基于煙草葉綠體基因組和線粒體基因組SSR標(biāo)記的煙屬植物遺傳多樣性分析

曾建敏，陳學(xué)軍，吳興富，焦芳嬋，肖炳光，李永平，童治軍

云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，煙草行業(yè)煙草生物技術(shù)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家煙草基因工程研究中心，昆明 650021

基于煙草葉綠體基因組和線粒體基因組SSR標(biāo)記的煙屬植物遺傳多樣性分析

曾建敏，陳學(xué)軍，吳興富，焦芳嬋，肖炳光，李永平，童治軍

云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，煙草行業(yè)煙草生物技術(shù)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家煙草基因工程研究中心，昆明 650021

利用本實(shí)驗(yàn)室前期開發(fā)的煙草葉綠體基因組和線粒體基因組SSR標(biāo)記，對(duì)屬于3個(gè)煙草亞屬、9個(gè)組共35份野生煙草種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析。利用20對(duì)SSR引物在35份野生煙草材料中共擴(kuò)增獲得176個(gè)多態(tài)性條帶，每對(duì)SSR引物可檢測(cè)的多態(tài)性條帶數(shù)為2～19個(gè)，平均為8.8個(gè)。35份材料間遺傳相似性系數(shù)（GS）在0.20～1.00之間，平均為0.57，表明煙屬種間的遺傳多樣性豐富，遺傳差異較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。雖然3個(gè)亞屬間的界限不明顯，但在適當(dāng)?shù)倪z傳相似性系數(shù)條件下，除香甜煙草組外，35份野生煙草按其組可清晰地聚為7類，表明2種細(xì)胞器基因組SSR標(biāo)記適合用于煙草種間進(jìn)化、分類、遺傳分析等方面研究。

野生煙草；遺傳多樣性分析；簡(jiǎn)單序列重復(fù)標(biāo)記

煙草在植物分類學(xué)上屬于茄科（Solanaceae）、煙草屬（Nicotiana），其起源于美洲、大洋洲、南太平洋上一些島嶼及近代非洲[1-2]。根據(jù)其原產(chǎn)地、植物學(xué)形態(tài)特征、染色體數(shù)目、染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)、染色體聯(lián)會(huì)特點(diǎn)、種間雜交的可能性、種間雜種育性等，美國(guó)學(xué)者Goodspeed將煙草屬分為黃花煙亞屬（Rustica）、普通煙亞屬（Tabacum）和碧冬煙亞屬（Petunioides）3個(gè)亞屬、14個(gè)組、60個(gè)種[3]。隨后，人們對(duì)Goodspeed的工作進(jìn)行了大量深入研究并做了修正與擴(kuò)充，1994年，日本煙草產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社對(duì)煙草屬66個(gè)種進(jìn)行了系統(tǒng)的分類[4]，2004年，Knapp認(rèn)為煙草屬有76個(gè)種[5]。而種植的煙草只有2個(gè)種，即普通煙草和黃花煙草，因育種工作者過度依賴少數(shù)骨干親本，造成普通煙草（尤其是烤煙）栽培品種間的遺傳背景越來越趨同、遺傳基礎(chǔ)愈來愈狹窄、可利用的種質(zhì)資源也越來越匱乏[6-7]。

早期，因基因組信息匱乏，在分子水平上對(duì)煙草遺傳育種的研究進(jìn)展緩慢，主要局限于隨機(jī)引物擴(kuò)增長(zhǎng)度多態(tài)性（Random Ampli fi ed Polymorphic DNA，RAPD）[8-10]、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Ampli fi ed Fragment Length Polymorphic，AFLP）[11-13]、 序 列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記（Sequence Related Ampli fi ed Polymorphism，SRAP）[6]和區(qū)間簡(jiǎn)單序列重復(fù)（Inter-Simple Sequence Repeats，ISSR）[6,14]等非特異性的分子標(biāo)記。這些非特異性的分子存在標(biāo)記穩(wěn)定性差、多態(tài)性低、操作復(fù)雜、重復(fù)性差、標(biāo)記顯性，且應(yīng)用成本較高等缺點(diǎn)。SSR標(biāo)記克服以上缺點(diǎn)，但因缺乏足夠的煙草基因組信息，直到2007年，首張SSR標(biāo)記的煙草遺傳連鎖圖譜才公布，使得基于SSR標(biāo)記的煙草種質(zhì)資源親緣關(guān)系（遺傳多樣性）的研究方興未艾，但這些研究均集中在煙草的栽培品種上[15-19]。作為細(xì)胞器的葉綠體和線粒體基因組在植物種屬間具有很高的保守性，因此，細(xì)胞器基因組SSR不僅具有核基因組SSR標(biāo)記的共顯性、重復(fù)性好等固有特點(diǎn)，而且還具有很好的種屬通用性[20]，繼而被廣泛應(yīng)用于物種的起源、進(jìn)化、分類及種質(zhì)資源多樣性分析等研究領(lǐng)域[21-23]。迄今，基于煙草細(xì)胞器基因組SSR標(biāo)記對(duì)野生煙草種質(zhì)資源的研究在國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。因此，利用煙草葉綠體基因組和線粒體基因組SSR標(biāo)記對(duì)野生煙草種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳分析，在促進(jìn)煙草屬內(nèi)各近緣種遺傳研究的發(fā)展、挖掘和利用煙草野生種的優(yōu)良基因、拓寬煙草栽培種質(zhì)的遺傳基礎(chǔ)等方面就顯得十分迫切和重要。

本研究利用本實(shí)驗(yàn)室前期公布的煙草細(xì)胞器基因組SSR標(biāo)記[24]，對(duì)屬于3個(gè)煙草亞屬、9個(gè)組的35份野生煙草種質(zhì)資源的親緣關(guān)系進(jìn)行研究，旨在為從分子水平上對(duì)野生煙草種質(zhì)資源的研究、利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用的35份野生煙草種質(zhì)資源由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院、中國(guó)煙草育種研究（南方）中心提供，其中，黃花煙亞屬1個(gè)組包含了4份材料（W01～W04）；普通煙亞屬1個(gè)組包含了6份材料（W05～W10）；其他25份材料（W11～W35）屬于碧冬煙亞屬的7個(gè)組。35份野生煙草材料的詳細(xì)信息見表1。

表1 35份供試材料在煙草屬的分類信息Tab.1 Classi fi cation information of 35 materials in genus Nicotiana

1.2 方法

1.2.1 煙草基因組DNA提取

35份供試野生煙草材料基因組DNA的提取、純化和稀釋，參照梁景霞等[25]的CTAB大量法略作修改。其中將65℃水浴時(shí)間延長(zhǎng)至60 min，將離心轉(zhuǎn)速提高至12000 rpm，以提高煙草基因組DNA的得率和純度。

1.2.2 煙草葉綠體基因組和線粒體基因組SSR引物

在本實(shí)驗(yàn)室前期公布的煙草細(xì)胞器基因組SSR引物中[24]，選取能夠擴(kuò)增出條帶清晰、重復(fù)性好且在野生煙草中具有較好多態(tài)性的SSR引物各10對(duì)，引物的詳細(xì)信息見表2。

表2 煙草葉綠體基因組和線粒體基因組SSR引物序列信息Tab. 2 Information of SSR primer pairs in chloroplast genome and mitochondria genome of Nicotiana

1.2.3 PCR擴(kuò)增分析

煙草葉綠體基因組和線粒體基因組SSR引物的PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物的6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，參照李緒英等[24]的方法進(jìn)行。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

參照李巖等[26]的方法，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、整理。根據(jù)Nei等[27]提供的公式計(jì)算35份野生煙草材料間的遺傳相似系數(shù)（Genetic similarity coefficient , GS），利用NTSYSpc Version 2.11軟件[28]進(jìn)行聚類分析，并構(gòu)建分子進(jìn)化系統(tǒng)樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草葉綠體基因組和線粒體基因組SSR標(biāo)記的多態(tài)性分析

煙草葉綠體基因組和線粒體基因組SSR引物均能穩(wěn)定的擴(kuò)增出清晰、大小與預(yù)期片段相符的條帶（圖1）。20對(duì)SSR引物在35份野生煙草材料中共擴(kuò)增獲得176個(gè)多態(tài)性條帶，每對(duì)SSR引物可檢測(cè)的多態(tài)性條帶數(shù)為2～19個(gè)，平均為8.8個(gè)。其中，10對(duì)基于煙草葉綠體基因組開發(fā)的SSR引物在35份野生煙草材料中共擴(kuò)增得到59個(gè)多態(tài)性條帶，每對(duì)SSR引物可檢測(cè)的多態(tài)性條帶數(shù)為2～13個(gè)，平均為5.9個(gè)。10對(duì)煙草線粒體基因組SSR在供試的35份野生煙草中共擴(kuò)增出117個(gè)多態(tài)性條帶，每對(duì)引物可檢測(cè)3～19個(gè)多態(tài)性條帶，平均為11.7個(gè)?？梢?，基于煙草葉綠體基因組和線粒體基因組序列開發(fā)的SSR標(biāo)記在檢測(cè)野生煙草基因組遺傳多態(tài)性上有很高的檢出效率。

圖1 引物Tcp067在35份野生煙草中的電泳結(jié)果Fig. 1 PCR products of SSR primer Tcp067 on non-denaturing PAGE by silver staining in 35 wild Nicotiana species

2.2 35份野生煙草種質(zhì)的遺傳相似性分析

遺傳相似性分析結(jié)果表明，參試的35份煙草野生資源的遺傳多樣性豐富，相似性系數(shù)在0.20～1.00之間，變化范圍較大，平均為0.57（表3）。其中，N.suaveolens（W33）與其他 34份煙草材料間的遺傳相似性系數(shù)最高，平均為0.86；而N.africana（W25）與其余34份煙草材料間的遺傳相似性系數(shù)最低，平均為0.23。同屬于香甜煙草組（Suaveolentes）的N.gossei（W31）和N.suaveolens（W33）間的遺傳相似性系數(shù)最大，達(dá)到1.00；同屬于圓錐煙草組（Paniculata）的N.paniculata（W02）和N.benavidesii（W04），及同屬于香甜煙草組（Suaveolentes）的N.occidentalis（W34）與N.gossei（W31） 和N.suaveolens（W33） 間 的 遺 傳相似性系數(shù)均高達(dá)0.98；而N.africana（W25）分別與N.paniculata（W02）、N.benavidesii（W04）、N.tomentosa（W05）、N.tomentosiformis（W06）、N.otophora（W07）和N.kawakamii（W08）間的遺傳相似性系數(shù)最低，為0.20。

表3 35份野生煙草材料間的遺傳相似性系數(shù)Tab. 3 Genetic similarity coefficient in 35 wild tobacco materials

2.3 35份野生煙草種質(zhì)的聚類分析

從UPGMA法聚類結(jié)果（圖2）看出，供試的35份野生煙草資源并未完全按照經(jīng)典的三個(gè)亞屬（黃花煙亞屬（Rustica）、普通煙亞屬（Tabaccum）和 碧冬煙亞屬（Petunioides）進(jìn)行分類，即在分子水平上，無法將參試的35份野生煙草材料清晰的劃分為各自所屬的亞屬，但各個(gè)不同的組（section）卻能較好的區(qū)分開。在相似性系數(shù)為0.50處，可將新發(fā)現(xiàn)于非洲的野生煙N.africana（W25）與剩余的34份材料劃分開，而剩余的34份材料在適當(dāng)?shù)倪z傳相似性系數(shù)處，則能很清晰的聚為10個(gè)組，但3個(gè)亞屬間的界限卻不明顯。在聚類所獲得的10個(gè)煙草組中，除香甜煙草組（Suaveolentes）外，其余7個(gè)組與傳統(tǒng)的分組相吻合。

圖2 35份野生煙草材料的聚類分析樹狀圖Fig.2 Dendrogram derived from UPGMA cluster analysis of 35 wild tobacco materials

3 討論

3.1 基于煙草葉綠體基因組和線粒體基因組SSR標(biāo)記的野生煙草資源研究

在分子水平上對(duì)煙草種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究報(bào)道較多，但絕大部分的研究集中在RAPD、AFLP、SRAP和ISSR等非特異性標(biāo)記對(duì)屬于普通煙亞屬栽培種間的親緣關(guān)系分析[6,8-14]。利用特異性的SSR標(biāo)記對(duì)煙草種質(zhì)的研究報(bào)道始于2007年，之后應(yīng)用廣泛，如烤煙[17]、栽培煙草[18]親緣關(guān)系分析，赤星病抗、感煙草資源區(qū)分[22]，但核基因組SSR標(biāo)記在煙草種間的可用率極低[16]。

迄今為止，尚未有利用煙草葉綠體基因組和線粒體基因組SSR標(biāo)記對(duì)野生煙草種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析的研究。本研究利用10個(gè)煙草葉綠體基因組SSR標(biāo)記和10個(gè)煙草線粒體基因組SSR標(biāo)記，在35份野生煙草種質(zhì)資源（35個(gè)野生煙草種）中分別擴(kuò)增出59和117個(gè)多態(tài)性條帶，每個(gè)SSR標(biāo)記可檢測(cè)的多態(tài)性條帶數(shù)分別為2～13和3～19個(gè)，平均為5.9和11.7個(gè)，且20個(gè)SSR標(biāo)記在35個(gè)野生煙草種間均能進(jìn)行有效的PCR擴(kuò)增。兩種細(xì)胞器基因組SSR標(biāo)記在35個(gè)野生煙草種間的多態(tài)率（多態(tài)性SSR標(biāo)記數(shù)目/總SSR標(biāo)記數(shù)目×100）及每個(gè)多態(tài)性SSR標(biāo)記可檢測(cè)的多態(tài)性條帶數(shù)差異較大，煙草線粒體基因組SSR標(biāo)記具有更高的效率，多態(tài)率約為葉綠體基因組SSR標(biāo)記的兩倍。雖然葉綠體和線粒體內(nèi)各自含有一套不同于細(xì)胞核且具有相對(duì)獨(dú)立的遺傳物質(zhì)，但綠色植物協(xié)同進(jìn)化過程中，葉綠體能夠使維持自身基本功能的許多遺傳物質(zhì)以母性遺傳的方式較好保留下來，比線粒體種屬間的保守性更強(qiáng)。由此可見，葉綠體基因組和線粒體基因組在生物的種屬間均具有很強(qiáng)的保守性，其在煙屬種間具有豐富的遺傳多樣性，這兩種細(xì)胞器基因組SSR標(biāo)記也比細(xì)胞核基因組SSR標(biāo)記具有更強(qiáng)的種屬通用性，基于煙草細(xì)胞器基因組SSR標(biāo)記在種間或更高分類級(jí)別上對(duì)煙草遺傳育種領(lǐng)域的研究是可行的。

3.2 基于煙草葉綠體基因組和線粒體基因組SSR標(biāo)記的野生煙草種聚類分析

在分子水平上，對(duì)煙草屬內(nèi)66個(gè)種的起源、進(jìn)化及親緣關(guān)系的研究報(bào)道已有很多。如Aoki等[29]利用煙草葉綠體matK基因序列證實(shí)了煙草祖先種染色體基數(shù)為n=12，且起源于南美洲。Chase等[30]利用核糖體DNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）并結(jié)合基因組原位雜交（GISH）方法，對(duì)煙草屬內(nèi)66個(gè)種進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育及屬內(nèi)雜交種起源研究。Clarkson等[31]利用煙草內(nèi)含子trnL、間隔子trnL-F和trnS-G、基因ndlF和matK等質(zhì)體DNA序列的聚類結(jié)果表明，N.tabacum起源于南美洲的南部。隨后，Clarkson等[32]研究表明，利用低拷貝的核基因序列尋找多倍體的祖先種非常有用。對(duì)野生煙草種的聚類分析大多采用 AFLP標(biāo)記[33]、核基因組SSR標(biāo)記[16]等。本研究利用煙草葉綠體基因組和線粒體基因組SSR標(biāo)記[20]，對(duì)35份野生煙草材料進(jìn)行分類，但結(jié)果與以形態(tài)特征和生化表型為基礎(chǔ)的系統(tǒng)分類存在一定的出入，同一亞屬的野生煙草種并未聚在一類，而同一組（除香甜煙草組）的野生煙草材料卻能在適當(dāng)?shù)倪z傳相似性系數(shù)下清晰的劃分在一起。香甜煙草組（Suaveolentes）中的12份材料（W24～W35，見表1）則被劃分成3個(gè)部分， 即N.velutina（W26） 和N.rotundifolia（W30）為一組，N.fragrans（W27）和N.debneyi（W32）為一組，剩余的8份材料為一組。此外，本屬于該組的N.africana（W25）則被單獨(dú)歸為一類，而屬于裸莖煙草組（Nudicaules）的N.benthamiana（W23）則被歸為香甜煙草組（Suaveolentes）。該結(jié)果與Moon等[16]基于煙草核基因組SSR標(biāo)記的研究結(jié)果一致，而與李鳳霞等[33]基于AFLP標(biāo)記的研究結(jié)果截然不同。究其原因：1）可能是煙草屬3個(gè)亞屬下的分組在現(xiàn)有的研究中差別較大，以形態(tài)特征為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)分類方法將煙草屬分為14個(gè)組[1,3]，而以植物細(xì)胞核和質(zhì)體基因組區(qū)域特點(diǎn)為依據(jù)的分類方法將煙草屬分為13個(gè)組[2,4]，且組內(nèi)的成員也存在較大差異。2）可能是煙草屬內(nèi)的各個(gè)種多數(shù)是通過復(fù)雜的組間雜交而形成的[1-5]，各個(gè)種之間的親緣關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜。3）可能是分子標(biāo)記的不同而導(dǎo)致聚類分析結(jié)果的不同。比如AFLP標(biāo)記，受限制性內(nèi)切酶種類等選擇性因素的制約，不能在DNA水平上全面、真實(shí)地揭示出個(gè)體間的差異，導(dǎo)致其在聚類分析中的結(jié)果不如SSR標(biāo)記的準(zhǔn)確[34-36]。

綜上所述，細(xì)胞器基因組SSR標(biāo)記不僅具有核基因組SSR標(biāo)記的特異、穩(wěn)定、可重復(fù)、共顯等固有優(yōu)點(diǎn)，且還具有較高的種屬通用性，因而更適合在種間或更高分類級(jí)別上對(duì)煙草屬的起源、進(jìn)化、分類及種質(zhì)資源多樣性分析等進(jìn)行研究；但因其在同一物種內(nèi)（種內(nèi)）各品種間的遺傳多態(tài)性檢測(cè)效率極低而不適合種內(nèi)聚類分析研究。

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Genetic diversity analysis of genusNicotianabased on SSR markers in chloroplast genome and mitochondria genome

ZENG Jianmin，CHEN Xuejun，WU Xingfu，JIAO Fangchan，XIAO Bingguang， LI Yongping，TONG Zhijun
Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences, Key Laboratory of Tobacco Biotechnological Breeding, National Tobacco Genetic Engineering Research Center, Kunming 650021, China

Based on SSR markers in chloroplast genome and mitochondrial genome of tobacco, genetic diversity of 35 wild tobacco germplasm belonging to 3 subgenus and 9 sections was first analyzed in this study. 20 primer pairs were selected from 764 tobacco organelle genomic SSR markers which were previously developed by lab. A total of 176 polymorphic bands were ampli fi ed in 35 wildNicotianaspecies using 20 SSR primers, and the number of polymorphic bands detected by each SSR primer ranged from 2 to 19, with an average of 8.8 polymorphic bands per marker. Genetic similarity coefficient (GS) among the 35 wildNicotianaspecies ranged from 0.20 to 1.00, with an average of 0.57, which indicated the genetic variation of the 35 wildNicotianaspecies was quite large and the genetic diversity was much abundant inNicotianagenus. Except forSuaveolentessection, the 35 wildNicotianaspecies were clustered into 7 categories by an appropriate genetic similarity coefficient, while the boundary of three subgenus was not obvious. Results indicated that two kinds of tobacco organelle genomic SSR markers in this study are suitable for the evolution, classi fi cation, and genetic analysis among di ff erent tobacco species.

wild tobacco; genetic diversity; simple sequence repeat (SSR) markers

曾建敏，陳學(xué)軍，吳興富，等. 基于煙草葉綠體基因組和線粒體基因組SSR標(biāo)記的煙屬植物遺傳多樣性分析[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2016, 22（4）

中國(guó)煙草總公司項(xiàng)目（110201402002、110201302005）;中國(guó)煙草總公司云南省公司項(xiàng)目（2014YN04、2013YN09）

曾建敏（1977—），博士，主要從事煙草育種研究，Email：jmzeng@yntsti.com

童治軍（1980—），博士，主要從事煙草育種與生物技術(shù)研究，Email: tzj861@163.com

2016-04-07

：ZENG Jianmin，CHEN Xuejun，WU Xingfu，et al. Genetic diversity analysis of genusNicotianabased on SSR markers in chloroplast genome and mitochondria genome [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016,22(4)