高效降酚菌株GY8培養(yǎng)基的優(yōu)化

呂建華+李宏+薛智權(quán)

摘 要：通過在無機鹽培養(yǎng)基中額外添加碳氮源，研究不同碳氮源對熱帶假絲酵母菌株GY8降酚性能的影響，從而對該菌株培養(yǎng)基進行優(yōu)化。結(jié)果表明，通過添加額外的碳源和氮源均可促進熱帶假絲酵母菌株GY8的生長。采用的不同碳源中，最適碳源為甲醇，其最適濃度為4 g·L-1。采用的不同氮源中，有機氮源比無機氮源更加有利于熱帶假絲酵母菌株GY8對苯酚的降解。有機氮源中，酵母膏比蛋白胨更有益于菌株GY8對苯酚的降解，其最適濃度為0.5 g·L-1。

關(guān)鍵詞：熱帶假絲酵母；苯酚和酚類化合物；生物降解

中圖分類號：Q93 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.09.009

Abstract：In this paper， the optimum medium condition for phenol degradation property of Candida tropicalis GY8 was investigated by augmenting the inorganic salt medium with different carbon and nitrogen sources. The results showed that additional carbon and nitrogen sources in medium can promote Candida tropicalis GY8 growth. Among the different carbon sources， the optimum carbon source was methanol， and the optimum concentration was 4 g·L-1. The organic nitrogen sources were significantly conductive than inorganic nitrogen sources to Candida tropicalis GY8 removing phenol. Moreover， yeast extracted had better effect on GY8 to degrade phenol than peptoneamong organic nitrogen sources. 0.5 g·L-1of yeast extracted was optimum for maximum phenol removal.

Key words： Candida tropicalis； phenol and phenolic compounds； biodegradation

由于芳香族化合物的毒性及其所致疾病的難治性，其生物降解受到了許多行業(yè)研究人員的高度重視。苯酚作為最常見的芳香族化合物之一，廣泛存在于諸如煤氣化、焦炭生產(chǎn)、醫(yī)藥、農(nóng)藥、肥料、染料制造、化學(xué)合成、紙漿和造紙等行業(yè)的廢水中，其含量可以高達6 g·L-1 [1-2]。高濃度的苯酚已被用作一般的消毒劑，對生物有機體有毒。1 mg·L-1或以上濃度的苯酚就會對水生生物造成影響。即使在相對低濃度的情況下，其對微生物也具有毒性（特別是未馴化的微生物）。另外，苯酚可對將它作為生長底物進行代謝的那些物種產(chǎn)生生長抑制[3]。

微生物分解有機物一般利用有機污染物作為碳源，但同時也需要其他的營養(yǎng)物質(zhì)，如氮源、能源、無機鹽和水。研究表明，某些異生物質(zhì)化合物的降解率可以通過增加額外的碳源或其他營養(yǎng)化合物如氮氣、磷酸鹽以及礦物成分等而得到提高。一些常規(guī)的碳源，如葡萄糖、谷氨酸鈉和酵母提取物等已被用于促進對有毒化學(xué)品的降解[4-9]。Yu 和 Ward[10]報道，五氯苯酚（PCP）的降解速率和降解程度在加入葡萄糖和蛋白胨后均顯著增加。Topp和Hanson[11]發(fā)現(xiàn)，葡萄糖可刺激細胞活力和五氯苯酚的降解。Kotresha和Vidyasagar[12]報道，低濃度的葡萄糖和蛋白胨可以增強綠膿假單胞菌對苯酚的降解。這些結(jié)果表明，加入一些常規(guī)的碳源和氮源可以幫助減少異生物質(zhì)對細胞的毒性和生長抑制，從而增加異生物質(zhì)的轉(zhuǎn)化率。另外，常規(guī)碳源還可以為有機化合物的降解提供還原力[13]，或在某些情況下，作為生物降解酶的誘導(dǎo)劑[7]。

目前，在城市污水生物脫氮處理中，經(jīng)常需要額外添加碳源。甲醇、乙酸鈉是最常用的外加碳源[14]。在本研究中，利用各種碳源和氮源營養(yǎng)介質(zhì)對高效降酚真菌GY8進行生物刺激，以找出最佳的營養(yǎng)源，協(xié)同降解苯酚，從而為GY8菌治理含酚廢水提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株來源 降解苯酚菌株Candida tropicalis GY8篩選自山西省太谷縣污水處理廠曝氣池的污水樣品，由本實驗組保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA 固體培養(yǎng)基（g·L-1）：葡萄糖20，馬鈴薯浸粉3，瓊脂粉15，pH值自然，121 ℃，高壓滅菌20 min，冷卻后加入終濃度為0.025 g·L-1的氯霉素。

PDB培養(yǎng)基（g·L-1）：蛋白胨10，馬鈴薯粉5，葡萄糖15，NaCl 5，pH值自然，121 ℃，高壓滅菌20 min，冷卻后加入終濃度為0.025 g·L-1的氯霉素。

無機鹽培養(yǎng)基（g·L-1）：K2HPO4 0.4，KH2PO4 0.2，NaCl 0.1，MgSO4 0.1，MnSO4·H2O 0.01，Na2MoO4·2H2O 0.01，（NH4）2SO4 0.4，加水定容，121 ℃，高壓滅菌20 min，冷卻后加入終濃度為0.025 g·L-1的氯霉素，苯酚根據(jù)需要量加入。

1.2 方 法

1.2.1 菌株Candida tropicalisGY8活化 將保存菌株GY8在PDA固體培養(yǎng)基上劃線，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d。從PDA培養(yǎng)板挑取活化的單克隆菌，接種到滅菌的含PDB培養(yǎng)基的試管中，28 ℃，150 r·min-1，培養(yǎng)2 d后作為后續(xù)試驗使用菌株。

1.2.2 不同碳源對菌株GY8降酚性能的影響 在無機鹽培養(yǎng)基中分別加入碳原子含量相同的葡萄糖、甲醇和乙酸鈉作為培養(yǎng)基的碳源，培養(yǎng)基中的苯酚濃度為1.0 g·L-1。在恒溫振蕩培養(yǎng)箱（150 r·min-1，28 ℃）中培養(yǎng)8，24，48 h，用4-氨基安替比林分光光度法測定苯酚濃度[15]，計算苯酚降解率。苯酚降解率=（未接種前培養(yǎng)液中苯酚含量-培養(yǎng)結(jié)束殘余苯酚含量）/未接種前培養(yǎng)液苯酚含量×100%。用分光光度計于600 nm處測定48 h的光吸收度值，表示該菌體生長量，確定最適碳源。

1.2.3 不同氮源對菌株GY8降酚性能的影響 無機鹽培養(yǎng)基中的氮源分別用與原培養(yǎng)基氮含量相同的氯化銨、蛋白胨和酵母膏替代，培養(yǎng)基中的苯酚濃度為1.0 g·L-1。在恒溫振蕩培養(yǎng)箱（150 r·min-1，28 ℃）中培養(yǎng)8，24，48 h，測定苯酚降解率和48 h的菌體生長量，方法同1.2.2，確定最適氮源。

1.2.4 不同濃度的最適碳源對菌株GY8降酚性能的影響 根據(jù)1.2.2的試驗結(jié)果，在無機鹽培養(yǎng)基中分別加入碳含量為4，8，12，16 g·L-1甲醇作為培養(yǎng)基的碳源，培養(yǎng)基中的苯酚濃度為1.0 g·L-1。在恒溫振蕩培養(yǎng)箱（150 r·min-1，28 ℃）中培養(yǎng)8，24，48 h，測定苯酚降解率和48 h的菌體生長量，方法同1.2.2，確定最適碳源的最佳濃度。

1.2.5 不同濃度的最適氮源對GY8菌株降酚性能的影響 根據(jù)1.2.3的試驗結(jié)果，在無機鹽培養(yǎng)基中分別添加0.5，1，2，5，10 g·L-1的酵母膏作為氮源，培養(yǎng)基中的苯酚濃度為1.0 g·L-1。在恒溫振蕩培養(yǎng)箱（150 r·min-1，28 ℃）中培養(yǎng)8，24， 48 h，測定苯酚降解率和48 h的菌體生長量，方法同1.2.2，確定最適氮源的最佳濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同碳源對菌株GY8降酚性能的影響

在無機鹽培養(yǎng)基中分別以葡萄糖、甲醇和乙酸鈉作為培養(yǎng)基的碳源，培養(yǎng)基中的苯酚濃度為1.0 g·L-1。在恒溫振蕩培養(yǎng)箱（150 r·min-1，28 ℃）中培養(yǎng)8，24，48 h，不同碳源對GY8菌株降酚性能的影響如圖1和圖2。

從圖1可以看出，培養(yǎng)48 h后，4種培養(yǎng)基中菌體濃度都在增長，其中，加乙酸鈉的培養(yǎng)基中菌體增長最多，其次為甲醇、葡萄糖，無外加碳源的培養(yǎng)基中菌體增長最少。該結(jié)果表明，外加碳源均可以促進微生物的生長。

從圖2可以看出，培養(yǎng)8，24 ，48 h后，碳源為甲醇時培養(yǎng)基中的菌對苯酚降解速度最快，當碳源為葡萄糖或乙酸鈉時，在培養(yǎng)8 h時對GY8菌降解苯酚有一定的促進作用，但在培養(yǎng)24和48 h后，對GY8菌降解苯酚具有抑制作用。這可能是由于在培養(yǎng)初期，葡萄糖和乙酸鈉可以增強GY8菌對苯酚毒性的抵抗性，增加微生物的活性，從而提高對毒害有機物質(zhì)的處理效果[16-17]。KaiChee和Wang研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中補充葡萄糖后，培養(yǎng)基pH值由7.2降至4.3，從而導(dǎo)致4-氯酚降解率降低。當在葡萄糖存在時，通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，可以增強苯酚和4-氯酚降解率，并且可實現(xiàn)苯酚和4-氯酚的完全降解[18]。本研究在培養(yǎng)后期，GY8菌可能會代謝葡萄糖和乙酸鈉產(chǎn)生酸性物質(zhì)使培養(yǎng)基pH值降低[19]，抑制苯酚降解酶的活性。圖2的結(jié)果表明，甲醇對于GY8菌株生長是最有利的，因而增強了菌株對苯酚的降解能力，因此是最佳的碳源。

2.2 不同氮源對菌株GY8降酚性能的影響

無機鹽培養(yǎng)基中的氮源分別用與原培養(yǎng)基氮含量相同的氯化銨、蛋白胨和酵母膏替代，培養(yǎng)基中的苯酚濃度為1.0 g·L-1。在恒溫振蕩培養(yǎng)箱（150 r·min-1，28 ℃）中培養(yǎng)8，24，48 h，不同氮源對GY8菌株降酚性能的影響如圖3和圖4所示。

由圖3和圖4可以看出，無機鹽培養(yǎng)基中不同的氮源會明顯影響到菌株的生長以及苯酚的最終降解率。其中，當無機鹽培養(yǎng)基中氮源為酵母膏時，GY8菌株的生長速度及對苯酚的降解效果最佳，蛋白胨次之，然后是硫酸銨和氯化銨。該結(jié)果說明，有機氮源對于菌株的生長及苯酚的降解均優(yōu)于無機氮源。在有機氮源中，由于酵母膏含有谷氨酸、精氨酸、賴氨酸、麥角甾醇等生長刺激因子，因而可促進菌株生長，而蛋白胨可能會抑制菌株苯酚降解酶分泌[20-22]，故酵母膏對菌株降解苯酚的效率優(yōu)于蛋白胨。

2.3 不同濃度的最適碳源對菌株GY8降酚性能的影響

在無機鹽培養(yǎng)基中分別加入碳含量為4，8，12，16 g·L-1甲醇作為培養(yǎng)基的碳源，培養(yǎng)基中的苯酚濃度為1.0 g·L-1，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱（150 r·min-1，28 ℃）中培養(yǎng)8，24，48 h，不同含量的最適碳源對GY8菌株降酚性能的影響如圖5和圖6。

由圖5可以看出，培養(yǎng)48 h后，4種培養(yǎng)基中菌體濃度都在增長，其中，甲醇濃度為4 g·L-1和8 g·L-1的樣品菌體增長較多，兩組增長情況無顯著差異；甲醇濃度為12 g·L-1和16 g·L-1的樣品菌體增長較少，兩組增長情況無顯著差異。

從圖6可以看出，甲醇濃度為4 g·L-1的樣品中的菌降解速度最快，隨著甲醇濃度升高，GY8降解苯酚的速率依次降低，這可能是隨著外加碳源濃度的加大，菌株會優(yōu)先利用外加碳源，從而對苯酚的利用降低。另外，高濃度甲醇可能會對菌產(chǎn)生毒性作用，從而抑制菌株的生長[23]。

2.4 不同濃度的最適氮源對菌株GY8降酚性能的影響

在無機鹽培養(yǎng)基中分別加入氮含量為0.5，1，2，5，10 g·L-1酵母膏作為培養(yǎng)基的氮源，培養(yǎng)基中的苯酚濃度為1.0 g·L-1，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱（150 r·min-1，28 ℃）中培養(yǎng)8，24，48 h，不同含量的最適氮源對GY8菌株降酚性能的影響如圖7和圖8所示。

由圖7可以看出，無論酵母膏的濃度是多大，都會促進該菌的生長。從圖8可以看出，不同濃度的酵母膏對苯酚的降解率是有一定影響的，酵母膏濃度越高，苯酚降解率越低，當酵母膏的濃度為0.5 g·L-1時，苯酚降解率達到最大值。該結(jié)果表明，低濃度的氮源更利于苯酚的降解。

3 結(jié) 論

本試驗通過在培養(yǎng)基中添加不同的碳氮源，觀察熱帶假絲酵母菌株GY8的降酚活性，來確定該菌株的最適碳源和氮源。結(jié)果表明，通過添加額外的碳源和氮源均可以促進菌株GY8的生長。不同碳源中，最適碳源為甲醇，甲醇濃度為4 g·L-1時，苯酚降解率最大。不同氮源中，有機氮源比無機氮源更有利于熱帶假絲酵母菌株GY8對苯酚的降解，而有機氮源中酵母膏的效果優(yōu)于蛋白胨。酵母膏濃度為0.5 g·L-1時，苯酚降解率達到最大。本研究為將GY8菌株應(yīng)用于含酚廢水的治理提供了理論基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1]CROSS W H，CHIAN E K，POHLAND F G，et al.Anaerobic biological treatment of coal gasification effluent[J].Biotechnology and Bioengineering Symposium，1982，12（12）：349-363.

[2]TAY J H，HE Y X，YAN Y G.Improved anaerobic degradation of phenol with supplemental glucose[J].American Society of Civil Engineers，2001，127（1）：38-45.

[3]HILL G A，ROBINSON C W.Substrate inhibition kinetics- phenol degradation by pseudomonas-putida[J].Biotechnology and Bioengineering，1975，17（11）：1599-1615.

[4]PAPANASTASIOU A C，MAIER W J.Kinetics of biodegradation of 2，4-dichlorophenoxyacetate in the presence of glucose[J].Biotechnology and Bioengineering，1982，24（9）：2001-2011.

[5]TOPP E，CRAWFORD R L，HANSON R S.Influence of readily metabolizable Carbon on pentachlorophenol metabolism by a pentachlorophenol-degrading Flavobacterium sp[J].Applied and Environmental Microbiology，1988，54（10）：2452-2459.

[6]BOIESEN A，ARVIN E，BROHOLM K.Effect of mineral nutrients on the kinetics of methane utilization by methanotrophs[J].Biodegradation，1993，4（3）：163-170.

[7]CHAUDHURI B K，WIESMANN U.Enhanced anaerobic degradation of benzene by enrichment of mixed microbial culture and optimization of the culture medium[J].Applied Microbiology and Biotechnology，1995，43（1）：178-187.

[8]FAVA F，ARMENANTE P M，KAFKEWITZ D，et al.Influence of organic and inorganic growth supplements on the aerobic biodegradation of chlorobenzoic acids[J].Applied Microbiology and Biotechnology，1995，43（1）：171-177.

[9]STEFFENSEN W S，ALEXANDER M.Role of competition for inorganic nutrients in the biodegradation of mixtures of substrates[J].Applied and Environmental Microbiology，1995，61（8）：2859-2862.

[10]YU J，WARD O P.Studies on factors influencing the biodegradation of pentachlorophenol by a mixed bacterial culture[J].International Biodeterioration and Biodegradation，1994，33（3）：209-221.

[11]TOPP E，HANSON R S.Degradation of pentachlorophenol by a flavobacterium species grown in continuous culture under various nutrient limitations[J].Applied and Environmental Microbiology，1990，56（2）：541-544.

[12]KOTRESHA D，VIDYASAGAR G M.Isolation and characterisation of phenol-degrading Pseudomonas aeruginosa MTCC 4996[J].World Journal of Microbiology & Biotechnology，2008，24（4）：541-547.

[13]PERKINS P S，KOMISAR S J，PUHAKKA J A，et al.Effects of electron-donors and inhibitors on reductive dechlorination of 2，4，6-trichlorophenol[J].Water Research，1994，28（10）：2101-2107.

[14]孫裕.乙酸鈉與甲醇為外加碳源在反硝化過程中的比較[J].中國科技博覽，2010（33）：415-416.

[15]MARTIN R W.Rapid colorimetric estimation of phenol[J].Analytical Chemistry，1969，21（11）：1419-1420.

[16]慎義勇，張軼男，劉祖發(fā).葡萄糖對油制氣廢水生物降解影響的初步研究[J].中山大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2005，44（6）：114-117.

[17]王靜，姜立春.不同碳氮源對葡萄球菌JY02生長及降解苯酚能力的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（5）：311-315.

[18]LOH K C，WANG S J.Enhancement of biodegradation of phenol and a nongrowth substrate 4-chlorophenol by medium augmentation with conventional Carbon sources[J].Biodegradation，1997，8（5）：329-338.

[19]張海，曲睿娟，李日強.高效絮凝劑產(chǎn)生菌的分離選育及培養(yǎng)條件優(yōu)化[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（2）：222-228.

[20]楊峰曉，唐赟.不同碳氮源對嗜熱菌BF80生長和降解苯酚的影響[J].西華師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2008，29（2）：144-147， 152.

[21]李建國，班睿，司馬迎春，等.氮源對重組枯草芽胞桿菌24/pMX45核黃素發(fā)酵的影響[J].河北大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2003，23（2）：180-183.

[22]岳黎，唐赟，宋嫣，等.不同碳、氮源對苯酚降解菌菌XH-10的生長和苯酚降解的影響[J].西華師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2012，33（2）：146-153.

[23]張光亞，方柏山，閔航，等.甲醇對土壤甲烷氧化的影響及其微生物學(xué)機理[J].生態(tài)環(huán)境，2003，12（4）：469-472.