1株噻吩磺隆降解菌（Pseudomonas syringae LXL—3）的分離及降解特性

李曉樓　趙燕

摘要：從長期使用噻吩磺隆的農(nóng)田土壤中篩選到1株能高效降解噻吩磺隆的細菌LXL-3，按照16S rRNA分析方法并參照其生理生化特點，鑒定LXL-3為丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）。菌株LXL-3在含100 mg/L噻吩磺隆的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，噻吩磺隆降解率可達81%以上。菌株LXL-3的適宜pH值和適宜溫度分別為7.0～7.5、25～30℃，該菌還對噻吩磺隆和NaCl有很好的耐受性。研究表明，該菌在噻吩磺隆等農(nóng)藥污染物的生物治理方面具有較好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：噻吩磺隆；丁香假單胞菌；生物降解

中圖分類號：X172 文獻標志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0369—04

噻吩磺?。╰hifensulfuron-methyl）屬磺酰脲類除草劑，其化學名稱為3-（4-甲氧基-6-甲基-1，3，5-三嗪-2-基）-1-（2-甲氧基甲?；绶?3-基）-磺酰脲，常用作莖葉處理劑，通過抑制植物的乙酰乳酸合成酶（ALS）活性，干擾支鏈氨基酸的合成，最終導致敏感植物停止生長并死亡，目前在我國已廣泛用于防除小麥、玉米、大豆等作物田間的闊葉雜草。噻吩磺隆在農(nóng)業(yè)上的廣泛應(yīng)用在提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效率方面發(fā)揮了重要作用，但噻吩磺隆的殘留也對生態(tài)環(huán)境、食用農(nóng)產(chǎn)品安全及人類健康帶來了諸多不利影響，并會對一些敏感農(nóng)作物產(chǎn)生藥害，有時甚至會嚴重影響到下茬作物的正常生長。

已有研究表明，磺酰脲類除草劑的降解可包括光解、水解和生物降解等多種途徑，并認為微生物的降解作用是磺酰脲類除草劑的主要降解途徑。例如，Jean等發(fā)現(xiàn)噻吩磺隆在未經(jīng)滅菌處理的土壤中能快速降解，而在滅過菌的土壤中降解速度卻非常緩慢，表明土壤中的微生物對噻吩磺隆的降解起到了關(guān)鍵作用。目前，有關(guān)微生物降解噻吩磺隆這一領(lǐng)域的研究工作報道較少，已有文獻僅報道了一些噻吩磺隆降解菌株的分離以及相關(guān)降解特性的測試。例如，Geraldine等從土壤中分離獲得了1株伯克霍爾德氏菌（Burkholderia cepa-cia），該菌株可較快地降解噻吩磺??；黃星等人從土壤中分離到1株能高效降解噻吩磺隆的寡養(yǎng)單胞菌（Stenotroph-omonas sp.），并對該菌株的降解特性進行了系統(tǒng)研究；Hugh等則報道了7種可降解噻吩磺隆的細菌或放線菌。本研究以篩選出噻吩磺隆高效降解菌為研究對象，研究該菌株的生理生化特征及應(yīng)用性能，以期為后續(xù)的應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試劑與培養(yǎng)基

噻吩磺?。ā?8.5%）購自上海市農(nóng)藥研究所，噻吩磺隆標準品購自Sigma-Aldrich公司（美國），本試驗中所用其他化學試劑均為分析純或以上級別。

無機鹽培養(yǎng)基：1.0 g NH4N03，0.5 g KH2P04，1.5 gK2HP04，0.5 g NaCl，0.2 g MgSO₄·7H₂O，1 L蒸餾水，pH值7.0。在無機鹽培養(yǎng)基中加入噻吩磺隆即為噻吩磺隆分離培養(yǎng)基。

富集培養(yǎng)基：4 g牛肉浸出粉，10 g蛋白胨，5 g NaCl，3 g酵母浸出粉，1 L蒸餾水，pH值7.0。制作培養(yǎng)平板或者斜面時，在培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂。

1.2儀器

安捷倫1260/6430高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國），安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（3.0×100 mm，1.8-Micron），IKATM勻漿機（德國），振蕩培養(yǎng)箱（太倉華美），氮吹濃縮器，島津UV-2550分光光度計（日本）。

1.3噻吩磺隆降解菌的分離與鑒定

用于分離噻吩磺隆降解菌的土壤樣品取自四川遂寧農(nóng)田，取土耕地使用磺酰脲類除草劑已有5年以上歷史。在100 mL噻吩磺隆無機鹽培養(yǎng)基（噻吩磺隆濃度為50 mL/L）中加入2.0 g土樣，在30℃下振蕩培養(yǎng)5 d（150 r/min）。檢測降解效果，若5 d降解率大于30%，則吸取5 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到相同濃度的噻吩磺隆富集培養(yǎng)基中，并連續(xù)轉(zhuǎn)接5次（若降解率不足30%，則重新取土樣重復上述過程）。再次驗證降解效果后，在噻吩磺隆無機鹽培養(yǎng)基平板上涂布上述富集培養(yǎng)液，在30℃下倒置培養(yǎng)，挑取生長旺盛的菌落在培養(yǎng)平板上反復劃線分離以得到純培養(yǎng)物。最后，分離得到的純培養(yǎng)物被接種到富集培養(yǎng)基上保存?zhèn)溆谩?/p>

菌種的生理生化鑒定參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《Bergeys Mannual 0f Determinative Bacteriology》（9th edi-tion）進行，同時按照16S rRNA序列分析法進行菌種鑒定。

1.4降解菌株16S序列的測定

總DNA的提取采用CTAB法，16S rDNA引物設(shè)計參見文獻[9]：

正向引物為5′-AGAGrITTGATCCTGGCTCAG-3′；

反向引物為5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。

擴增反應(yīng)體系如下：5.0μl 10×聚合酶反應(yīng)緩沖液，4.0 μL dNTPs（2.5 mmoL/L），1.0μL引物（25μmoL/L），6.0μL Mg²⁺（25 mmoL/L），1.0μL模板DNA（濃度約為50 ng/μL），0.3 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL），加ddH₂O至50μL。反應(yīng)條件：95℃5 min；94℃30 s，52℃30 s，72℃75 s，30個循環(huán)；72℃10 min。擴增產(chǎn)物的測序由上海生工公司完成，后將所測序列輸入GenBank數(shù)據(jù)庫進行相關(guān)分析。

1.5噻吩磺隆的定量分析

提?。悍Q取10.0 mL（或固體樣品10.0 g）待測樣品于100 mL具塞錐形瓶中，加入40 mL提取液（pH值7.8的磷酸鹽緩沖溶液與甲醇等體積混合），加蓋后振蕩45 min（120 r/min），超聲萃取5 min，布氏漏斗抽濾，濾液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用提取液清洗、轉(zhuǎn)移并定容至50 mL。移取20 mL上述溶液在40℃水浴中減壓濃縮至10 mL，加10 mLpH值2.0的磷酸鹽緩沖液并調(diào)節(jié)最終pH值至2.0～3.0。

凈化：依次用5 mL甲醇、5 mL水、5 mL提取液淋洗活化固相萃取柱（Oasis HLB：200 mg，6 mL），將上述待凈化液轉(zhuǎn)移上柱，抽干。再用6 mL乙腈洗脫，收集至刻度管中，40℃氮吹至近干，取2.0 mL體積分數(shù)為50%的甲醇水溶液溶解樣品，過0.22μm濾膜，待測。

測定：用安捷倫1260/6430高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀進行分析，外標法定量。流動相[A相（0.1%甲酸+4 mmoL乙酸銨），B相（甲醇），等度洗脫]，質(zhì)譜采集參數(shù)（母離子388，子離子141/167，碎裂電壓125，碰撞能量10/10）。

1.5接種體的準備

在肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)所篩選的降解菌株，并通過離心方式收集菌體（6 000 r/min離心5 min），收集到的菌體用無菌水洗滌3遍后再用無菌生理鹽水重懸，使D_600nm=1.0，該懸浮液用作后續(xù)降解試驗的接種體（特別標注的除外）。

1.6溫度對菌株LXL-3降解噻吩磺隆的影響

在以噻吩磺隆為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基（噻吩磺隆濃度100 mg/L，pH值7.0）中接種3%的上述接種體，然后分別置于20、25、30、35、40℃條件下振蕩培養(yǎng)，每隔24 h以無菌操作的方式取樣1次，測定噻吩磺隆殘留濃度及D_600nm值。

1.7 pH值對菌株LXL-3降解噻吩磺隆的影響

將含有100 mg/L噻吩磺隆的無機鹽培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，然后分別接種3%的接種體，置于30℃下振蕩培養(yǎng)，定時取樣監(jiān)測噻吩磺隆降解情況及D_600nm值。

1.8菌株LXL-3對噻吩磺隆的耐受性

在含有不同濃度噻吩磺?。?0～800 mg/L）的無機鹽培養(yǎng)基中分別接人菌株LXL-3，然后在30℃下振蕩培養(yǎng)，定時取樣測試D_600nm，用以評價噻吩磺隆濃度對菌株LXL-3生長的影響。

1.9菌株LXL-3對NaCl的耐受性

調(diào)節(jié)無機鹽培養(yǎng)基（含有100 mg/L噻吩磺隆）中的NaCl含量，使其NaCl含量分別為0.5%（作參照）、1.0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%（共6組），然后分別接人等量的菌株LXL-3，在30℃下振蕩培養(yǎng)，定時取樣測試D_600nm，用以評價菌株LXL-3對鹽的耐受性。

1.10應(yīng)用菌株LXL-3降解土壤中的噻吩磺隆

土壤樣品取自四川省遂寧市射洪縣農(nóng)田，分4組，A組：滅菌土壤（新鮮土壤于121℃下滅菌30 min）；B組：新鮮土壤；C組：滅菌土壤中添加菌株LXL-3；D組：新鮮土壤中添加菌株LXL-3。另外，每組中噻吩磺隆濃度均為100 mg/kg。最后將其置于30℃下培養(yǎng)，每隔24 h取樣測定噻吩磺隆的殘留濃度。

2結(jié)果與分析

2.1噻吩磺隆降解菌株的鑒定及特性

從土壤中分離到1株能以噻吩磺隆為唯一碳源的菌株，將其命名為LXL-3。該菌株為稍有彎曲的桿狀菌，大小為（0.5～0.8）μm×（2.0～2.5）μm，革蘭氏陰性，有1～7根鞭毛，可運動，不產(chǎn)芽孢，好氧生活，在營養(yǎng)肉湯平板上可形成表面濕潤的圓形菌落。氧化酶、接觸酶、明膠液化試驗及V.P試驗均為陽性，而淀粉水解試驗和反硝化試驗呈陰性。菌株TJXL-3經(jīng)鑒定為丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae），其生化鑒定結(jié)果與按照16S rRNA分析方法所得到的結(jié)果一致（菌株LXL-3的16S rRNA分析委托上海生工公司完成，GenBank登錄號為KP125318）。

2.2溫度和pH值對于菌株LXL-3生長及降解噻吩磺隆的影響

菌株LXL-3在25～30℃條件下的生長狀況要優(yōu)于其他溫度條件，并且在這一溫度下降解噻吩磺隆的效率也最高（圖1、圖2），在5 d后噻吩磺?。ㄆ鹗紳舛葹?00 mg/L）的降解率能達到99.0%以上，表明菌株LXL-3生長及降解噻吩磺隆的適宜溫度為25～30℃。當溫度為35℃時，菌株LXL-3的生長狀況以及降解噻吩磺隆的效率會相對差一些，但是仍然處于較高的水平。若溫度達到40℃，菌株的生長和噻吩磺隆降解率都會大幅度下降，在40℃下培養(yǎng)48 h，其D_600nm和噻吩磺隆降解率分別僅為30℃時的68%、50%。以上結(jié)果表明，菌株LXL-3對高溫是敏感的，若溫度達到或高于40℃，其生長及降解噻吩磺隆的能力都將受到不利影響，因此菌株LXL-3僅適合應(yīng)用于低于40℃的溫度條件。

微生物的生長狀況及降解能力等通常會受到pH值的影響。本研究結(jié)果表明，培養(yǎng)基的pH值為7.0時，菌株LXL-3的生長要優(yōu)于在其他pH值條件（圖3）；而適宜于菌株LXL-3降解噻吩磺隆的pH值為7.0或7.5，pH值為6.0時則降解率顯著降低（圖4），說明菌株LXL-3的生長與噻吩磺隆的降解速度呈正相關(guān)。此外，pH值會在一定程度上影響到菌株LXL-3的生長和噻吩磺隆的生物降解，但其4 d后的降解率也顯示，pH值對于菌株LXL-3降解噻吩磺隆的影響在降解后期并不十分顯著，因為在5個不同的pH值條件下，培養(yǎng)4 d后菌株LXL-3降解噻吩磺?。ㄆ鹗紳舛葹?00 mg/L）的降解率都可以達到90%以上，表明菌株LXL-3擁有極強的噻吩磺隆降解能力（圖3、圖4）。已有研究表明，在不考慮生物降解的情況下，在pH值中性時噻吩磺隆最為穩(wěn)定，在培養(yǎng)基為酸性或堿性時則有利于噻吩磺隆的水解；然而，在本試驗中并沒有表現(xiàn)出這一現(xiàn)象（圖4），可推測這里的降解行為主要是菌株LXL-3的生物降解作用。本試驗中的最大降解率發(fā)生在pH值中性條件下，這主要是由于菌株LXL-3在中性條件下生長更好，可能會產(chǎn)生更多的降解酶，并且多數(shù)降解酶在pH值中性條件下有更大的酶活性。

2.3噻吩磺隆濃度對菌株LXL-3生長的影響

當噻吩磺隆濃度從50 mg/L升高至250 mg/L時，D_600nm值有增加的趨勢，表明噻吩磺隆濃度為50 mg/L時不能充分滿足試驗條件下菌株LXL-3的碳源或能源需求，但在濃度達到250 mg/L時菌株生長達到基本飽和，繼續(xù)增加噻吩磺隆可能會抑制該菌株的生長。當濃度由250mg/L增加到500 mg/L時，D_600nm值有所下降，但統(tǒng)計學上的差異不顯著；若增加至1000 mg/L，則菌株的生長受到明顯抑制，但仍然可以生長（圖5）。因此，初步判定菌株LXL-3在試驗條件下能耐受濃度為500 mg/L的噻吩磺隆，在這一濃度下，菌株LXL-3的生長不會受到顯著影響。依據(jù)本試驗結(jié)果，可作以下推測：（1）由于500 mg/L的噻吩磺隆不會對菌株LXL-3的生長產(chǎn)生顯著影響，故認為菌株LXL-3對噻吩磺隆有很好的耐受性。（2）菌株LXL-3擁有很強的降解噻吩磺隆的能力，能夠用于較寬的噻吩磺隆濃度范圍；菌株LXL-3顯示了更快的噻吩磺隆降解速率（相比較文獻報道的噻吩磺隆降解菌株而言）。（3）菌株LXL-3可能能用于噻吩磺隆污染的生物修復，特別是高濃度的噻吩磺隆污染。菌株LXL-3所擁有的噻吩磺隆降解能力可能與分離該菌株的農(nóng)田土壤長期使用噻吩磺隆農(nóng)藥密切相關(guān)，按照記錄，相關(guān)農(nóng)田已經(jīng)有使用噻吩磺隆5年以上的歷史。通常，土壤微生物長期持續(xù)接觸某種人工合成有機化合物可能會誘導出降解該化合物的能力，這些具備了新的降解特性的微生物可能與問題土壤中農(nóng)藥的快速失活密切相關(guān)。

2.4 NaCl濃度對菌株LXL-3生長的影響

當NaCl濃度從0.5%升高至4.0%時，所測得的D_600nm值未出現(xiàn)顯著變化（圖6），這表明菌株LXL-3至少能耐受4.0%的NaCl；同時，由于供試培養(yǎng)基中只有噻吩磺隆1種碳源，菌株LXL-3是以降解噻吩磺隆來獲取碳源進行生長，表明該菌株在高鹽壓力下仍可保持對噻吩磺隆的降解能力。此外，當NaCl濃度從4.0%升高至6.0%時，菌株LXL-3的生長受到了較明顯影響，D_600nm值顯著降低，但該菌株仍然能較好地生長；即使NaCl濃度提高至8.0%，菌株LXL-3仍可維持低水平的生長（（圖6），因此認為該菌株屬中等或以上程度的耐鹽菌。菌株LXL-3的耐鹽性可能與采樣地點的鹽堿化有一定關(guān)系，微生物持續(xù)處于滲透壓脅迫環(huán)境下，可誘導產(chǎn)生耐鹽性能，這一般通過滲透調(diào)節(jié)或蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)這2種方式實現(xiàn)。

2.5土壤中噻吩磺隆的降解

通過添加菌株LXL-3到土壤中用以降解土壤中的噻吩磺隆是可行的，添加了菌株LXL-3的土壤中噻吩磺隆的降解率要明顯高于未添加菌株LXL-3的土壤，噻吩磺隆（起始濃度是100 mg/kg）的10 d降解率約為90%，14 d降解率則可達到99%以上，趨于完全降解（圖7）。然而，在不含菌株LXL-3的土壤中其10、14 d的降解率僅分別為29%、14%，說明菌株LXL-3具有較強的生存能力，并能在土壤中有效降解噻吩磺隆。此外，在新鮮土壤中噻吩磺隆的降解率要稍高于其在滅菌土壤中的降解率，存在于新鮮土壤中的某些擁有噻吩磺隆降解能力的天然微生物可能是導致這一現(xiàn)象的原因。在不含活微生物的滅菌土壤中，經(jīng)歷14 d后其噻吩磺隆的含量下降了14%（圖7），噻吩磺隆數(shù)量隨時間逐漸減少的現(xiàn)象則可能是由水解和光解作用所造成。Andersen等的研究已經(jīng)證實磺酰脲類除草劑在土壤環(huán)境中的降解行為受很多因素的影響，如溫度、pH值、光、微生物、土壤類型以及施用的肥料等。

3小結(jié)

在本研究中分離到1株能有效降解噻吩磺隆的細菌，該菌被命名為LXL-3，并被鑒定為丁香假單胞菌。在不同的條件下測試了該菌株的生理生化特征和噻吩磺隆降解性能，其中在含100 mg/L噻吩磺隆的無機鹽液體培養(yǎng)基中，菌株LXL-3培養(yǎng)48 h后，噻吩磺隆的降解率可達81%以上。菌株LXL-3降解噻吩磺隆的適宜pH值為7.0～7.5，適宜溫度為25～30℃。此外，該菌還對噻吩磺隆和NaCl有很好的耐受性，至少能耐受500 mg/L以上的噻吩磺隆和4.0%以上的NaCl。將菌株LXL-3添加到被噻吩磺隆污染的土壤，結(jié)果表明該菌株能在土壤中生長并發(fā)揮降解噻吩磺隆的作用。因此，菌株LXL-3可用于污染物的生物處理，在后續(xù)研究中嘗試將菌株LXL-3制作成微生物活菌制劑用于噻吩磺隆及其他相關(guān)污染物的生物治理。