H PLC測(cè)定三種兒童用醫(yī)院制劑中防腐劑羥苯乙酯的含量

蘇靜華顧炳仁邢以文徐憶菁

（1蘇州市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇 蘇州215000；2蘇州大學(xué)藥學(xué)院 ）

H PLC測(cè)定三種兒童用醫(yī)院制劑中防腐劑羥苯乙酯的含量

蘇靜華1顧炳仁1邢以文1徐憶菁2

（1蘇州市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇 蘇州215000；2蘇州大學(xué)藥學(xué)院 ）

目的：建立測(cè)定三種兒童用醫(yī)院制劑中防腐劑羥苯乙酯含量的高效液相色譜方法，為兒童用醫(yī)院制劑防腐劑限量控制提供依據(jù)。方法：色譜柱：Phenomenex Luna C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，）；流動(dòng)相：甲醇-水（60∶40，V/V）；等度洗脫；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：256 nm；流速：0.8 mL/min。結(jié)果：羥苯乙酯濃度在2.292～ 114.6 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=1.000 0）。RSD為0.33%，LOD為0.120 μg/mL，紅臀軟膏、硫磺霜和復(fù)方潔霉素滴鼻液的平均回收率分別為97.41%，98.44%和96.65%（n=6）。結(jié)論：該檢測(cè)方法快捷、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠，可用于醫(yī)院制劑中防腐劑羥苯乙酯的檢測(cè)。

羥苯乙酯；高效液相色譜法；防腐劑；兒童；醫(yī)院制劑；含量測(cè)定

羥苯乙酯是一種高效的防腐劑，為無(wú)色結(jié)晶或白色粉末，略有麻舌的澀味，易溶于甲醇、乙醇和乙醚，略溶于三氯甲烷，微溶于甘油，幾乎不溶于水，無(wú)揮發(fā)性，無(wú)吸濕性；化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在酸性、中性、堿性溶液中均有抑菌作用，對(duì)大腸桿菌作用最強(qiáng)［1］。

紅臀軟膏是以紫草、白芷這兩種中藥為主要成分，用于治療嬰幼兒臀紅的油性基質(zhì)軟膏劑。臀紅是臨床小兒常見(jiàn)的皮膚疾病，主要癥狀是皮膚潮紅、潰爛甚至脫皮等。5%硫磺霜主要用來(lái)治療兒童疥蟲及霉菌感染，其主要成分升華硫，對(duì)嬰兒濕疹亦有療效［2］。復(fù)方潔霉素滴鼻液是臨床用于治療兒童呼吸道感染的常用藥物之一。其處方中的林可霉素是一種抗生素，能抑制細(xì)菌的蛋白質(zhì)的合成，對(duì)G+菌及某些厭氧菌有較強(qiáng)殺滅作用［3］；另一種有效成分地塞米松磷酸鈉是糖皮質(zhì)激素類藥物，具有抗局部變態(tài)反應(yīng)、抗炎、抗水腫等多種藥理作用［4］，對(duì)治療慢性鼻竇炎和哮喘有一定的效果［5］。

因上述三種醫(yī)院制劑均為多劑量包裝，開封后接觸空氣，易致微生物滋生，故其處方中均添加了一定量的羥苯乙酯，起到抑菌、防腐的作用。羥苯乙酯是一種在食品、藥品、化妝品中均廣泛使用的防腐劑［6］。盡管現(xiàn)今并未否認(rèn)羥苯酯類防腐劑使用的安全性，但由于嬰幼兒特別是新生兒皮膚角質(zhì)層薄，且缺乏溶菌素，因此對(duì)各種過(guò)敏原極其敏感，皮膚、黏膜長(zhǎng)期暴露于防腐劑可能引起不同程度的不良反應(yīng)［7-10］，所以必須控制其用量。另外，羥苯乙酯的抑菌濃度須控制在0.2～0.8 mg/mL之間［11］，因此若在制劑時(shí)投料不足，羥苯乙酯濃度很有可能低于下限，從而達(dá)不到理想的抑菌效果，因此需要制定防腐劑的含量限度標(biāo)準(zhǔn)。

《中國(guó)藥典》2015年版僅對(duì)部分品種的防腐劑含量限度作出了規(guī)定，如左氧氟沙星滴眼液要求控制苯扎溴銨的含量為標(biāo)示量的80%～120%［12］；妥布霉素滴眼液要求檢查羥苯乙酯、羥苯丙酯和苯扎氯銨的含量，為標(biāo)示量的80%～120%；鹽酸林可霉素滴眼液要求苯甲酸鈉、苯扎溴銨和羥苯乙酯含量偏離標(biāo)示量均不得大于±20%。但本文所述的三種兒科用醫(yī)院制劑在其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，僅對(duì)防腐劑的抑菌效力有檢測(cè)要求，對(duì)于羥苯乙酯在制劑中的具體含量未作測(cè)定要求和限度規(guī)定。因此，本文建立了一種能快速準(zhǔn)確測(cè)定醫(yī)院制劑中羥苯乙酯含量的高效液相色譜方法，為兒童用醫(yī)院制劑標(biāo)準(zhǔn)提高提供了參考依據(jù)。

1 儀器與設(shè)備

Waters Alliance e2695高效液相色譜儀（2998型二極管陣列檢測(cè)器，EmpowerⅡ色譜工作站）；Merck Millipore Direct-Q3超純水儀；梅特勒-托利多分析天平XS105DC；SHIMADZU UV-2550型紫外分光光度計(jì)；科導(dǎo)SK6210HP超聲波清洗器。

2 樣品與試劑

羥苯乙酯對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100847-201102，含量：99.9%）；復(fù)方潔霉素滴鼻液（蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，批號(hào)：15061401，15061402，15061403）；紅臀軟膏（蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，批號(hào)：150804，150818，150903）；硫磺霜（蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，批號(hào)：150614，15061402，15061403）。甲醇為色譜純，試驗(yàn)用水為超純水。

3 方法

3.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Luna C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（60∶40，V/V）；等度洗脫；流速：0.8 mL/min；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm。

3.2 樣品處理和溶液制備

3.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取羥苯乙酯對(duì)照品約10.0 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液；精密吸取1 mL對(duì)照品貯備液至10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度約20 μg/mL的對(duì)照品溶液。

3.2.2 供試品溶液的制備

3.2.2.1 復(fù)方潔霉素滴鼻液供試品溶液的制備 精密量取復(fù)方潔霉素滴鼻液1.0 mL，置10 mL容量瓶中，加水稀釋至10 mL，搖勻，作為供試品溶液。

3.2.2.2 紅臀軟膏供試品溶液的制備 取紅臀軟膏約 1.0 g，精密稱定，置 50 mL容量瓶中，加甲醇30 mL，超聲10 min，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

3.2.2.3 硫磺霜供試品溶液的制備 取硫磺霜約0.5 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇30 mL，超聲10 min，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

4 結(jié)果

4.1 線性關(guān)系

精密吸取上述對(duì)照品和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖（圖1）。

圖1 羥苯乙酯對(duì)照品和三種兒科用醫(yī)院制劑的HPLC圖

取羥苯乙酯對(duì)照品約 10 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，作為標(biāo)準(zhǔn)母液。精密移取標(biāo)準(zhǔn)母液各1.0，1.0，1.0，1.0，2.0，1.0，1.0 mL，分別置于 10，25，50，100，250，250和500 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，作為系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各10 μL，在“3.1”項(xiàng)的色譜條件下分別進(jìn)樣。以濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行計(jì)算，得羥苯乙酯的線性方程：

Y=56 115.29X-52 628.54（r=0.999 9）。

結(jié)果表明，羥苯乙酯的質(zhì)量濃度在 2.292～114.6 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

4.2 精密度

精密量取“3.2.1”項(xiàng)下質(zhì)量濃度為22.92 μg/mL的對(duì)照品溶液10 μL，在“3.1”項(xiàng)的色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，峰面積RSD為0.33%（n=6），表明儀器精密度良好。

4.3 穩(wěn)定性

將“3.2.1”項(xiàng)下質(zhì)量濃度為22.92 μg/mL的對(duì)照品溶液在常溫下分別保存0，2，4，8，16，24 h后，在“3.1”項(xiàng)的色譜條件下分別進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖。羥苯乙酯峰面積的RSD為0.65%（n=6）。表明羥苯乙酯對(duì)照品溶液在室溫環(huán)境下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

4.4 重復(fù)性

精密稱取同一批次的紅臀軟膏（批號(hào)：150804）和硫磺霜（批號(hào)：150614），精密量取同一批次復(fù)方潔霉素滴鼻液（批號(hào)：15061402），分別依照“3.2.2”項(xiàng)下的制備方法，各制備6份供試品溶液；按“3.1”項(xiàng)下的色譜條件，分別記錄每份供試品溶液羥苯乙酯的峰面積。RSD分別為1.27%，1.20%和1.86%。

4.5 檢測(cè)限

將“3.2.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液不斷稀釋后再進(jìn)樣，依據(jù)色譜圖峰面積，以信噪比 S/N=3計(jì)算，得羥苯乙酯的最低檢測(cè)限為0.120 μg/mL。

4.6 定量限

將“3.2.1”項(xiàng)的對(duì)照品溶液不斷稀釋后進(jìn)樣，依據(jù)色譜圖峰面積，以信噪比S/N=10計(jì)算，得羥苯乙酯的定量限為0.400 μg/mL。

4.7 加樣回收試驗(yàn)

取已知含量的紅臀軟膏（取重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下的樣品，批號(hào)：150804）6份，每份約 0.5 g，精密稱定，分別置于50 mL容量瓶中；再取已知含量的硫磺霜（取重復(fù)性試驗(yàn)下的樣品，批號(hào)：150614）6份，每份約 0.25 g，精密稱定，分別置于 25 mL容量瓶中；另精密吸取已知含量的復(fù)方潔霉素滴鼻液（取重復(fù)性試驗(yàn)下的樣品，批號(hào)：15061402）6份，每份1 mL，分別置于6個(gè)10 mL容量瓶中。在上述容量瓶中各精密加入羥苯乙酯對(duì)照品適量，按“3.2.2”項(xiàng)下的方法制備溶液，在“3.1”項(xiàng)下的色譜條件下分別進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖。結(jié)果表明，紅臀軟膏、硫磺霜和復(fù)方潔霉素滴鼻液的平均回收率分別為97.41%，98.44%和96.65%（n=6），其RSD分別為1.77%，1.33%和4.31%。見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

4.8 樣品測(cè)定

精密稱取或量取各批樣品適量，照“3.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液后進(jìn)樣測(cè)定（表2），HPLC圖見(jiàn)圖1。結(jié)果表明紅臀軟膏和復(fù)方潔霉素滴鼻液中羥苯乙酯的含量均比標(biāo)示量低，而硫磺霜中的羥苯乙酯略高。

5 討論

5.1 測(cè)定波長(zhǎng)的考察

取“3.2.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，在210～350 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描，結(jié)果顯示羥苯乙酯在256 nm處有最大吸收峰且無(wú)溶劑峰干擾，故將測(cè)定波長(zhǎng)定為256 nm。

5.2 提取方法的考察

為了確定制備供試品溶液的超聲時(shí)間，本研究做了如下試驗(yàn)。精密稱取3份重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下的紅臀軟膏（批號(hào)：150804）各約1.0 g至50 mL容量瓶中，用適量甲醇溶解，分別超聲10，20，30 min后，用甲醇稀釋至刻度，用微孔濾膜過(guò)濾后分別進(jìn)樣，測(cè)定羥苯乙酯的含量。三者峰面積的RSD為3.7%，延長(zhǎng)超聲時(shí)間對(duì)羥苯乙酯含量帶來(lái)的影響可以忽略不計(jì)，因此將樣品超聲時(shí)間確定為10 min，以提高提取效率。

表2 三種兒科用醫(yī)院制劑中羥苯乙酯的測(cè)定結(jié)果

5.3 陰性樣品的考察

由于缺乏制備陰性樣品的條件，本文未進(jìn)行其他輔料的干擾試驗(yàn)，因此對(duì)羥苯乙酯含量測(cè)定結(jié)果的可靠性帶來(lái)一定影響。

5.4 實(shí)測(cè)樣品數(shù)據(jù)分析

由表2可以觀察到，批號(hào)為150903的紅臀軟膏和其他兩個(gè)批次的樣品相比，羥苯乙酯含量顯著偏低，且重復(fù)進(jìn)樣后仍有較大偏離，表明該種醫(yī)院制劑可能在批次間的質(zhì)量同一性方面控制得較差，但要獲得更確切的結(jié)論，還需增加測(cè)定批次數(shù)目。各批次硫磺霜實(shí)測(cè)結(jié)果較為理想，含量均占標(biāo)示量的80%～120%，且RSD＜3.02%。3個(gè)批次的復(fù)方潔霉素滴鼻液批次間差異不大，RSD＜2.50%。但含量均偏低，《中國(guó)醫(yī)院制劑標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定的羥苯乙酯抑菌濃度是200～ 800 μg/mL，測(cè)得羥苯乙酯的平均含量為（263.3±6.3）μg/mL，僅略高于規(guī)定濃度下限，占標(biāo)示量的平均百分?jǐn)?shù)為65.83%，表明防腐劑可能在處方制備過(guò)程中有較大損失，從而達(dá)不到要求的抑菌效果，處方制備時(shí)需要增加抑菌劑投料。但由于該制劑是鼻黏膜用藥，較易進(jìn)入血液循環(huán)進(jìn)而在體細(xì)胞中累積，因此還要留意投料上限。

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Content Determination of Ethylparaben as a Preservative in Three Hospital Preparations for Children by HPLC

Su Jinghua1，Gu Bingren1，Xing Yiwen1，Xu Yijing2（1 Suzhou Institute for Food and Drug Control，Jiangsu Suzhou 215000，China；2 College of Pharmaceutical，Soochow University）

Objective：To develop a HPLC method for determination of content of ethylparaben as a preservative in three hospital preparations for children，and provide a basis for quantitative limit of preservative in the preparations. Methods：The determination was carried out on a Phenomenex Luna C18column（250 mm×4.6 mm，5 μm）serving methanol-ultrapure water（60∶40）as a mobile phase by isocratic elution.The detection wavelength was set at 256 nm，while the flow rate was 0.8 mL/min and the column temperature was 35℃.Results：The linear range of ethylparaben was 2.292～114.6 μg/mL （r=1.000 0）.The RSD was 0.33%and the LOD was 0.120 μg/mL.The average recovery rates of the three hospital preparations，i.e.diaper rash ointment，sulfur cream and compound jiemycin were 97.41%，98.44% and 96.65%，respectively.Conclusion：This method is rapid，simple，accurate and reliable for determination of preservative in hospital preparations.

Ethylparaben；HPLC；Preservative；Children；Hospital Preparation；Content Determination

10.3969/j.issn.1672-5433.2016.10.004

2016-05-29）

蘇靜華，女，碩士，主管藥師。研究方向：藥品質(zhì)量控制。通訊作者E-mail：susan0702@163.com