TSC1在肝纖維化中的表達(dá)及基因甲基化

陳 晨，黃 成，孟曉明，李 俊

TSC1在肝纖維化中的表達(dá)及基因甲基化

陳 晨1，2，黃 成1，2，孟曉明1，2，李 俊1，2

目的 通過檢測在大鼠肝纖維化模型及轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）刺激的大鼠肝星形細(xì)胞（HSC）T6中結(jié)節(jié)性硬化癥（TSC）相關(guān)蛋白錯(cuò)構(gòu)素（hamartin）的表達(dá)，并檢測HSC T6細(xì)胞TSC1基因啟動子甲基化狀態(tài)，探討肝纖維化疾病治療的新靶點(diǎn)。方法 構(gòu)建大鼠肝纖維化模型，培養(yǎng)HSC T6細(xì)胞。利用Western blot法檢測hamartin蛋白表達(dá)，利用焦磷酸測序檢測TSC1啟動子甲基化。結(jié)果 與正常對照組比較，肝纖維化模型組TSC1蛋白表達(dá)量較?。≒＜0.01），且TSC1基因啟動子甲基化程度較高。結(jié)論 TSC1可能與肝纖維化形成有一定關(guān)聯(lián)。

TSC1；肝纖維化；甲基化

肝纖維化是許多慢性肝病發(fā)展到肝硬化的中間過渡階段，其中有25%～40%最終發(fā)展成為肝硬化，更嚴(yán)重的發(fā)展為肝癌。肝臟的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的合成和降解不平衡，而導(dǎo)致纖維結(jié)締組織的過度沉積，是肝纖維化的主要病理表現(xiàn)［1］。HSCs的激活與增殖是肝纖維化發(fā)生發(fā)展其中的中心環(huán)節(jié)［2］。肝纖維化的形成是受各類因素網(wǎng)路調(diào)控的，目前的研究［1］表明其涉及多種相關(guān)細(xì)胞因子以及諸多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。結(jié)節(jié)硬化癥（tuberous sclerosis complex，TSC）是一種罕見的常染色體顯性遺傳病，其發(fā)病機(jī)制是由于TSC1和TSC2基因中任何一個(gè)發(fā)生變異。TSC1基因定位9q34，TSC2基因定位于16p13.3，TSC1和TSC2編碼的基因產(chǎn)物分別為錯(cuò)構(gòu)素（hamartin）和結(jié)節(jié)素（tuberin），蛋白分子量大小為130 ku與200 ku［3-4］。研究［5］顯示TSC1在腎纖維化模型中低表達(dá)，并且敲除TSC1基因的轉(zhuǎn)基因小鼠可以顯示出腎間質(zhì)纖維細(xì)胞的激活以及腎纖維化。該研究旨在探討TSC1是否在肝纖維化中有表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 HSC T6細(xì)胞株來自安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院。ECL發(fā)光試劑盒購自美國Thermo公司；TSC1、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和膠原蛋白Ⅰ型（Collagen typeⅠ，ColⅠ）抗體均購自美國Santa Cruz公司；DNA抽提Kit、Eppendorf管、PCR管、移液器吸頭購自美國Axygen公司；亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒購自德國QIAGEN公司；TSC1引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司提供；雙蒸水、TBE購自上海希匹吉生物技術(shù)有限公司。

1.2 動物及模型制備 清潔級SD大鼠50只，雌雄不限，180～220 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。將大鼠隨機(jī)分為正常對照組、肝纖維化模型組，每組10只。模型組的大鼠皮下注射以橄欖油稀釋的10%CCl4（0.5 mg/kg），每周2次，正常對照組的大鼠則注射同等體積的橄欖油溶媒；將肝纖維化模型組的大鼠于第12周末處死，正常對照組的大鼠在20周末處死，迅速取出肝組織，從肝右葉中部切取肝組織兩塊，分別置于10%甲醛中固定、采用石蠟包埋并提取肝臟總蛋白。

1.3 Western blot法檢測大鼠肝組織蛋白 取各組100 mg大鼠肝臟組織，將其剪成細(xì)小的碎片，置于勻漿器中加入裂解液，研磨至肝臟組織消失。12 000 r/min離心5 min，取上清液，測定蛋白濃度。取各組蛋白提取液，并加入等體積的上樣緩沖液，混合，于100℃沸水煮沸5 min，使蛋白變性。提取各組細(xì)胞總蛋白，棄掉舊培養(yǎng)液，使用PBS清洗待處理細(xì)胞2遍，每孔加RIPA裂解液200 μl（含2 μl蛋白酶抑制劑1 mmol/L PMSF），放置在冰上裂解30 min，并收集細(xì)胞裂解懸液，于12 000 r/min冷凍離心機(jī)離心30 min后收集上清液。采用BCA法定量，取20 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE垂直電泳，分離蛋白質(zhì)，并將樣品蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。使用5%脫脂奶粉室溫封閉3 h。TBST洗膜3次，每次10 min，分別使用β-actin、TSC1、α-SMA和ColⅠ抗體4℃孵育過夜（稀釋濃度為1∶1 000），再用TBST洗膜3次，每次約10 min，對應(yīng)加入二抗山羊抗鼠和抗兔（稀釋比均為1：10 000）室溫孵育1 h，TBST洗膜3遍后，最后加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影。

1.4 焦磷酸測序 按照Axygen DNA抽提Kit說明提取基因組DNA，并對基因組DNA進(jìn)行亞硫酸鹽修飾。PCR反應(yīng)體系［50 μl：H2O 8.5 μl、KAPA 2G Robust HS ReadyMix 12.5 μl、up-Primer（50 pmol/μl）1 μl、down-Primer（50 pmol/μl）1 μl、Template（DNA）2 μl］。引物設(shè)計(jì)TSC1上游引物：5′-GGGATTGTGAGGTAAATAGTTGAG-3′；TSC1下游引物：5′-CCCTACCAAACAAATAAATCTCTT-3′；TSC1測序引物：5′-GGGTTTTTTGGGGTAG-3′，另PCR長度為161 bp。PCR擴(kuò)增后，使用QIAGEN PyroMark Q96 ID焦磷酸測序儀進(jìn)行測序。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)均以±s表示；兩兩比較采用t檢驗(yàn)，采用Pearson法進(jìn)行相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝臟組織的TSC1蛋白表達(dá) 使用Western blot法檢測正常對照組及肝纖維化模型組的大鼠肝臟組織的蛋白表達(dá)量。與正常對照組的大鼠肝組織比較，肝纖維化模型組的α-SMA和ColⅠ蛋白表達(dá)量明顯升高（t=7.283、9.118，P＜0.01），而TSC1蛋白的表達(dá)量明顯減?。╰=15.35，P＜0.05）。見圖1。

2.2 HSC T6的TSC1蛋白表達(dá) 采用Western blot法檢測正常對照組及TGF-β1刺激組的α-SMA、ColⅠ和TSC1。與正常對照組比較，TGF-β1刺激組α-SMA、ColⅠ表達(dá)上升（t=12.60、16.49，P＜0.01），TSC1表達(dá)減少（t=4.256，P＜0.01）。見圖2。

圖1 Western blot法檢測大鼠肝臟組織的蛋白表達(dá)

2.3 TSC1啟動子甲基化焦磷酸測序 提取HSC T6細(xì)胞的基因組DNA，采用焦磷酸測序，結(jié)果見圖3。可以看到測序峰清晰。正常對照組及TGF-β1刺激組均檢測了同樣的3個(gè)位點(diǎn)。正常對照組3個(gè)位點(diǎn)Pos.1、Pos.2、Pos.3的TSC1啟動子甲基化程度分別為18.13%、16.84%、9.49%。TGF-β1刺激組3個(gè)位點(diǎn)的TSC1啟動子甲基化程度分別為10.73%、32.16%、0。參照文獻(xiàn)［6］，將甲基化程度在20%以下視為無甲基化，而20%～50%可視為低甲基化，50%以上視為高甲基化。正常對照組的Pos.1、Pos.2、Pos.3的甲基化程度均低于20%，可視為無甲基化。而TGF-β1刺激組的Pos.2甲基化程度為32.16%，高于20%，可視為低甲基化。說明TGF-β1刺激組的TSC1啟動子甲基化程度高于正常對照組。

圖3 HSC T6細(xì)胞TSC1啟動子甲基化焦磷酸測序

3 討論

肝纖維化被認(rèn)為是由多種因素如肝炎病毒、酒精、血吸蟲病、毒物等長期持續(xù)損害肝臟導(dǎo)致的慢性炎癥反應(yīng)［2］。多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與細(xì)胞因子構(gòu)成了調(diào)控肝纖維化的網(wǎng)絡(luò)。研究探索與肝纖維化形成，進(jìn)展有關(guān)的新機(jī)制也是當(dāng)下的熱點(diǎn)。

抑癌基因TSC1與TSC2分別編碼錯(cuò)構(gòu)素和結(jié)節(jié)素［3］。在人體大部分器官組織中，錯(cuò)構(gòu)素和結(jié)節(jié)素可共表達(dá)；兩者在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成異二聚體而發(fā)揮作用，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長與增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)吞作用、調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附作用、參與TGF-β/ Smad通路等［7］。肺淋巴管平滑肌瘤病、口腔鱗癌、子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌等各種腫瘤組織中的TSC1、TSC2蛋白表達(dá)低或缺失［8］。TSC1-TSC2腫瘤抑制因子位于mTOR信號通路的上游，可負(fù)調(diào)控mTOR。mTOR/p70S6K信號通路參與調(diào)節(jié)膠原蛋白的表達(dá)、細(xì)胞周期的控制、肝星狀細(xì)胞的激活與增殖，進(jìn)而對肝纖維化起著至關(guān)重要的作用。Patsenker et al［9］以及Yu et al［10］發(fā)現(xiàn)，抑制mTOR可以明顯減少纖維化進(jìn)程。TSC1在腎纖維化模型中低表達(dá)，并且敲除TSC1基因的轉(zhuǎn)基因小鼠可以顯示出腎間質(zhì)纖維細(xì)胞的激活以及腎纖維化［5］。本研究在肝纖維化模型中檢測了TSC1蛋白的表達(dá)，表明TSC1蛋白在肝纖維化模型中與正常對照組比較表達(dá)較低；并在HSC T6細(xì)胞中進(jìn)行檢測，由TGF-β1刺激的HSC T6細(xì)胞表達(dá)TSC1比正常對照組低。提示TSC1的表達(dá)可能與肝纖維化有一定關(guān)聯(lián)。

蛋白質(zhì)的表達(dá)受多個(gè)環(huán)節(jié)影響，如DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、翻譯后修飾等，任何環(huán)節(jié)的一絲差錯(cuò)都會最終影響蛋白質(zhì)的表達(dá)。針對TSC1蛋白在腫瘤組織中低表達(dá)的現(xiàn)象，研究［3］表明TSC1基因突變及雜合性缺失都可影響其蛋白質(zhì)表達(dá)。至今大約有超過400篇關(guān)于TSC的基因突變、基因缺失等報(bào)道，研究［11］顯示人乳腺癌中TSC1蛋白表達(dá)低于正常組織，并且TSC1基因啟動子的甲基化程度高于正常組織。DNA甲基化屬于表觀遺傳學(xué)，是基因表型改變形式之一。正常的甲基化在維持細(xì)胞及機(jī)體的正常功能中有著十分重要的作用，但是異常的甲基化則會參與引發(fā)多種疾病，如各種腫瘤，自身免疫疾病等等。本研究檢測了TSC1基因在HSC T6細(xì)胞中的甲基化程度，顯示由TGF-β1刺激的HSC T6細(xì)胞的TSC1基因某位點(diǎn)甲基化程度為32.16%，高于20%，可視為低甲基化。而檢測的正常對照組各位點(diǎn)的甲基化程度均低于20%，可視為無甲基化。這有可能是肝纖維化模型組及TGF-β1刺激的HSC T6細(xì)胞表達(dá)TSC1蛋白低的原因。雖然這可能不是TSC1蛋白表達(dá)低的唯一原因，但是肯定也是有著十分緊密的關(guān)聯(lián)。

本研究表明肝纖維化中TSC1蛋白表達(dá)比正常對照組低，并且檢測到由TGF-β1刺激的HSC T6細(xì)胞表達(dá)TSC1比正常對照組低。并采用焦磷酸測序?qū)嶒?yàn)揭示了TSC1基因啟動子甲基化有可能是這一現(xiàn)象出現(xiàn)的原因。有關(guān)TSC1基因啟動子甲基化的具體機(jī)制和具體作用，目前還沒有相關(guān)報(bào)道，有待進(jìn)一步的研究。本研究為肝纖維化的形成提供了新的可能機(jī)制，并為治療肝纖維化提供了新的作用靶點(diǎn)。

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The expression and the DNA methylation of TSC1 in liver fibrosis

Chen Chen1，2，Huang Cheng1，2，Meng Xiaoming1，2，et al
（1School of Pharmacy，Anhui Medical University，
2Institute for Liver Disease of Anhui Medical University，Hefei 230032）

Objective To explore the expression and the promoter methylation status of the TSC1 in HSC T6 differentiation induced by transforming growth factor β1（TGF-β1）in vitro，and the expression of the TSC1 in CCl4-induced liver fibrosis in rat.Methods Western blot was used to detect the expression of the TSC1.Pyrosequencing was used to test the methylation status of the TSC1 promoter.Results The expression of TSC1was significantly reduced in response to TGF-β1 and CCl4（P＜0.01），and the TGF-β1 treated group TSC1 promoter was found to be higher methylated than the control group.Conclusion A novel evidence has been provided that TSC1，which may be affected by DNA methylation in TGF-β1 treated HSC T6，may play a vital role in liver fibrosis.

TSC1；liver fibrosis；methylation

R 34

A

1000-1492（2016）08-1132-04

時(shí)間：2016-6-22 14：44：58

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160622.1444.026.html

2016-04-14 接收

國家自然科學(xué)基金（編號：81273526、81473268）；安徽省科技攻關(guān)項(xiàng)目（編號：1301042212）

1安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，2安徽醫(yī)科大學(xué)肝病研究所，合肥230032

陳 晨，女，碩士研究生；

李 俊，男，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：lj@ahmu.edu.cn