煙草中煙堿轉(zhuǎn)化的遺傳機(jī)理研究現(xiàn)狀及展望

蔡長春，程玲，馮吉

湖北省煙草科學(xué)研究院，武漢 430030

綜述

煙草中煙堿轉(zhuǎn)化的遺傳機(jī)理研究現(xiàn)狀及展望

蔡長春，程玲，馮吉

湖北省煙草科學(xué)研究院，武漢 430030

介紹了普通煙草中煙堿向降煙堿轉(zhuǎn)化的生物合成過程、遺傳機(jī)理與NND基因的假基因化研究進(jìn)展，系統(tǒng)整理和總結(jié)了煙草中5個細(xì)胞色素P450家族基因的特征特性，并對亞甲基四氫葉酸還原酶基因（Methylenetetrahydrofolate Reductase，MTHFR）間接調(diào)控?zé)焿A轉(zhuǎn)化過程進(jìn)行了深入分析，同時分析了煙堿轉(zhuǎn)化率在不同煙草類型間存在差異的原因及煙草生物堿譜進(jìn)化的動力，最后結(jié)合中國煙草基因組計(jì)劃對后續(xù)研究思路包括新基因挖掘與低煙堿轉(zhuǎn)化煙草分子育種進(jìn)行了討論和展望。

煙草；煙堿轉(zhuǎn)化；遺傳機(jī)理；研究現(xiàn)狀；展望

煙草中的生物堿是一類非常重要的化學(xué)成分，目前已鑒定的煙草生物堿有40多種[1]，其中以煙堿（nicotine，俗稱尼古?。?、降煙堿（nornicotine）、新煙堿（anatabine）和假木賊堿（anabasine）等4種為主[2]，煙堿屬于叔胺類生物堿，吡咯環(huán)被氧化斷裂后才能發(fā)生亞硝化反應(yīng)生成煙草特有亞硝胺（Tobacco-speci fi c Nitrosamines，TSNAs），其他三種屬于仲胺類生物堿，可直接發(fā)生亞硝化反應(yīng)生成TSNAs[3]。

煙草屬中具有栽培價值的普通煙草（N. tabacum）和黃花煙草（N. rustica）均為煙堿積累型，煙堿占總生物堿含量的94%以上，降煙堿僅占2.5%～5%[4]。在栽培煙草群體中個別煙株因不穩(wěn)定轉(zhuǎn)化基因位點(diǎn)重新被激活而具備了煙堿去甲基化的能力，從而導(dǎo)致煙堿大量被轉(zhuǎn)化為降煙堿，這個過程被稱為煙堿轉(zhuǎn)化（nicotine conversion），具備煙堿轉(zhuǎn)化能力的煙株被稱為轉(zhuǎn)化株（converter）。就煙草類型而言，白肋煙和馬里蘭煙等晾煙的煙堿轉(zhuǎn)化率顯著高于烤煙，其原因與調(diào)制方式和轉(zhuǎn)化位點(diǎn)的數(shù)量及穩(wěn)定性有關(guān)[5]。

降煙堿易于在調(diào)制和陳化等過程中在微生物作用下與亞硝酸鹽發(fā)生亞硝化反應(yīng)而生成TSNAs，降煙堿與TSNAs的產(chǎn)生水平呈顯著正相關(guān)關(guān)系[6]。動物醫(yī)學(xué)試驗(yàn)表明[3,7-10]，目前已鑒定出8種TSNAs，其中亞硝基去甲基尼古?。∟itrosonornicotine，NNN）和4-甲基亞硝氨基-1-3-吡啶-1-丁酮（4-N-methylnitrosamino-1-3-pyridyl-1-butanone，NNK）對嚙齒類動物具有強(qiáng)致癌性，且后者活性大于前者[11]，另外，降煙堿本身還可導(dǎo)致吸煙者血液中蛋白質(zhì)的異常糖基化而影響人體健康[12]。國際癌癥組織（International Agency of Research on Cancer，IARC）已將NNN和NNK列為一級人體致癌物。此外，降煙堿還會影響煙葉的外觀質(zhì)量[13-14]和香味品質(zhì)[15-16]，降低煙葉使用價值。

在全球性禁煙運(yùn)動此起彼伏的大背景下，降低煙草有害成分如TSNAs含量以提高卷煙安全性已成為各國煙草企業(yè)及科研機(jī)構(gòu)的關(guān)注焦點(diǎn)[17]。相比于栽培、生化調(diào)控等措施，品種選育和改良被認(rèn)為是降低煙草降煙堿和TSNAs含量最有效的手段，目前已對骨干親本和主栽品種進(jìn)行了大量的有效改良[18-21]。剖析煙堿轉(zhuǎn)化過程的遺傳控制機(jī)理是培育低危害煙草新品種的重要前提和基礎(chǔ)。

本文詳細(xì)介紹了煙草中煙堿向降煙堿轉(zhuǎn)化的生物合成過程與遺傳機(jī)理研究進(jìn)展，重點(diǎn)總結(jié)了5個P450家族基因與亞甲基四氫葉酸還原酶基因（MTHFR）對煙堿轉(zhuǎn)化的影響，并結(jié)合中國煙草基因組計(jì)劃（China Tobacco Genome Initiative，CTGI）展望了下一步研究思路，這對于全面深入了解煙堿轉(zhuǎn)化現(xiàn)象、開發(fā)減害煙草新材料及促進(jìn)行業(yè)健康發(fā)展意義重大。

1 煙堿轉(zhuǎn)化的生物合成過程

煙堿轉(zhuǎn)化是煙草體內(nèi)非常重要的次生代謝反應(yīng)之一。20世紀(jì)40年代，Dawson[22]研究發(fā)現(xiàn)，耳狀煙草（N.otophora）和絨毛狀煙草（N. tomentosformis）中的降煙堿來源于煙堿的去甲基化。煙草-番茄嫁接試驗(yàn)表明[23]，煙葉是煙堿轉(zhuǎn)化的主要場所，調(diào)制和陳化過程則是煙堿轉(zhuǎn)化發(fā)生的集中時間段。確切的研究表明，煙堿轉(zhuǎn)化過程主要是一個酶促氧化去甲基化過程，其中關(guān)鍵的酶是煙堿去甲基化酶（nicotine N-demethylase，NND），它催化了煙堿去甲基向降煙堿的轉(zhuǎn)化[24-25]。這個過程可簡化為：煙堿分子上的N’-甲基在NND酶和P450氧化酶的聯(lián)合作用下發(fā)生氧化反應(yīng)從而被去掉，生成不穩(wěn)定的衍生物羥基化煙堿，自然分解后生成甲醛和去甲基煙堿，此過程不涉及吡咯環(huán)開環(huán)事件，也沒有生成其他中間產(chǎn)物。

2008年，Chakrabarti等[26]研究認(rèn)為，煙葉衰老是影響煙堿轉(zhuǎn)化的最主要誘導(dǎo)因素，其次是乙烯處理和煙草花葉病毒（Tobacco Mosaic Virus，TMV）。煙堿轉(zhuǎn)化主要發(fā)生在煙葉收獲后調(diào)制開始的前3周，但隨著煙葉細(xì)胞的逐漸死亡，煙堿去甲基化酶活性逐漸減弱，煙堿轉(zhuǎn)化反應(yīng)則逐漸中止[27]。團(tuán)棵期使用乙烯處理新鮮煙葉可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化關(guān)鍵基因CYP82E4（CYP即Cytochrome P450 proteins）的高表達(dá)，促進(jìn)煙堿大量被轉(zhuǎn)化[28]。

2 煙堿轉(zhuǎn)化的遺傳機(jī)理研究

目前煙草屬中60%左右的種屬于煙堿積累型，30%～40%的種屬于降煙堿積累型，如林煙草（N.sylvestris）、絨毛狀煙草（N. tomentosformis）和耳狀煙草（N. otophora）[29]。普通煙草是林煙草和絨毛狀煙草雜交后自然加倍形成的異源四倍體。在煙草栽培歷史中，人工選擇不具備煙堿轉(zhuǎn)化能力的普通煙草突變體進(jìn)行栽培利用，經(jīng)過長期定向選擇和馴化，普通煙草進(jìn)化成煙堿積累型。但在煙草群體中，由于基因突變使得某些煙株具備了煙堿去甲基化的能力，其中白肋煙的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象比烤煙更普遍和嚴(yán)重[5]。

1955年Griffith等[30]根據(jù)育種實(shí)踐首次提出煙堿轉(zhuǎn)化屬于簡單遺傳現(xiàn)象，受1個或2個顯性基因位點(diǎn)控制?，F(xiàn)代基因組學(xué)研究表明[29]，煙草中P450基因家族的基因在基因組上呈串聯(lián)排列狀態(tài)，發(fā)生共分離的概率較高，為煙堿轉(zhuǎn)化現(xiàn)象呈現(xiàn)簡單遺傳現(xiàn)象提供了證據(jù)。Mann和Webrew[31]研究發(fā)現(xiàn)分別來自林煙草和絨毛狀煙草中的兩個顯性基因位點(diǎn)CS和CT控制著煙堿轉(zhuǎn)化過程，其中CT更為活躍，它的突變率可高達(dá)14%，因而更易導(dǎo)致降煙堿的形成。1968年Wernsman等[32]研究表明，CT能引起煙葉衰老前煙堿向降煙堿轉(zhuǎn)化，而CS能引起衰老過程中煙堿的轉(zhuǎn)化。有研究認(rèn)為，含有控制煙堿轉(zhuǎn)化關(guān)鍵等位基因ctct、CT ct及CTCT的試驗(yàn)煙株的煙葉中降煙堿占總煙堿的比例平均分別為3%～9%、17%～51%與73%～94%[27]。

另外，對于煙草中煙堿轉(zhuǎn)化性狀的遺傳穩(wěn)定性研究表明[5]，高轉(zhuǎn)化性狀較為穩(wěn)定，而低轉(zhuǎn)化性狀易發(fā)生突變，有學(xué)者認(rèn)為這是由煙堿轉(zhuǎn)化關(guān)鍵基因不穩(wěn)定突變所致，也有學(xué)者認(rèn)為轉(zhuǎn)座因子可能參與了煙堿轉(zhuǎn)化過程。

3 煙堿轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的研究進(jìn)展

有研究學(xué)者通過試驗(yàn)推測[22]，煙堿轉(zhuǎn)化過程中可能存在著一個至關(guān)重要的煙堿去甲基化酶，但由于該酶屬于液泡膜鑲嵌蛋白，離體后極不穩(wěn)定，難以通過純化獲得，直到1993年，Hao和Yeoman[24]在煙草懸浮細(xì)胞中證明了這種酶的存在。對煙堿去甲基化酶的特征研究顯示[5]，它屬于細(xì)胞色素P450單加氧酶家族成員。

盡管煙草是細(xì)胞遺傳學(xué)的模式植物，但因其基因組巨大（4.5G）且屬異源四倍體而導(dǎo)致其分子生物學(xué)研究遠(yuǎn)落后于其他模式植物。2002年，美國菲利普-莫里斯煙草公司向美國北卡羅來納州立大學(xué)支持研究經(jīng)費(fèi)1760萬美元，計(jì)劃花四年半時間獲得90%的煙草全基因組序列，到2007年美國只完成了煙草基因組計(jì)劃的部分任務(wù)，有保留的向公共數(shù)據(jù)庫提交了煙草基因組數(shù)據(jù)，后續(xù)測序工作也未見公開報(bào)道。2010年，中國啟動了煙草基因組計(jì)劃，2013年底順利完成兩個野生祖先種林煙草和絨毛狀煙草及栽培種紅花大金元的全基因組測序，這些煙草基因組數(shù)據(jù)的獲得對于分離克隆與煙堿轉(zhuǎn)化相關(guān)的基因、剖析煙堿轉(zhuǎn)化過程及遺傳機(jī)理提供了強(qiáng)有力的支撐。

利用國際公共數(shù)據(jù)庫Genbank所公布的煙草表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressed Sequence Tag, EST）數(shù)據(jù)，2005年到2010年間，以美國北卡羅來納州立大學(xué)和肯塔基大學(xué)為主的研究機(jī)構(gòu)相繼分離和鑒定了與煙堿轉(zhuǎn)化密切相關(guān)的五個基因（表1）：CYP82E2[29]、CYP82E3[33]、CYP82E4v1[28]、CYP82E5v2[34]和CYP82E10[35]，其中CYP82E5v2在鮮葉中特異表達(dá)，CYP82E10在根部特異表達(dá)，CYP82E4v1主要在衰老葉片中表達(dá)，是煙堿轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵基因，這些基因之間具備高度的同源性（表2）。另外，2013年發(fā)現(xiàn)一個亞甲基四氫葉酸還原酶基因（MTHFR1），通過負(fù)調(diào)控CYP82E4v1基因的表達(dá)水平來影響煙堿向降煙堿的轉(zhuǎn)化[36]。下面對這些基因或酶的來源、特征與功能及NND基因的假基因化進(jìn)行逐一分述。

表1 煙草中已被鑒定和特征分析的調(diào)控?zé)焿A轉(zhuǎn)化的基因Tab. 1 The identi fi ed and characterized genes mediating nicotine-to-nornicotine conversion in tobacco

表2 煙草中煙堿轉(zhuǎn)化基因之間的序列相似性Tab. 2 Sequence identity among genes mediating nicotine-to-nornicotine conversion in tobacco %

3.1 CYP82E2

CYP82E2和CYP82E3是CYP82E2基因家族中最先通過微列陣芯片雜交技術(shù)被鑒定的基因[28]，但在普通煙草中，這兩個基因發(fā)生了替換突變從而喪失了催化煙堿向降煙堿轉(zhuǎn)化的能力。2007年，Chakrabarti等[29]從林煙草和普通煙草cDNA（complementary DNA）文庫中分別特異擴(kuò)增獲得兩個序列相似性高達(dá)99.8%的P450基因，這兩個擴(kuò)增基因分別命名為NsylCYP82E2（Nsyl代表林煙草，下同）和NtabCYP82E2（Ntab代表普通煙草，下同），而沒有從絨毛狀煙草中獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，說明該基因來源于林煙草。同源序列比較顯示，NsylCYP82E2與NtabCYP82E3和NtabCYP82E4的編碼區(qū)均具備94%的相似性，氨基酸的相似性分別為92.7%和93.4%。DNA序列比對結(jié)果表明，NsylCYP82E2與NtabCYP82E2只在基因組序列第1123位、1243位和1265位存在3個堿基差異，其中第1123位和1265位的堿基差異分別導(dǎo)致第375位氨基酸（NsylCYP82E2為谷氨酸，NtabCYP82E2為賴氨酸）和422位氨基酸（NsylCYP82E2為色氨酸，NtabCYP82E2為亮氨酸）存在差異，分別被命名為E375K和W420L替換突變，它們是這兩個同源基因所編碼的NND酶活性存在差異的關(guān)鍵原因。而第1243位的堿基替換屬于無義突變，不影響NND酶活性。定點(diǎn)誘變和酵母異源表達(dá)試驗(yàn)揭示，這兩個突變中的任何一個均可導(dǎo)致NsylCYP82E2編碼的NND酶活性消失。換言之，NsylCYP82E2編碼一個有功能的NND酶，其活性受控于這兩個基因位點(diǎn)，而NtabCYP82E2編碼的NND酶活性消失恰是因?yàn)檫M(jìn)化過程中發(fā)生了這兩個堿基替換突變事件。RT-PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）試驗(yàn)表明，鮮葉中NsylCYP82E2和NtabCYP82E2的表達(dá)均較低，但在晾制后煙葉中表達(dá)急劇上升，其中林煙草中上升幅度最大，由此推斷，NsylCYP82E2屬于衰老誘導(dǎo)型NND基因，而NtabCYP82E2雖然在晾制后煙葉中高表達(dá)，但它的表達(dá)與煙堿轉(zhuǎn)化無關(guān)而不屬于NND基因。等位基因特異PCR分析將NsylCYP82E2定位于CS轉(zhuǎn)化位點(diǎn)所在的基因組區(qū)域內(nèi)。綜上所述，這兩個氨基酸的替換突變是現(xiàn)代煙草生物堿譜進(jìn)化過程中的關(guān)鍵事件。

3.2 CYP82E3

該基因是2005年由Siminszky等[28]最先從普通煙草中鑒定出來的CYP82E2基因家族成員之一，雖然在普通煙草中NtabCYP82E3與NtabCYP82E4氨基酸序列相似性高達(dá)94.8%（核苷酸序列相似性為94.0%）（表2），但NtabCYP82E3并非NND基因。2007年，肯塔基大學(xué)的Gavilano等[34]采用特異同源PCR擴(kuò)增證明了CYP82E3來源于絨毛狀煙草。利用NtabCYP82E3與NtabCYP82E4序列的高度相似性，采用片段替換、定點(diǎn)誘變和酵母表達(dá)等技術(shù)鑒定了NtabCYP82E3核苷酸序列第900處的堿基C到G的替換（即氨基酸第330處色氨酸到半胱氨酸的替換，命名為W330C突變），這是NtabCYP82E3所編碼的NND酶活性喪失的關(guān)鍵原因，而其他基因位點(diǎn)的差異與NND酶活性無關(guān)。酵母異源表達(dá)試驗(yàn)證明，絨毛狀煙草中的NtomCYP82E3（Ntom代表絨毛狀煙草，下同）和NtomCYP82E4均編碼有活性的NND酶，分別在鮮葉和衰老葉片中高表達(dá)。序列分析表明，NtomCYP82E3與NtabCYP82E3關(guān)鍵的W330C突變導(dǎo)致了NND酶活性差異，而NtomCYP82E4與NtabCYP82E4僅有的兩個堿基差異沒有導(dǎo)致NND酶活性改變。綜上所述，NtabCYP82E3的W330C替換突變造成NND酶活性的喪失是在CYP82E2發(fā)生兩個堿基替換突變導(dǎo)致煙草NND酶活性改變之后的又一類似進(jìn)化事件，這對于現(xiàn)代煙草生物堿譜的形成同樣意義重大。

3.3 CYP82E4

2005年，Siminszky等[28]采用以cDNA微陣列芯片技術(shù)為核心的分析策略，比較白肋煙高轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化煙草衰老葉片中的基因差異表達(dá)，成功鑒定出6個與細(xì)胞色素P450基因家族同源的基因，被命名為CYP82E2家族，彼此之間的同源性均超過了90%（表2），其中3個成員高度同源，即NtabCYP82E2、NtabCYP82E3和NtabCYP82E4（又分v1和v2兩種亞型，實(shí)際上為同一基因），NtabCYP82E4v1與NtabCYP82E2和NtabCYP82E3核苷酸序列的同源性分別為92.8%和94.8%。轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析表明，這3個基因在高煙堿轉(zhuǎn)化煙草中的轉(zhuǎn)錄量是非轉(zhuǎn)化煙草中的2倍。RNAi（Ribonucleic Acid interference）干擾試驗(yàn)和轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)表明，只有NtabCYP82E4v1編碼有活性的NND酶，因此該基因被鑒定為煙堿轉(zhuǎn)化過程中的關(guān)鍵基因。同時也證明了NtabCYP82E4v1基因本身編碼NND酶，而不是編碼NND酶上游的調(diào)控因子。另外，2008年Chakrabarti等[26]的研究表明，煙草中CYP82E4基因?qū)焿A轉(zhuǎn)化過程的調(diào)控受一個衰老特異的信號誘導(dǎo)途徑控制，它的轉(zhuǎn)錄表達(dá)僅受非生物處理如晾制和生物處理如乙烯、TMV（Tobacco Mosaic Virus）病毒侵染等導(dǎo)致煙葉衰老的處理影響。

3.4 CYP82E5v2

2007年，Gavilano等[34]根據(jù)CYP82E3基因保守區(qū)域序列設(shè)計(jì)特異引物從普通煙草鮮葉cDNA文庫中擴(kuò)增出一個不同用于所有已鑒定的CYP82E2基因家族序列的基因，被命名為NtabCYP82E5v2，它與NtabCYP82E2、NtabCYP82E3及NtabCYP82E4的 核苷酸序列相似性分別為92.3%、92.6%及92.7%，氨基酸序列相似性分別為89.2%、91.9%及91.3%（表2）。特異引物擴(kuò)增試驗(yàn)表明CYP82E5v2來源于絨毛狀煙草。酵母異源表達(dá)試驗(yàn)證明該基因編碼有活性的NND酶。采用RT-PCR分析了CYP82E5v2的表達(dá)模式，結(jié)果表明，在鮮葉中CYP82E5v2的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于CYP82E4v1，在晾制后煙葉中，情況恰好相反。CYP82E5v2基因在鮮葉特異表達(dá)，但它在煙草鮮葉和衰老煙葉中的表達(dá)水平均較低，遠(yuǎn)低于CYP82E4v1在衰老葉片中的表達(dá)水平，因此，CYP82E5v2只是煙堿轉(zhuǎn)化的次要基因。

3.5 CYP82E10

2010年，Lewis等[35]發(fā)現(xiàn)白肋煙高煙堿轉(zhuǎn)化品種 DH98-325-6（DH 即 Doubled Haploid） 的 RNAi（沉默NtabCYP82E4v1基因）轉(zhuǎn)基因煙株的煙堿轉(zhuǎn)化率（0.7%）遠(yuǎn)低于其NtabCYP82E4v1單突變株轉(zhuǎn)化率（2.6%）或NtabCYP82E4v1和NtabCYP82E5v2的純合雙突變株轉(zhuǎn)化率（2.3%），由此推測，煙草中可能存在與NtabCYP82E4v1同源的其他NND基因在RNAi過程中也被同源沉默了。為此，研究人員以NtabCYP82E4v1基因的核苷酸和蛋白質(zhì)序列為搜索序列，對Genbank中的煙草EST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了BLASTN（The Basic Local Alignment Search Tool Nucleotide）和BLASTX（The Basic Local Alignment Search Tool X）搜索比對，發(fā)現(xiàn)有7個來自于煙草根部cDNA文庫中的EST（Expressed Sequence Tags）序列與之前鑒定的其他NND基因序列存在差異，且該基因優(yōu)先在根部表達(dá)，這也是之前一直未被發(fā)現(xiàn)的原因，獲得該基因全長序列后被命名為NtabCYP82E10，與NtabCYP82E4v1和NtabCYP82E5v2的核酸序列相似性分別為92.4%和96.5%（表2）。通過NtabCYP82E10特異引物擴(kuò)增試驗(yàn)證明了該基因來源于林煙草，但NtabCYP82E10也只是影響煙堿轉(zhuǎn)化的次要基因。

3.6 MTHFR

MTHFR（亞甲基四氫葉酸還原酶）是由四氫葉酸酯（Tetrahydrofolate，THF）所調(diào)控的C1（one-carbon）代謝途徑的關(guān)鍵酶，它催化著5,10-亞甲基-四氫葉酸酯還原為5-甲基-四氫葉酸酯，而后者可將其甲基貢獻(xiàn)給同型半胱氨酸，形成甲硫氨酸（Methionine，Met），用于腺苷蛋氨酸（S-adenosyl-L-methionine，SAM）的合成，SAM是一個大多數(shù)甲基化反應(yīng)的甲基供體，比如煙堿的生物合成。2013年，Hung等[36]根據(jù)擬南芥、玉米和水稻的MTHFR基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異引物獲得煙草MTHFR基因全長。序列比對揭示，普通煙草中存在NtMTHFR1和NtMTHFR2兩個同源基因，二者核苷酸序列相差4%，同源性檢測證明，NtMTHFR1來源于林煙草，NtMTHFR2來源于絨毛狀煙草。超表達(dá)試驗(yàn)和RNAi敲除試驗(yàn)表明，在超表達(dá)NtMTHFR1基因煙草中，NtMTHFR1的表達(dá)水平比對照增加2～3倍，而CYP82E4的表達(dá)水平卻比對照減少了4～8倍，煙堿轉(zhuǎn)化率比對照減少20%～40%，降煙堿含量比對照減少25%～50%。而在敲除NtMTHFR1基因煙草中，NtMTHFR1的表達(dá)比對照減少了3～8倍，CYP82E4的表達(dá)受到強(qiáng)烈的上調(diào)誘導(dǎo)，其轉(zhuǎn)錄水平卻比對照高出達(dá)700倍之多，煙堿轉(zhuǎn)化率顯著高于對照，降煙堿含量卻比對照增加40%～400%。這充分表明，NtMTHFR1穩(wěn)定負(fù)調(diào)控著CYP82E4基因的表達(dá)，進(jìn)而影響煙堿向降煙堿的轉(zhuǎn)化。但乙烯產(chǎn)量試驗(yàn)表明，敲除NtMTHFR1基因的煙草鮮葉中CYP82E4基因的高誘導(dǎo)表達(dá)可能并非由衰老信號引發(fā)。本研究推測出一種甲基供給的調(diào)控機(jī)制：由MTHFR催化的生化反應(yīng)最終的目的是要產(chǎn)生大量的甲基以促進(jìn)初級和次級代謝產(chǎn)物的生成，當(dāng)NtMTHFR1基因被超表達(dá)時，可催化5,10-亞甲基-四氫葉酸酯還原為5-甲基-四氫葉酸酯，將產(chǎn)生的甲基貢獻(xiàn)給同型半胱氨酸合成甲硫氨酸，繼續(xù)合成作為甲基供體的腺苷蛋氨酸，生成的甲基進(jìn)入C1代謝途徑合成初級和次級代謝物如煙堿，為保持甲基供應(yīng)的平衡，抑制了煙堿去甲基化的轉(zhuǎn)化關(guān)鍵基因CYP82E4的表達(dá)；相反，當(dāng)NtMTHFR1基因表達(dá)被抑制時，甲基供體腺苷蛋氨酸合成受到抑制，導(dǎo)致甲基供應(yīng)不足，因此，CYP82E4基因被上調(diào)誘導(dǎo)，強(qiáng)烈促進(jìn)煙堿向降煙堿轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生大量甲基，進(jìn)入C1途徑生產(chǎn)初級和次級代謝產(chǎn)物。

3.7 NND基因的假基因化

2012年，Pakdeechanuan等[37]根據(jù)CYP82E基因的保守區(qū)序列設(shè)計(jì)引物從花煙草（N. alata）和藍(lán)格斯多夫煙草（N. langsdorffii）分別獲得四個CYP82E基因：NalaCYP82E1、NalaCYP82E2、NalaCYP82E3和NalaCYP82E4和兩個CYP82E基因：NlanCYP82E1和NlanCYP82E2。這六個CYP82E基因編碼的蛋白質(zhì)序列與普通煙草、林煙草和絨毛狀煙草CYP82E基因編碼的蛋白質(zhì)序列高度相似。內(nèi)含子位置與普通煙草的CYP82E4和林煙草的CYP82E2的內(nèi)含子位置完全一致，只是長度存在差別而已，其中NlanCYP82E2核苷酸序列第一個外顯子第345處發(fā)生了一個堿基刪除，導(dǎo)致編碼的氨基酸發(fā)生移框突變，最終導(dǎo)致一個截?cái)嗟腃YP82E蛋白質(zhì)（翻譯提前終止），從而失去NND酶活性，最終無法催化煙堿形成降煙堿，如果把堿基C插入刪除位置，那么恢復(fù)的氨基酸序列與花煙草和藍(lán)格斯多夫煙草的CYP82E蛋白質(zhì)高度相似。酵母表達(dá)試驗(yàn)表明，花煙草四個CYP82E基因和藍(lán)格斯多夫煙草的NlanCYP82E1均能催化煙堿向降煙堿的轉(zhuǎn)化，屬于NND基因，NlanCYP82E1基因由于順式作用激活缺陷而沒有在藍(lán)格斯多夫煙草和F1代中檢測到表達(dá)，而NlanCYP82E2提前終止翻譯僅獲得截?cái)嗟牟痪邆銷ND酶活性的不完整蛋白質(zhì)，均導(dǎo)致藍(lán)格斯多夫煙草最終沒有合成降煙堿。而花煙草四個NND基因均在其根部表達(dá)?；蛐团c表型分離試驗(yàn)表明，這些NND基因在煙草染色體上呈遺傳連鎖分布，彼此相距較近。NlanCYP82E1基因失活的機(jī)制不同于CYP82E4基因的轉(zhuǎn)錄失活機(jī)制，前者的失活是穩(wěn)定的，且不是由多倍化所導(dǎo)致，它失活的原因可能是NlanCYP82E1基因啟動子上關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的丟失導(dǎo)致順式失活，后者的失活是不穩(wěn)定的，極易被重新激活具備編碼有活性NND酶的能力，這為揭示CYP82E4基因的失活機(jī)制及高頻率的回復(fù)突變提供了科學(xué)依據(jù)。

4 討論和展望

本綜述系統(tǒng)介紹了煙草中煙堿向降煙堿轉(zhuǎn)化的生物合成過程、遺傳機(jī)理及五個CYP82E2家族基因與MTHFR基因控制煙堿轉(zhuǎn)化的分子機(jī)理及NND基因的假基因化影響，對于深入了解煙草生物堿譜進(jìn)化改變與開展精準(zhǔn)分子設(shè)計(jì)育種，培育減害煙草新品種具有較強(qiáng)的指導(dǎo)作用，也為后續(xù)深入挖掘影響煙堿轉(zhuǎn)化的新基因最終構(gòu)建完整的煙堿代謝網(wǎng)絡(luò)奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

4.1 煙草生物堿譜的進(jìn)化與關(guān)鍵基因的突變

已有的研究表明，自然界中大約有20%的植物能夠產(chǎn)生生物堿，它對于植物的自我防御與人類的健康是不可或缺的[35-36,38-41]。普通煙草的祖先種絨毛狀煙草和林煙草均為降煙堿積累型，而普通煙草屬于煙堿積累型。這種生物堿譜改變的進(jìn)化動力存在兩種可能：一種是自然選擇或者自然突變。毒理學(xué)研究表明[42]，煙堿比降煙堿具備更強(qiáng)的殺蟲能力與對食草動物更大的毒性，因此，在自然選擇壓力下，控制煙堿轉(zhuǎn)化的基因發(fā)生了自然突變導(dǎo)致NND酶活性喪失，如CYP82E2基因的E375K與W420L替換突變、CYP82E3基因的W330C替換突變與CYP82E4基因的不穩(wěn)定突變等，這是煙草適應(yīng)環(huán)境而做出的自我防御反應(yīng)。另一種可能是人工選擇的結(jié)果[32]。低轉(zhuǎn)化株的煙葉比高轉(zhuǎn)化株具備更好的吸食品質(zhì)，導(dǎo)致人類在長期的煙草栽培歷史中偏向性篩選煙堿含量高的突變株進(jìn)行大面積種植，而高轉(zhuǎn)化株逐漸被淘汰掉，盡管因不穩(wěn)定轉(zhuǎn)化基因位點(diǎn)的回復(fù)突變而始終存在少量的高轉(zhuǎn)化株，但現(xiàn)代煙草已進(jìn)化為煙堿積累型。這兩種進(jìn)化途徑極有可能不是孤立的，而應(yīng)是同時存在共同推進(jìn)了煙草生物堿譜的進(jìn)化改變，不過，精確的結(jié)論仍有待未來研究的繼續(xù)深入。

4.2 烤煙與白肋煙煙堿轉(zhuǎn)化率的差異分析

不同煙草類型間的煙堿轉(zhuǎn)化率存在較大差異[43]，比如白肋煙群體中一般轉(zhuǎn)化株占15%～20%的比例，轉(zhuǎn)化率可高達(dá)90%以上，而烤煙的轉(zhuǎn)化率一般在3%以下，推測產(chǎn)生這種差異的可能原因主要有三[34]：一是煙堿轉(zhuǎn)化基因如CYP82E4在烤煙中的穩(wěn)定性高于白肋煙；二是煙堿轉(zhuǎn)化基因在白肋煙與烤煙中存在數(shù)量上的差異；三是調(diào)制方式的差異影響了煙堿轉(zhuǎn)化基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平與NND酶活性差異。

4.3 煙草中降煙堿的合成途徑

迄今為止，已分離和鑒定出煙草中影響煙堿轉(zhuǎn)化的五個基因：CYP82E2、CYP82E3、CYP82E4v1、CYP82E5v2與CYP82E10，均屬于P450家族基因，其中CYP82E2與CYP82E10來源于林煙草，其他三個基因來源于絨毛狀煙草，CYP82E5v2在鮮葉中特異表達(dá)，CYP82E10在根部特異表達(dá)，普通煙草中的CYP82E2與CYP82E3因發(fā)生了替換突變從而導(dǎo)致編碼的NND酶活性喪失，CYP82E4v1是煙堿轉(zhuǎn)化過程中的關(guān)鍵基因，CYP82E5v2與CYP82E10僅起次要作用。另外，在煙草中鑒定了一個NtMTHFR1基因[36]，該基因來源于林煙草，穩(wěn)定負(fù)調(diào)控CYP82E4基因的表達(dá)，進(jìn)而影響煙堿轉(zhuǎn)化過程。但三基因敲除純合突變株（e4e4/e5e5/e10e10）的煙堿轉(zhuǎn)化率仍有0.5%～0.7%[35]，這說明煙草中存在促使降煙堿合成的其他因子或途徑。2007年Heim等[44]同源克隆和特征分析了煙草根部表達(dá)煙堿合成代謝途徑中的關(guān)鍵基因：甲基腐胺氧化酶基因（MPO），MPO蛋白質(zhì)的動力學(xué)屬性試驗(yàn)表明，MPO蛋白質(zhì)在非特異性情況下可利用腐胺和尸胺分別合成降煙堿和假木賊堿，這是目前發(fā)現(xiàn)的降煙堿可由除煙堿之外的其他物質(zhì)合成的新途徑，這也較好的解釋了三突變體（e4e4/e5e5/e10e10）仍然會有少量降煙堿存在的現(xiàn)象。

4.4 中國煙草基因組計(jì)劃與分子育種展望

已完成煙草全基因組測序的中國煙草基因組計(jì)劃（即將公開數(shù)據(jù)）不僅可以挖掘其他潛在的新煙堿轉(zhuǎn)化基因，更能為解析煙堿合成代謝整個網(wǎng)絡(luò)提供強(qiáng)有力的基因數(shù)據(jù)支撐。本文采用以上基因標(biāo)記對高轉(zhuǎn)化與低轉(zhuǎn)化的白肋煙近等基因系煙草材料進(jìn)行了基因組與表達(dá)譜檢測，初步結(jié)果表明，可能存在1個以上不同于以上煙堿轉(zhuǎn)化基因的新位點(diǎn)（數(shù)據(jù)未公開），準(zhǔn)確結(jié)論有待后續(xù)的測序與分析工作的完成。2012年，李丹丹等[45]針對CYP82E4v1的截?cái)嗤蛔冮_發(fā)出4個 dCAPS（derived Cleaved amplified Polymorphic Sequence）標(biāo)記、CYP82E5v2的截?cái)嗤蛔冮_發(fā)出一個dCAPS標(biāo)記和CYP82E10的錯義突變開發(fā)出兩個CAPS（Cleaved ampli fi ed Polymorphic Sequence）標(biāo)記，其中來源于CYP82E4v1的dCAPs標(biāo)記E4D1標(biāo)記具有較高的育種價值，不僅可有效區(qū)分雜合體與純合體，而且能從海量的EMS誘變株中準(zhǔn)確篩選出穩(wěn)定的多基因突變純合低煙堿轉(zhuǎn)化品系，大大提高了育種工作的精確度與效率。這些與煙堿轉(zhuǎn)化過程密切相關(guān)的基因的分離、鑒定與特征分析大大有利于開發(fā)分子標(biāo)記，進(jìn)而開展非轉(zhuǎn)基因的分子育種以選育低煙堿轉(zhuǎn)化的減害煙草新品種，對降低煙草危害具有重大的經(jīng)濟(jì)和社會意義。

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Advances and prospects in research on genetic mechanisms of nicotine to nornicotine conversion inNicotiana tabacumL.

CAI Changchun, CHENG Ling, FENG Ji
Hubei Provincial Tobacco Research Institute, Wuhan 430030, China

Biosynthetic process of genetic mechanisms of nicotine to nornicotine conversion inNicotiana tabacumL. and research progress of non-functionalization of N-demethylase (NND) genes were introduced in detail in this paper. Genetic features of fi ve identi fi edCYP82E2family members, namelyCYP82E2,CYP82E3,CYP82E4v1,CYP82E5v2andCYP82E10belong to cytochrome P450 genes were summarized and in-depth analysis of the function of methylenetetrahydrofolate reductase gene (MTHFR) in indirectly a ff ecting nicotine conversion by regulatingCYP82E4v1negatively was conducted. Reasons for di ff erences of nicotine to nornicotine conversion rate (NCR)in di ff erent tobacco species, especially between burley tobacco and fl ue-cured tobacco, and driving forces for the evolution of alkaloid pro fi le of tobacco was investigated. Prospects of discovering new genes controlling nicotine conversion and developing tobacco varieties with low NCRs by molecular breeding were discussed.

tobacco; nicotine to nornicotine conversion; genetic mechanisms; research advances; prospects

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湖北省煙草公司重點(diǎn)科技項(xiàng)目（027Y2012-098）

蔡長春（1974—），博士，副研究員，主要從事煙草遺傳育種和分子生物學(xué)研究，Tel: 027-83608892；E-mail：ccchun2001@aliyun.com

馮 吉（1981—），博士，農(nóng)藝師，主要從事煙草基因組學(xué)研究，Email：fengji1981@163.com

2015-06-03

:CAI Changchun, CHENG Ling, FENG Ji. Advances and prospects in research on genetic mechanisms of nicotine to nornicotine conversion inNicotianatabacumL. [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016,22(4)