兩個(gè)煙草Nup96基因的分子克隆及其表達(dá)分析

林世鋒，王仁剛，史躍偉，張孝廉，鄒頡，任學(xué)良，余婧

貴州省煙草科學(xué)研究院，煙草行業(yè)分子遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽龍灘壩路29號(hào) 550081

兩個(gè)煙草Nup96基因的分子克隆及其表達(dá)分析

林世鋒，王仁剛，史躍偉，張孝廉，鄒頡，任學(xué)良，余婧

貴州省煙草科學(xué)研究院，煙草行業(yè)分子遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽龍灘壩路29號(hào) 550081

為研究煙草低溫早花的分子機(jī)理，采用RT-PCR結(jié)合RACE法，從煙草品種NC82中克隆到2個(gè)Nup96基因cDNA全長(zhǎng)序列，分別命名為NtNup96a和NtNup96b，GenBank登陸號(hào)分別為KU558693和KU558694。序列分析表明2個(gè)基因均編碼1037個(gè)氨基酸殘基的蛋白，氨基酸序列一致性為97%，與擬南芥Nup96蛋白（NP_178183）的序列一致性為60%；2個(gè)基因編碼蛋白具有典型的植物Nup96結(jié)構(gòu)特性，包含1個(gè)Nup96結(jié)構(gòu)域和1個(gè)自酶解結(jié)構(gòu)域。熒光定量PCR分析表明：在正常的生長(zhǎng)條件下，NtNup96a和NtNup96b在煙草各組織中均有表達(dá)，在葉片中的表達(dá)量較弱，且隨著植株生長(zhǎng)其表達(dá)量顯著下降；在

12℃處理10天后，在煙草葉片中2基因的表達(dá)都出現(xiàn)了明顯的下調(diào)，這一結(jié)果提示Nup96可能是煙草開花時(shí)間調(diào)控的抑制因子，其受低溫誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)可能與NC82低溫敏感，易早花特性相關(guān)。

煙草；Nup96；基因克隆；表達(dá)分析

煙草是一種喜溫的葉用經(jīng)濟(jì)作物，在煙葉生產(chǎn)過程中時(shí)常發(fā)生早花現(xiàn)象，煙草早花會(huì)造成煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)的嚴(yán)重下降。低溫是導(dǎo)致煙草早花的主要原因之一，早花發(fā)生規(guī)律研究結(jié)果說法不一，其確切的分子機(jī)制尚不明了[1]。

近些年，隨著擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）等模式植物全基因組序列測(cè)定完成，植物成花誘導(dǎo)分子機(jī)制研究也取得了一定進(jìn)展[2]。植物成花過程受溫度、光和激素等許多因素影響，已明確高等植物的7條成花誘導(dǎo)途徑，即春化途徑、溫敏途徑、光周期途徑、赤霉素（gibberellin，GA）途徑、自主途徑、成花抑制途徑和年齡途徑[2]。擬南芥核膜孔蛋白Nup96，又稱為SUA41/MOS3/SAR3[3]，通過調(diào)節(jié)mRNA等物質(zhì)的核輸出，參與擬南芥的基本防御和組成型抗性反應(yīng)[4]，并且在植物激素信號(hào)傳導(dǎo)和植物發(fā)育中發(fā)揮重要作用[5-6]，突變體具有顯著早花表型[7]。2013年，黃國文等[8]研究表明，Nup96作為開花抑制因子，參與調(diào)節(jié)擬南芥開花關(guān)鍵基因的表達(dá)，在開花自主途徑和溫敏途徑中起作用，并且在溫敏途徑的功能更明顯。目前，有關(guān)植物Nup96的研究?jī)H在擬南芥中有相關(guān)報(bào)導(dǎo)，其它植物中尚未見研究報(bào)道。本研究克隆了煙草的兩個(gè)Nup96基因NtNup96a和NtNup96b，并分析了兩個(gè)基因在低溫處理?xiàng)l件下的表達(dá)，為進(jìn)一步研究它們?cè)跓煵莸蜏卦缁òl(fā)生過程中的分子調(diào)控機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以對(duì)低溫敏感的煙草品種NC82（Nicotiana tabacumL. cv. NC82）為材料，采用漂浮育苗，煙苗3～4片真葉時(shí)移栽至花盆中培養(yǎng)。煙株生根期和旺長(zhǎng)期分別采集煙株根、莖、葉，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆?。?duì)于低溫處理實(shí)驗(yàn)的幼苗，待8片真葉期選取6株生長(zhǎng)一致的煙苗移入智能人工氣候箱中（光周期12 h/12 h，濕度60%），其中3株進(jìn)行12℃低溫處理10d，另外3株不做低溫處理，分別采集低溫處理和未低溫處理煙苗葉片，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和cDNA合成

采用Invitrogen公司的Trizol試劑盒提取總RNA。cDNA第一鏈的合成按照TaKaRa公司的PrimeScriptTMⅡ 1 st strand cDNA Synthesis Kit說明書進(jìn)行操作。

1.2.2 Nup96全長(zhǎng)cDNA的克隆

以擬南芥Nup96蛋白氨基酸序列（登陸號(hào)：NP_178183）為探針，在煙草EST數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源搜尋，發(fā)現(xiàn)與之相似的煙草EST，經(jīng)拼接獲得重疊群。依據(jù)上述信息設(shè)計(jì)基因3′和5′ RACE反應(yīng)的特異性引物（表1）。 采用SMARTTMRACE cDNA Ampli fi cation Kit（TaKaRa公司）擴(kuò)增基因的3′和5′末端。將3′和5′末端測(cè)序結(jié)果與EST重疊群序列進(jìn)行比對(duì)拼接，得到基因全長(zhǎng)cDNA序列信息，設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物（表1），以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3 Nup96基因組序列克隆

煙草基因組DNA采用CTAB法[9]提取。利用全長(zhǎng)引物對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆和測(cè)序。

表1 引物序列和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度Tab.1 Sequence of primers and preproduction length

1.2.4 生物信息學(xué)分析

在http://www.ncbi.nlm.nih.gov上利用BLAST工具和ORF Finder工具對(duì)全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行序列比對(duì)和開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）預(yù)測(cè)；采用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)和基因結(jié)構(gòu)分析，并利用ClustalX 2.0及MEGA4.0軟件包的Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5 熒光定量PCR

根據(jù)NtNup96a和NtNup96b的cDNA序列設(shè)計(jì)PCR引 物N1-rF和N1-rR、N2-rF和N2-rR， 以 煙草β-actin作為內(nèi)參基因[10]，PCR引物Actin-rF和Aactin-rR序列見表1。按照TaKaRa公司Taqman探針試劑盒說明書，利用ABI Stepone Plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，分析NtNup96a和NtNup96b在煙草不同時(shí)期、不同組織及低溫處理?xiàng)l件下的表達(dá)。

2 結(jié)果與分析

2.1 NtNup96a和NtNup96b全長(zhǎng)cDNA克隆及分析

以NP_178183為探針序列，在煙草EST庫中進(jìn)行電子延伸，得到2個(gè)基因重疊群。通過3′和5′RACE，獲得2個(gè)基因3′和5′末端序列（圖1擴(kuò)增條帶6和5）。通過測(cè)序拼接，RT-PCR擴(kuò)增獲得2個(gè)基因全長(zhǎng)cDNA序列（圖1擴(kuò)增條帶3和7），分別命名為NtNup96a和NtNup96b，GenBank注冊(cè)號(hào)為KU558693和 KU558694。NtNup96a基 因 cDNA全長(zhǎng)3635 bp（不包含多聚腺苷酸尾），編碼區(qū)長(zhǎng)3114 bp，編碼1037個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量約為117.732 kDa，等電點(diǎn)為4.99；NtNup96b基因cDNA全長(zhǎng)3545 bp，編碼區(qū)長(zhǎng)3114 bp，編碼1037個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量約為117.590 kDa，等電點(diǎn)為4.88（圖2）。

圖1 煙草NtNup96a/b基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR ampli fi cation results of NtNup96a/b from Nicotiana tabacum

圖2 煙草中NtNup96a和NtNup96b氨基酸序列比較Fig. 2 Amino acid sequence alignment of the NtNup96a/b proteins

同源性分析表明，煙草NtNup96a和NtNup96b2個(gè)基因之間的氨基酸序列一致性為97%，它們與已報(bào)道的擬南芥AtNup96基因（NP_178183）的氨基酸序列一致性為60%。與其它植物同類基因的氨基酸序列一致，除具有典型的Nup96結(jié)構(gòu)域之外，在其N端還有一個(gè)脊椎動(dòng)物Nup98蛋白特有的“自酶解結(jié)構(gòu)域”（Autoproteolytic domain，APD），見圖2。

系統(tǒng)發(fā)生樹分析表明（圖3），同科植物在進(jìn)化樹上基本處于同一分支。NtNup96a與絨毛狀煙草的親緣關(guān)系最近，NtNup96b與林煙草的親緣關(guān)系最近，絨毛狀煙草和林煙草是栽培煙草的兩個(gè)祖先種，推測(cè)NtNup96a源于絨毛狀煙草基因組，NtNup96b源于林煙草基因組，絨毛狀煙草和林煙草雜交加倍的過程中各貢獻(xiàn)了1個(gè)Nup96基因同源拷貝，栽培煙草基因組中有兩個(gè)拷貝發(fā)揮著生物學(xué)功能。

圖3 植物 Nup96蛋白的聚類及基因結(jié)構(gòu)比較Fig. 3 Phylogenetic structure of Nup96 protein in plants

2.2 NtNup96a和NtNup96b基因組序列分析

采用NtNup96a和NtNup96b的全長(zhǎng)擴(kuò)增引物從煙草基因組中克隆到了NtNup96a和NtNup96b對(duì)應(yīng)的基因組序列，并將序列提交到NCBI，獲得GenBank登陸號(hào)分別為KU558695和KU558696。NtNup96a和NtNup96bDNA全長(zhǎng)分別為5593 bp和5546 bp。將DNA序列與基因cDNA序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，NtNup96a含有5個(gè)內(nèi)含子，NtNup96b含有4個(gè)內(nèi)含子，這些內(nèi)含子均符合標(biāo)準(zhǔn)的GT-AG剪切規(guī)則。由圖3可知，Nup96基因在高等植物中具有相似的結(jié)構(gòu)特征，在編碼區(qū)外顯子基本一致，內(nèi)含子的相對(duì)位置也是保守的，只是長(zhǎng)度有所變化，推測(cè)可能是由于內(nèi)含子在進(jìn)化上高度活躍所致。

2.3 NtNup96a和NtNup96b基因的時(shí)空表達(dá)模式分析

通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)NtNup96a和NtNup96b基因的時(shí)空表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)2個(gè)基因在不同發(fā)育時(shí)期的煙草根、莖、葉等器官中都有表達(dá)，其中葉片的表達(dá)量略低，且表達(dá)量在葉片生長(zhǎng)過程的變化幅度較大（圖4）。

圖4 熒光定量PCR分析NtNup96a和NtNup96b基因時(shí)空表達(dá)特性Fig. 4 Temporal-spatial expression analysis of NtNup96a and NtNup96b by real-time PCR

與對(duì)照相比，12℃低溫處理10 d的煙草葉片2個(gè)基因的表達(dá)量明顯下調(diào)（圖5），下調(diào)倍數(shù)分別為5.43和3.64，說明NtNup96a和NtNup96b基因可能參與了煙草幼苗低溫脅迫應(yīng)答反應(yīng)。

圖5 低溫處理對(duì)NtNup96a和NtNup96b基因表達(dá)水平的影響Fig. 5 Effect of low temperature on expression of NtNup96a and NtNup96b

3 結(jié)論與討論

通過RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)，克隆了2個(gè)煙草Nup96基因的全長(zhǎng)cDNA，根據(jù)核苷酸序列推導(dǎo)出的氨基酸序列與已報(bào)到的擬南芥Nup96基因的氨基酸序列一致性為60%?；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明，NtNup96a和NtNup96b基因在編碼區(qū)由1大4小的5個(gè)外顯子組成，其編碼的氨基酸序列具有植物Nup96典型的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，如Nup96結(jié)構(gòu)域、N端保守的APD結(jié)構(gòu)域及其C末端保守的酶切位點(diǎn)氨基酸殘基。因此推測(cè)2個(gè)基因編碼的蛋白屬于Nup96蛋白家族成員。

溫度是影響植物開花的重要環(huán)境因素，對(duì)于外界溫度的誘導(dǎo)，植物不同物種的開花時(shí)間表現(xiàn)不同，體現(xiàn)了不同植物對(duì)自然環(huán)境的特殊適應(yīng)性，例如將模式植物擬南芥的生長(zhǎng)溫度從16 ℃提高到23 ℃，會(huì)誘導(dǎo)其早開花，這種高溫誘導(dǎo)開花與其成花素基因FT的表達(dá)上調(diào)一致[11-13]。與這種現(xiàn)象相反，高溫抑制菊花（Chrysanthemummorifolium）開花，當(dāng)夏季平均溫度大于20 ℃時(shí)會(huì)導(dǎo)致菊花晚開花，這種晚開花的現(xiàn)象和菊花在高溫度條件下FT同源基因的表達(dá)削弱有直接的關(guān)系[14-15]?？梢钥闯?，溫度對(duì)擬南芥和菊花開花時(shí)間的作用效果相反，F(xiàn)T基因作為開花促進(jìn)因子在兩種植物中受高溫誘導(dǎo)表現(xiàn)出相反的表達(dá)趨勢(shì)。黃國文等[7]研究表明，與22 ℃相比，16 ℃低溫顯著誘導(dǎo)擬南芥Nup96基因的上調(diào)表達(dá)，確定Nup96是擬南芥開花時(shí)間調(diào)控中的抑制因子，抑制擬南芥開花。就煙草而言，低溫誘導(dǎo)煙草早花，本研究根據(jù)以往研究結(jié)果[16-18]，選擇12 ℃ 10 d低溫處理8葉期的NC82煙苗，采用定量PCR方法分析溫度對(duì)煙草Nup96基因表達(dá)水平的影響，結(jié)果顯示12 ℃低溫處理顯著誘導(dǎo)煙草Nup96基因的下調(diào)表達(dá)，表現(xiàn)出與擬南芥完全相反的變化趨勢(shì)。鑒于溫度對(duì)擬南芥和煙草開花時(shí)間的作用效果相反，推測(cè)Nup96是煙草開花時(shí)間調(diào)控的抑制因子，其受低溫誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)可能與NC82低溫敏感，易早花特性相關(guān)。

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Molecular cloning and expression analysis of twoNup96genes inNicotiana tabacumL.

LIN Shifeng, WANG Rengang, SHI Yuewei, ZHANG Xiaolian, ZOU Jie, REN Xueliang, YU Jing
Guizhou Academy of Tobacco Science, Key Laboratory of Molecular Genetics, China National Tobacco Corporation,Guiyang 550081, China

Two full-length cDNAs encoding di ff erent Nup96s were cloned fromNicotiana tabacumL. cv. NC82 by RT-PCR and SMART RACE technology, and were designated asNtNup96a(GenBank accession Number KU558693) andNtNup96b(GenBank accession Number KU558694), respectively. Sequencing analysis indicated that they were 97% identical to each other at the amino acid sequence level and shared 60% identity withArabidopsis thalianaNup96 (NP_178183), respectively. The predicted proteins of them shared typical characteristic of Nup96 in plants, containing a conserved Nup96 domain and a conserved autoproteolytic domain. Expression analysis showed thatNtNup96aandNtNup96b were detected in all tissues, and their expressions were the lowest in leaves and decreased with the increase of plant age. After cold treatment at 12 ℃ for 10d, the expression of both genes declined signi fi cantly in leaves, which suggested thatNtNup96aandNtNup96bmight be inhibitory factors in the regulation of fl owering time in tobacco and were involved in low temperature response and early fl owering of cold-sensitive tobacco NC82.

Nicotiana tabacumL.; Nup96; gene cloning; expression analysis

林世鋒，王仁剛，史躍偉，等. 兩個(gè)煙草Nup96基因的分子克隆及其表達(dá)分析[J]. 中國煙草學(xué)報(bào)，2016, 22（4）

中國煙草總公司重點(diǎn)項(xiàng)目（110201302004）；中國煙草總公司貴州省公司科技項(xiàng)目（2011-3047）；煙草行業(yè)分子遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)課題（110201403018）

林世鋒（1978—），博士，副研究員，主要研究方向?yàn)闊煵葸z傳育種與分子生物學(xué)，Tel：0851-84116968，Email：linshifeng1978@163.com

余婧（1983—），碩士，助理研究員，主要研究方向?yàn)闊煵莘肿由飳W(xué)，Tel：0851-84116968，Email：yujingbio@126.com

2016-03-22

：LIN Shifeng, WANG Rengang, SHI Yuewei, et al. Molecular cloning and expression analysis of twoNup96genes inNicotiana tabacumL. [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016,22(4)