檸檬醛調(diào)控突變型p53基因和AIF基因表達(dá)誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株NB4凋亡

王亞萍，王 娟，吳中惠，張 慧，侯小芳，宋 琴，夏海龍

檸檬醛調(diào)控突變型p53基因和AIF基因表達(dá)誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株NB4凋亡

王亞萍1，王 娟1，吳中惠1，張 慧1，侯小芳1，宋 琴2，夏海龍1

目的 探討檸檬醛誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株NB4凋亡的分子機(jī)制。方法 用不同濃度的檸檬醛處理NB4細(xì)胞48 h，通過實時熒光定量PCR（qPCR）法檢測突變型p53（mtp53）基因和凋亡誘導(dǎo)因子AIF基因的mRNA表達(dá)變化。結(jié)果 檸檬醛實驗組與空白對照組比較，mtp53基因表達(dá)量減低（P＜0.05）；檸檬醛實驗組與空白對照組比較，AIF基因表達(dá)量增加（P＜0.05）；乙醇對照組與空白對照組比較，mtp53和AIF的mRNA表達(dá)量無明顯差異；隨著檸檬醛濃度（5、10、20 mg/L）的遞增，mtp53 mRNA表達(dá)量逐漸下降，AIF mRNA的表達(dá)量逐漸上升，mtp53、AIF在不同濃度檸檬醛實驗組表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論

檸檬醛；白血??；急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株；p53；凋亡誘導(dǎo)因子

山蒼子油的主要成分檸檬醛，不僅可作為香料和食品添加劑，還有抗菌、抑菌、平喘等多種作用。研究［1-3］表明檸檬醛可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞如A549、RAW264.7、HL-60、U937、MCF-7等的凋亡，且對人正常胸腺細(xì)胞和脾細(xì)胞無毒性作用。研究［4-5］表明檸檬醛可以通過激活內(nèi)源性線粒體途徑，抑制核因子NF-κB的表達(dá)，誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞白血?。╝cutepromyelocyticleukemia，APL）細(xì)胞株NB4的凋亡，但具體機(jī)制尚不明確。該研究旨在通過研究檸檬醛誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡過程中突變型p53（mtp53）基因、凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis inducing factor，AIF）基因表達(dá)的變化，進(jìn)一步探討檸檬醛誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡的可能分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑 胎牛血清、RPMI 1640購自美國Gibco公司；檸檬醛購自美國Sigma公司，純度＞95%，用乙醇溶解備用；TRIzol、SuperScriptⅢRT反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen公司；引物由北京百奧思科生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司合成。目的基因及內(nèi)參基因引物序列和產(chǎn)物長度見表1。所測引物用Primer-BLAST軟件驗證，p53 Tm 58.8℃，AIF Tm 58.0℃。

表1 實時熒光定量PCR的引物序列以及產(chǎn)物長度

1.2 細(xì)胞來源與培養(yǎng) APL細(xì)胞株NB4細(xì)胞由天津血研所惠贈，該細(xì)胞株p53基因是突變型。NB4細(xì)胞于5%CO2、37℃、飽和濕度條件下，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，2～3 d換液1次。實驗所用細(xì)胞處于對數(shù)生長期，臺盼藍(lán)染色拒染率＞95%，維持細(xì)胞濃度在（2～3）×105/ml。

1.3 實驗分組 分為檸檬醛實驗組和對照組。檸檬醛實驗組：選取處于對數(shù)生長期的NB4細(xì)胞，分別加入不同濃度的檸檬醛（5、10、20 mg/L，培養(yǎng)基乙醇終濃度5‰）培養(yǎng)?？瞻讓φ战M：培養(yǎng)基中不加檸檬醛和5‰乙醇進(jìn)行NB4細(xì)胞培養(yǎng)；乙醇對照組：培養(yǎng)基中不加檸檬醛，僅加乙醇至終濃度5‰進(jìn)行NB4細(xì)胞培養(yǎng)。

1.4 采用qPCR法檢測mtp53及AIF的表達(dá) 收集檸檬醛處理48 h后的細(xì)胞，用RNA提取試劑盒提取總RNA，再用反轉(zhuǎn)錄試劑盒superscriptⅢ進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系為dNTP 1 μl、DTT 2 μl、5× Buffer 4 μl、RT酶1 μl、RNA 200 ng，補水至10 μl，1 000 r/min離心5 min后，置于42℃水浴箱水浴60 min，85℃孵育10 min。反應(yīng)結(jié)束后置于-20℃保

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示。單變量兩獨立樣本的比較采用t檢驗，多組樣本間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞生長計數(shù) 空白對照組NB4細(xì)胞培養(yǎng)呈對數(shù)生長狀態(tài)時，調(diào)整細(xì)胞濃度均為（2～3）×105/ ml。檸檬醛實驗組分別加入不同濃度的檸檬醛（5、10、20 mg/L，培養(yǎng)基乙醇終濃度5‰），乙醇對照組加入乙醇至終濃度5‰，與空白對照組同時進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)12、24、36、48 h時進(jìn)行臺盼藍(lán)染色，計數(shù)活細(xì)胞數(shù)。乙醇對照組與空白對照組比較細(xì)胞計數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義；各實驗組與空白對照組比較，細(xì)胞計數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F= 21.000，P＜0.05）；不同濃度實驗組比較細(xì)胞計數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=23.134，P＜0.05）。NB4細(xì)胞生長計數(shù)曲線見圖1。

圖1 細(xì)胞生長計數(shù)曲線

2.2 PCR產(chǎn)物的分析 擴(kuò)增曲線及熔解曲線顯示，p53、AIF和內(nèi)參基因GAPDH的PCR產(chǎn)物呈單峰。熔解溫度均一，曲線中沒有其他雜峰，擴(kuò)增產(chǎn)物具有特異性。見圖2、3。

圖2 不同基因的擴(kuò)增曲線

圖3 不同基因的熔解曲線

2.3 突變型p53（mtp53）mRNA的表達(dá)量檢測

乙醇對照組和空白對照組比較，mtp53 mRNA的表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義；實驗組與空白對照組比較，mtp53 mRNA的表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F= 53.46，P＜0.05）；各實驗組間隨檸檬醛濃度遞增，mtp53 mRNA的表達(dá)量遞減，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F =71.03，P＜0.05）。見表2、圖4。

表2 不同濃度檸檬醛作用于NB4細(xì)胞48 h后mtp53 mRNA表達(dá)量的變化（n=3）

圖4 檸檬醛對mtp53基因mRNA表達(dá)量的影響

A：空白對照組；B：乙醇對照組；C：5 mg/L實驗組；D：10 mg/L實驗組；E：20 mg/L實驗組；與空白對照組比較：*P＜0.05；與5 mg/ L實驗組比較：#P＜0.05；與10 mg/L實驗組比較：△P＜0.05

2.4 AIF mRNA的表達(dá)量檢測 乙醇對照組與空白對照組比較，AIF mRNA的表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義；各實驗組與空白對照組比較，AIF mRNA的表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=50.04，P＜0.05）；各實驗組間隨檸檬醛濃度遞增，AIF mRNA的表達(dá)量遞增，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=73.82，P＜0.05）。見表3、圖5。

表3 不同濃度檸檬醛作用于NB4細(xì)胞48 h后AIF mRNA表達(dá)量的變化（n=3）

圖5 檸檬醛對AIF基因mRNA表達(dá)量的影響

3 討論

APL作為急性髓系白血病的的一種特殊亞型，是高度異質(zhì)性的血液系統(tǒng)惡性腫瘤。APL有特異性的基因異位t（15；17），形成PML-RARα融合基因［6］。維甲酸和三氧化二砷分別通過不同的途徑誘導(dǎo)APL細(xì)胞凋亡，使得APL患者達(dá)到緩解。維甲酸和亞砷酸治療APL取得了巨大成就，但在治療過程中出現(xiàn)一定的不良反應(yīng)，部分病例對維甲酸、三氧化二砷耐藥［7］，研發(fā)新的治療藥物成為進(jìn)一步提升APL治療效果的重要問題。

研究［8］表明檸檬醛能夠誘導(dǎo)APL細(xì)胞株NB4出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的典型形態(tài)學(xué)改變，這種誘導(dǎo)作用在檸檬醛作用48 h時最強。研究［9］表明檸檬醛作用于NB4細(xì)胞后，凋亡相關(guān)基因Bcl-2的表達(dá)量明顯下降，BAX基因、Caspase蛋白的表達(dá)量明顯增加，這些結(jié)果表明檸檬醛通過線粒體凋亡相關(guān)途徑誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡，但更為詳盡的分子信號機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

由于本實驗使用的檸檬醛難溶于水，需要用乙醇進(jìn)行溶解，設(shè)計了空白對照組和乙醇對照組，以觀察5‰乙醇對正常NB4細(xì)胞生長及突變型p53基因、AIF基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明，5‰乙醇對NB4細(xì)胞生長、突變型p53基因及AIF基因的表達(dá)無明顯影響。

本研究表明檸檬醛作用NB4細(xì)胞48 h，突變型p53基因mRNA表達(dá)量均降低。p53基因可以通過抑制有絲分裂的進(jìn)程，阻止細(xì)胞進(jìn)入DNA合成期，參與DNA損傷修復(fù)或者啟動細(xì)胞的凋亡，防止細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化；p53基因的突變會導(dǎo)致其正常生物學(xué)功能喪失，促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和增殖，抑制細(xì)胞凋亡。研究［10］表明惡性腫瘤中，p53基因的突變占50%，細(xì)胞系中血液系統(tǒng)腫瘤p53突變率最高，約占17%。本實驗細(xì)胞株具有典型t（15；17）異位，細(xì)胞株中的p53基因?qū)儆谕蛔冃停?1］。野生型p53基因作為BAX/BAK的上游調(diào)控基因，可以通過下調(diào)BCl-2的表達(dá)，改變BCL-2/BCl-xL比例，形成BAX蛋白的寡聚化，上調(diào)BAX的表達(dá)，改變線粒體通透性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［12-14］。突變型p53基因作用則與之相反，本研究顯示NB4細(xì)胞中突變型p53基因表達(dá)較高，隨著檸檬醛濃度的遞增，突變型p53基因的表達(dá)量呈下降的趨勢，提示檸檬醛可能通過下調(diào)突變型p53基因的表達(dá)，調(diào)控與之相關(guān)的下游調(diào)控因子，改變線粒體通透性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

AIF位于染色體Xq25-26，由16個外顯子組成，其編碼可以產(chǎn)生67 ku、62 ku、57 ku 3種亞型蛋白。正常情況下，AIF蛋白位于線粒體內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞中BAX增多時，BAX形成二聚體并轉(zhuǎn)移到線粒體膜上，線粒體膜的通透性功能發(fā)生改變，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，57 ku AIF蛋白可以從線粒體中釋放到細(xì)胞質(zhì)并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，降解DNA導(dǎo)致DNA片段化，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡［15］。本研究結(jié)果顯示，檸檬醛作用于NB4細(xì)胞48 h，AIF基因表達(dá)量明顯增加，NB4細(xì)胞產(chǎn)生過量的57 ku AIF蛋白，有可能通過線粒體途徑誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡。

綜上所述，檸檬醛可能通過線粒體途徑誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡。可能機(jī)制是：檸檬醛下調(diào)mtp53基因的表達(dá)，影響下游Bcl-2/BAX的比例，增加BAX的表達(dá)，從而改變線粒體膜的通透性，上調(diào)AIF等活性物質(zhì)的釋放。檸檬醛是否存在線粒體以外的凋亡通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，尚需進(jìn)一步研究。

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Mechanisms of apoptosis in NB4 cells induced by citral via regulation of mtp53 gene and AIF gene

Wang Yaping，Wang Juan，Wu Zhonghui，et al
（Dept of Hematology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

Objective To investigate the mechanism of the apoptosis induced by citral in the acute promyelocyticleukemia cell line NB4.Methods NB4 cells were treated with citral for 48 h at the various concentration，and then the mRNA expression of mutation p53（mtp53）and AIF was detected by method of qPCR.Results The expression of mtp53 gene decreased when the critral groups compared with the control group，the difference between them was statistically significant（P＜0.05）；the expression of AIF gene was increased when the critral group compared with the control group，the difference between them was statistically significant（P＜0.05）；ethanol group compared with the control group，mRNA expressions of mtp53 and AIF had no significant difference.With citral concentration（5，10，20 mg/L）increasing，the level of expression of mtp53 mRNA reduced，while the level of expression of AIF mRNA gradually increased，both mtp53 and AIF expression in different concentrations of citral group differences were statistically significant（P＜0.05）.Conclusion Citral can induce apoptosis in NB4 cells by downregulating the expression of mtp53 and upregulating the expression of AIF.

citral；leukemia；NB4；p53；apoptosis inducing factor

R 733.71；R 979.1

A

1000-1492（2016）08-1101-05

時間：2016-6-22 14：44：58

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160622.1444.012.html

2016-04-19 接收存待用。取2 μl逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA，進(jìn)行qPCR反應(yīng)。以管家基因GAPDH為內(nèi)參，每份樣本設(shè)3組平行對照。反應(yīng)體系為20 μl，條件：95℃、2 min，94℃、20 s，65℃、20 s，72℃、30 s，40個循環(huán)。所測基因的表達(dá)量RQ=2-ΔΔCt［ΔΔCt=（待測樣品的目的基因的Ct平均值-待測樣本的看家基因的Ct平均值）-（對照樣品的目的基因的Ct平均值-對照樣本的看家基因的Ct平均值）］，RQ值越大，基因的表達(dá)量越大。

安徽省自然科學(xué)基金（編號：1308085MH159）

1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，合肥 230022

2安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，合肥 230022

王亞萍，女，碩士研究生；

夏海龍，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者：E-mail：xhl1999cn@163.com

檸檬醛通過下調(diào)NB4細(xì)胞mtp53的表達(dá)，上調(diào)AIF的表達(dá)誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡。