所用材料取自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)南校區(qū)試驗(yàn)田,均為嫁接繁殖的元寶楓無性系。共5個(gè)品系:1-1、1-6、1-7、6-1、6-2,前3個(gè)為秋季紅色葉品系,后2個(gè)為秋季黃色葉品系。于2015年11月至12月期間葉片轉(zhuǎn)色后采集葉片并進(jìn)行試驗(yàn)。

    試驗(yàn)儀器:UV-1600 型紫外-可見分光光度計(jì)( 尤尼科儀器有限公司) 、電子分析天平( 上海越平科學(xué)儀器有限公司) 、PHSJ-4A 型酸度計(jì)( 上海雷磁創(chuàng)益儀器儀表有限公司) 、RE52CS-1 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 ( 上海亞榮生化儀器廠)、HZ-8211K型恒溫震蕩箱。

    1.2 試驗(yàn)試劑

    1.2.1 試驗(yàn)試劑 無水乙醇、濃鹽酸、檸檬酸、檸檬酸鈉(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司) 等。以上試劑均為分析純。

    1.2.2 試劑的配制 1%鹽酸乙醇:濃鹽酸與無水乙醇體積比1∶99配制。1.2 mol·L-1鹽酸-70%乙醇溶液:濃鹽酸、無水乙醇與去離子水體積比是1∶7∶2。pH計(jì)緩沖液:pH計(jì)自帶的pH值為4.0和6.86的緩沖劑粉配制。

    1.3 元寶楓花青苷含量的定性分析

    1.3.1 最佳浸提溫度的選擇 稱取1 g植物材料迅速放入研缽中,液氮研磨成粉狀,溶于50 mL 1%鹽酸乙醇溶液中,放于4 ℃冰箱靜置過夜。另外,稱取5份1 g植物材料研磨成粉后,然后放入裝有1%鹽酸乙醇溶液50 mL的錐形瓶中,至于 160 r·min-1震蕩培養(yǎng)箱中避光震蕩提取6 h,震蕩溫度分別設(shè)置成15,25,35,45,55 ℃[5]。浸提完成后過濾,殘?jiān)?30 nm處分別測(cè)定吸光度,確定最佳浸提溫度。

    1.3.2 pH值的選擇 pH示差法pH值的確定:將上述浸提液10倍稀釋后,用檸檬酸或檸檬酸鈉調(diào)節(jié)其pH值構(gòu)建pH梯度[6],以pH值為橫坐標(biāo)繪制pH值-OD值曲線,確定測(cè)量最佳pH值及pH示差法的最適pH值。要求所選定的兩個(gè)pH 值在其左右變動(dòng)時(shí)OD值變化不大。

    1.3.3 浸提液平衡時(shí)間的確定 在選定的最合適浸提溫度下浸提后,對(duì)浸提液進(jìn)行稀釋,然后在選定的兩個(gè)pH值條件下每隔10 min測(cè)1次提取液的吸光度,記錄OD值隨時(shí)間的變化。

    1.3.4 回收率的計(jì)算 通過加入回收法測(cè)定本試驗(yàn)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

    1.3.5 不同品系花青苷含量的測(cè)定 將浸提液靜置至反應(yīng)平衡后,在已測(cè)得的最佳 pH 值下,測(cè)量花青苷的OD值,平行測(cè)定6 次,算出花青苷含量。

    花青苷含量計(jì)算公式:花青苷含量(mg·g-1) = ΔDVFM × 1 000 /(εm)[7]

    式中:ΔD為 pH 值為1.0,4.5 時(shí)吸光度的差值; V為稀釋體積(單位,L); F為稀釋倍數(shù); M為矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量449.2 g·mol-1;ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)26 900 L·(mol·cm) -1;m為樣品質(zhì)量(單位,g)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 最佳浸提溫度

    相關(guān)研究表明,溫度對(duì)花青苷的穩(wěn)定性有顯著影響。當(dāng)溫度升高到60 ℃時(shí),浸提液中的絕大多數(shù)的花青苷會(huì)變成查爾酮式結(jié)構(gòu)[8-9],而浸提液的顏色也幾近無色。所以,本試驗(yàn)以溫度為變量設(shè)置溫度梯度,以溫度為橫坐標(biāo)繪制溫度-OD值柱形圖,通過OD值的測(cè)定來確定最佳浸提溫度,結(jié)果如圖1示。在溫度為25 ℃時(shí),浸提液的OD值最高;且通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度為15,25,35,45 ℃時(shí)浸提液的OD值相差不大,即浸提溫度在15~45 ℃之間浮動(dòng)時(shí)對(duì)花青苷浸提效果的影響較小;當(dāng)溫度為5 ℃時(shí),浸提液的OD值相對(duì)較小,可見溫度太低時(shí),葉片中的花青苷會(huì)浸提不完全;在浸提溫度為55 ℃時(shí)浸提液的OD值開始下降,即高溫造成了花青苷結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變。綜上所述,25 ℃為花青苷浸提的最佳溫度。

    2.2 pH值的選擇

    花青苷是極性化合物,易溶于水等非極性有機(jī)溶劑,在pH值不同的溶劑中由于分子結(jié)構(gòu)的不同會(huì)呈現(xiàn)不同的顏色。在pH值小于或等于3的酸性條件下可以穩(wěn)定存在,其顏色也隨pH值的變化而變化,pH<7時(shí)為穩(wěn)定存在的紅色,pH>7時(shí)不能穩(wěn)定存在[10],所以,本試驗(yàn)在酸性介質(zhì)中測(cè)定。以pH值為變量繪制的pH值-OD值曲線如圖2所示。由此圖可以得出:在pH值等于1的時(shí)候,花青苷含量最高即在pH值等于1時(shí)花青苷最穩(wěn)定;且pH值在0.5~1.5、4.0~5.0之間變動(dòng)時(shí)OD值上下變動(dòng)幅度不大,花青苷存在相對(duì)穩(wěn)定,符合pH示差法的試驗(yàn)要求??梢缘贸鼋Y(jié)論:本試驗(yàn)中示差法選定的pH值為1.0,4.5。

    2.3 浸提液平衡時(shí)間

    花青苷在不同pH 值的溶液中存在狀態(tài)不一樣[11],在加入不同pH值的緩沖液后,必須靜置一段時(shí)間,使溶液達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡后,再進(jìn)行吸光度的測(cè)定。通過對(duì)浸提液稀釋后吸光度的測(cè)定,結(jié)果見表1。結(jié)果表明,樣品稀釋60 min后OD值不再變化,因此,本試驗(yàn)選擇的平衡時(shí)間為60 min。

    2.4 回收率計(jì)算

    將浸提液10倍稀釋后取兩份等體積的溶液(標(biāo)號(hào)A、B)放入干燥器內(nèi)50 ℃以下干燥。材料A完全干燥后一份加入之前一樣體積的浸提液;另一份加入等體積的1.2 mol·L-1鹽酸-70%乙醇溶液,測(cè)得量為加標(biāo)量;將材料A測(cè)得的花青苷含量減去原花青苷浸提液中的含量計(jì)為實(shí)際測(cè)得量,重復(fù)測(cè)定3次。測(cè)定結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明:樣品最高回收率是97.14%,最低回收率是96.39%,平均回收率為96.66%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差是0.42%;回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差均符合試驗(yàn)要求,所以用本方法測(cè)定花青苷含量準(zhǔn)確可靠。

    2.5 不同無性系花青苷含量的測(cè)定

    通過pH示差法測(cè)得的元寶楓各個(gè)品系的花青苷含量如表3所示。可以看出:花青苷含量最高的是1-7,含量為0.845 3 mg·g-1;花青苷含量最低的是6-1,含量為0.134 8 mg·g-1;5個(gè)品系的平均花青苷含量是0.482 1 mg·g-1。紅色品系(1-1、1-6、1-7)花青苷平均含量是0.766 4 mg·g-1,黃色品系(6-1、6-2)的花青苷平均含量是0.194 8 mg·g-1,紅色品系中花青苷平均含量是黃色品系平均含量的4倍。由此可知:本試驗(yàn)田所培育的無性系元寶楓葉片中花青苷的含量非常豐富,尤其是紅色品系中的1-7號(hào),高含量的花青苷使其在花青苷的提取應(yīng)用方面起到不容忽視的作用,如加工成食品及保健產(chǎn)品。同時(shí),高含量的花青苷使其葉色更鮮紅,在秋季表現(xiàn)出優(yōu)良的觀賞特性,在同類型的秋季觀葉樹種中更具有園林應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)[12-14]。

    3 結(jié)論與討論

    本試驗(yàn)從山東農(nóng)業(yè)大學(xué)南校區(qū)試驗(yàn)田選擇了5個(gè)不同品系的元寶楓,3個(gè)紅色品系,2個(gè)黃色品系,通過pH示差法對(duì)其花青苷含量進(jìn)行測(cè)定比較,同時(shí)對(duì)其浸提條件也進(jìn)行了比較優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果顯示:浸提溫度和pH值對(duì)花青苷含量的測(cè)定有很大的影響,在溫度為25 ℃和pH值為1的條件下浸提效果最佳;花青苷含量最高的是無性系1-7號(hào),含量為0.845 3 mg·g-1;5個(gè)品系的平均花青苷含量是0.482 1 mg·g-1,紅色品系(1-1、1-6、1-7)花青苷平均含量是0.766 4 mg·g-1,黃色品系(6-1、6-2)的花青苷平均含量是0.194 8 mg·g-1,紅色品系中花青苷平均含量是黃色品系平均含量的4倍。因此,高含量的花青苷使本試驗(yàn)田中的紅色品系在提取色素和秋季葉顯色方面都有很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。

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