QuEChERS-UPLC-MRM-IDA Criteria-EPI測(cè)定紅曲米中洛伐他汀

汪元符

（南昌市食品藥品檢驗(yàn)所，江西 南昌330038）

QuEChERS-UPLC-MRM-IDA Criteria-EPI測(cè)定紅曲米中洛伐他汀

汪元符

（南昌市食品藥品檢驗(yàn)所，江西 南昌330038）

目的：針對(duì)紅曲米，建立其中所含洛伐他汀化學(xué)成分的QuEChERS-超高效液相色譜-MRM掃描（多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)）-IDA Criteria-增強(qiáng)子離子掃描（EPI）的檢測(cè)方法。方法：色譜柱為Phenomenex Luna C18（2）100A（150 mm× 2.00 mm，3 μm）；柱溫為35℃；流動(dòng)相為10 mmol/L乙酸銨以乙酸調(diào)節(jié)pH值至3.0及乙腈，梯度洗脫；流速為0.2 mL/min；以優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)采集信號(hào)。結(jié)果：檢出限濃度為0.5 ng/mL；定量限濃度為1.0 ng/mL；線性范圍為定量限濃度～500 ng/mL；在線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)在0.99以上；加樣回收率為99.0%～99.9%。結(jié)論：本方法準(zhǔn)確，靈敏度高，專屬性好；能用于紅曲米中洛伐他汀化學(xué)成分的同時(shí)定性及定量檢測(cè)。

QuEChERS-超高效液相色譜-MRM掃描（多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)）-IDA Criteria-增強(qiáng)子離子掃描（EPI）檢測(cè)法；紅曲米；洛伐他汀

紅曲米的使用至今已有 1 000多年的歷史，李時(shí)珍在《本草綱目》中提到：“此乃人窺造化之巧者也”，“奇藥也”，作為中藥，它具有活血和健脾等功效。紅曲霉屬于真菌門、子囊菌亞門、不整子囊菌綱、散囊菌目、紅曲科、紅曲屬［1］。紅曲系通過現(xiàn)代生物工程技術(shù)分離出優(yōu)質(zhì)的紅曲霉菌，經(jīng)固體深層發(fā)酵精制而成一種純天然綠色產(chǎn)品。本品性狀為淡紅色粉末，色調(diào)純正，光熱穩(wěn)定性好，純天然，安全無副作用，具有降血脂、血壓、膽固醇，調(diào)節(jié)人體心腦血管健康、提高人體免疫力的醫(yī)療保健功效［2］。紅曲菌能產(chǎn)生多種次級(jí)代謝產(chǎn)物，例如紅曲色素、莫納可林K（Monacolin K，MK）、γ-氨基丁酸（GABA）、抗氧化物質(zhì)、降血壓物質(zhì)等［3］，1979年由日本學(xué)者遠(yuǎn)藤章從紅曲霉發(fā)酵液中分離得到，稱為 Monacolin K。由于其療效顯著、毒副作用小、耐受性好而日漸受到重視，是目前在保健食品中唯一應(yīng)用的他汀類物質(zhì)［4］。近年來，隨著生產(chǎn)菌種和工藝的不斷改進(jìn)，紅曲米中洛伐他汀的含量越來越高［5］，但并不是含量越高就越好。本法針對(duì)紅曲米，建立其中所含洛伐他汀化學(xué)成分的QuEChERS-超高效液相色譜-MRM掃描（多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)）-IDA Criteria-增強(qiáng)子離子掃描（EPI）的檢測(cè)方法（QuEchERS-UPLC-MRM-IDA Criteria-EPI），能同時(shí)定性與定量對(duì)紅曲米中的洛伐他汀進(jìn)行測(cè)定，為紅曲米的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器、試劑與材料

AB Sciex 4000 Qtrap質(zhì)譜，ekspert ultraLC100超高效液相色譜儀，METTLER TOLEDO ME204E電子分析天平，METTLER TOLEDO XS105電子分析天平，Hettich Rotina 380R 1706型醫(yī)用低速離心機(jī)，昆山 KQ-300DB型數(shù)控超聲波清洗器，Millipore超純水系統(tǒng)。

試劑：乙腈（色譜純，Merck），乙酸銨（優(yōu)級(jí)純，Macklin），甲酸（優(yōu)級(jí)純，Macklin），無水硫酸鎂（優(yōu)級(jí)純），無水醋酸鈉（優(yōu)級(jí)純），C18（粒度100 μm），PSA，石墨化碳。

對(duì)照品：洛伐他?。ㄅ?hào)：100600-200502），為中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

樣品：購(gòu)自市場(chǎng)和流通企業(yè)，產(chǎn)地分別為福建、湖北、山西、廣東，共10個(gè)批次，批號(hào)：140107，140110，140201，140204，140206，140209，140310，140402，141046，141017，對(duì)應(yīng)編號(hào)為① ～ ⑩。

2 方法與結(jié)果

2.1 高效液相色譜分析條件

分析柱：Phenomenex Luna C18（2）100A（150 mm×2.00 mm，3 μm）。柱溫：35℃。流速：0.2 mL/min。進(jìn)樣量：5 μL。流動(dòng)相：A為10 mmol/L乙酸銨以乙酸調(diào)節(jié)pH值至3.0，B為乙腈。按表1進(jìn)行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫程序

2.2 質(zhì)譜分析條件

電噴霧離子源（ESI）：正離子模式（ESI+）。掃描模式：MRM掃描（多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)）-IDA Criteria-EPI。掃描范圍：50～650 Da。氣簾氣壓力：25 Pa。碰撞氣密度：中。電離噴霧電壓：5 500 V。離子源溫度：500℃。霧化氣壓力：55 Pa。輔助氣壓力：50 Pa。界面加熱狀態(tài)：開啟。離子對(duì)選擇見表2。

表2 質(zhì)譜分析

2.3 對(duì)照品溶液的配制

取洛伐他汀對(duì)照品約10 mg，精密稱定，以乙腈制成每1 mL中含1 mg的溶液作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液以乙腈按一定比例稀釋，可 得 到 各 含 0.5，1，2.5，5，10，25，50，100，250，500 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。

2.4 供試品溶液的配制

樣品前處理：以四分法采樣，取適量，研勻，稱取0.5 g（精確到0.000 1 g），置50 mL量瓶中，加入乙腈約30 mL，超聲萃取30 min，取出，冷卻至室溫后定容，以5 000 r/min離心，取上清液。

采用 QuEChERS法處理：取上述上清液約15 mL，加入適量的無水硫酸鎂，無水醋酸鈉，C18，PSA及石墨化碳，充分混合約5 min，以5 000 r/min離心，取上清液，經(jīng) 0.2 μm微孔濾膜過濾后，取續(xù)濾液適當(dāng)稀釋后測(cè)定。

2.5 洛伐他汀離子對(duì)提取質(zhì)譜圖

見圖1至圖6。

綜上所述，不僅東道國(guó)基礎(chǔ)設(shè)施的完善有利于雙邊經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)，而且東道國(guó)制度對(duì)于改善東道國(guó)基礎(chǔ)設(shè)施的中國(guó)OFDI的雙邊經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)效應(yīng)也有著重要影響。以往關(guān)于“一帶一路”的研究多將直接投資的經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)效應(yīng)與制度因素割裂開來，或者多研究東道國(guó)制度因素對(duì)中國(guó)OFDI整體的影響。本文著重從東道國(guó)各項(xiàng)制度出發(fā)，考察在“一帶一路”背景下，東道國(guó)各項(xiàng)制度對(duì)中國(guó)直接投資，尤其是用于改善東道國(guó)基礎(chǔ)設(shè)施的中國(guó)OFDI雙邊經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)效應(yīng)的影響。東道國(guó)制度不僅直接影響中國(guó)直接投資進(jìn)入“一帶一路”國(guó)家的風(fēng)險(xiǎn)和成本，更進(jìn)一步影響中國(guó)直接投資的區(qū)域、類型和經(jīng)濟(jì)效果。[15]具體影響機(jī)理見圖1。

圖1 對(duì)照品濃度為100 ng/mL時(shí)總離子流質(zhì)譜圖

圖2 對(duì)照品定量離子對(duì)（405.7/199.1）提取質(zhì)譜圖

圖3 對(duì)照品定性離子對(duì)（405.7/285.3）提取質(zhì)譜圖

圖4 樣品總離子流質(zhì)譜圖

圖5 樣品定量離子對(duì)（405.7/199.1）提取質(zhì)譜圖

圖6 樣品定性離子對(duì)（405.7/285.3）提取質(zhì)譜圖

2.6 定性確認(rèn)

采用保留時(shí)間與對(duì)照品相一致，且提取的二級(jí)質(zhì)譜圖與對(duì)照品相一致，判為檢出。見圖7～圖8。

圖7 對(duì)照品二級(jí)質(zhì)譜圖

圖8 樣品二級(jí)質(zhì)譜圖b（與對(duì)照品一致）

2.7 線性關(guān)系及檢出限、定量限考察

采用“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，“2.2”項(xiàng)下的質(zhì)譜條件，以“2.3”項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)樣檢測(cè)。以檢測(cè)所得峰面積為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性擬合。以定性離子對(duì)和定量離子對(duì)提取的質(zhì)譜圖信噪比均大于3時(shí)的濃度（ng/mL）為檢出限。以定性離子對(duì)提取的質(zhì)譜圖信噪比大于3，定量離子對(duì)提取的質(zhì)譜圖信噪比大于10時(shí)的濃度（ng/mL）為定量限。以在一定濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)大于 0.99，為線性范圍。結(jié)果見表3。

2.8 精密度試驗(yàn)

選用標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中濃度為100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進(jìn)樣6針，以提取的定量離子對(duì)質(zhì)譜圖峰面積計(jì)算。結(jié)果見表4。

選用標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中濃度為100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在0，1，2，4，8，12，24小時(shí)分別進(jìn)樣，以提取的定量離子對(duì)質(zhì)譜圖峰面積計(jì)算。結(jié)果見表5。

2.10 重復(fù)性試驗(yàn)

選用批號(hào)：140206的紅曲米，按“2.4”項(xiàng)下的方法制備6份平行樣品，按本法檢測(cè)洛伐他汀的含量。結(jié)果見表6。

2.11 回收率試驗(yàn)

以同一批次樣品試驗(yàn)，準(zhǔn)確稱取 0.50 g，按“2.4”項(xiàng)的方法制備供試液（稀釋1 000倍），洛伐他汀的理論濃度為98.3 ng/mL，準(zhǔn)確加入1.000，2.500，5.000 mL各含1 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液，再按 “2.4”項(xiàng)的方法制備成供試液 （稀釋1 000倍），進(jìn)行檢測(cè)，以3次平行結(jié)果的均值計(jì)，結(jié)果見表8，高、中、低三個(gè)濃度的回收率均在99.5% ～100.1%之間。

2.12 樣品測(cè)定結(jié)果

檢測(cè)10批次樣品，結(jié)果見表8。

表3 線性關(guān)系及檢出限、定量限考察結(jié)果

表4 精密度試驗(yàn)結(jié)果

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

表6 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表7 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

表8 紅曲米中洛伐他汀測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 供試品提取溶劑選擇

據(jù)文獻(xiàn)［6］，洛伐他汀易溶于乙酸乙酯而不溶于酸與水，紅曲米中洛伐他汀含量測(cè)定中多用甲醇或乙醇超聲提取，本法對(duì)此做了改變，采用乙腈為提取液，經(jīng)比較同樣能較好地提取紅曲米中的洛伐他汀。

3.2 供試品前處理

據(jù)文獻(xiàn)［7］，紅曲米中洛伐他汀的前處理方法有直接超聲法，超聲提取后再經(jīng)氧化鋁層析柱純化法，本法基于簡(jiǎn)單、便利、快捷的原則，采用QuEChERS法對(duì)供試品提取液進(jìn)行進(jìn)一步處理凈化，排除了多余雜質(zhì)及色素的干擾，能滿足液質(zhì)進(jìn)樣需要。

［1］ 逯慎杰，劉秀河.功能性紅曲中功能成分的研究進(jìn)展［J］.江蘇調(diào)味副食品，2011，28（1）：17-20.

［2］ 杜珊.高效液相色譜法測(cè)定紅曲中洛伐他汀的含量［J］.天津化工，2010，24（3）：54-60.

［3］ 黃志兵，許楊，張泓，等.紅曲菌幾種主要次級(jí)代謝產(chǎn)物及其生物活性的研究進(jìn)展［J］.食品與發(fā)酵工程，2010，36（4）：143-148.

［4］ 姜楠，馬壯飛，劉思潔，等.紅曲類保健食品中洛伐他汀檢測(cè)的方法研究［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2013，23（1）：73-74.

［5］羅仁才，孫開奇，謝申猛，等.紅曲中洛伐他汀總量的測(cè)定方法［J］.衛(wèi)生研究，2003，32（2）：157-158.

［6］ 張艷紅.高效液相色譜法測(cè)定紅曲米中洛伐他汀的含量［J］.食品科學(xué)，2001，22（7）：67-69.

［7］ 范雯.高效液相色譜法測(cè)定紅曲藥材中洛伐他汀的含量［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2013，29（16）：2417-2419.

Determination of Lovastatin in Red Yeast Rice by QuEChERS-UPLC-MRM-IDA Criteria-EPI

Wang Yuanfu（Nanchang Institute for Food and Drug Control，Jiangxi Nanchang 330038，China）

Objective：To develop a QuEChERS-UPLC-MRM-IDA Criteria-EPI method for determination of lovastatin in red yeast rice.Methods：Phenomenex Luna C18（2）100A column（150 mm×2.00 mm，3 μm）was used at a column temperature of 35℃，serving 10 mmol/L ammonium acetate （pH 3.0）-acetonitrile as a mobile phase by gradient elution at a flow rate of 0.2 mL/min.Signals were collected under the optimized condition.Results：The detection limit of this method was 0.5 ng/mL，while the limit of quantitation was 1.0 ng/mL，and the linear range was the limit of quantitation～500 ng/mL.Within the linear range，the correlation coefficient was more than 0.99，while the sample recovery rate was 99.0%～99.9%.Conclusion：This method is accurate，sensitive and specific，which may be used for the qualitative and quantitative determinations of lovastatin in red yeast rice.

QuEChERS-UPLC-MRM-IDA Criteria-EPI；Red Yeast Rice；Lovastatin

10.3969/j.issn.1672-5433.2016.10.006

2016-05-22）

汪元符，男，主管醫(yī)師。研究方向：中藥理論、藥物檢測(cè)及食品安全。E-mail：wanngel@126.com