刺參體內(nèi)RNA干擾方法的初步研究

張宇鵬+田燚+宸帆+海龍+亞青

摘 要：以刺參溶菌酶基因（lysozyme gene， LYZ）為靶基因探索構(gòu)建刺參體內(nèi)RNA干擾體系。構(gòu)建了3個刺參溶菌酶基因特異性的RNA干擾重組質(zhì)粒，以刺參體腔液原代培養(yǎng)細(xì)胞為靶細(xì)胞進行篩選；分別以口腔注射和腹腔注射的方式以及不同的注射劑量對刺參LYZ進行體內(nèi)RNA干擾，并運用qPCR技術(shù)測定刺參LYZ的表達(dá)量；最后，對刺參LYZ進行體內(nèi)RNA干擾，并分別運用qPCR技術(shù)和比濁法測定刺參LYZ的表達(dá)量及其酶活性。結(jié)果顯示：3種RNA干擾重組質(zhì)粒的沉默效率分別為40%、45%、0%；體腔注射RNA干擾重組質(zhì)粒時，各組織中LYZ的表達(dá)量均出現(xiàn)了顯著的上升（P<0.05），而從口腔注射時，體腔液和肌肉中LYZ的表達(dá)量均出現(xiàn)極為顯著的下降（P <0.01），而在管足中未出現(xiàn)明顯變化；當(dāng)其注射劑量為0.5 μg和5 μg時未對LYZ的表達(dá)產(chǎn)生有效的抑制作用；當(dāng)注射劑量為10 μg和25 μg時，刺參體內(nèi)LYZ的表達(dá)受到了明顯抑制，但是注射劑量為25 μg時，部分刺參個體出現(xiàn)吐腸現(xiàn)象；在轉(zhuǎn)染12 h后，刺參體腔液、肌肉、體壁、疣足和管足組織中LYZ的表達(dá)量開始下降，到第四天后開始回升。表明：只有從口腔注射RNA干擾重組質(zhì)粒且注射劑量達(dá)到10 μg時才能有效地抑制靶基因的表達(dá)；刺參體內(nèi)RNA干擾具有系統(tǒng)性，可以在各個組織間相互傳導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：刺參；溶菌酶基因；RNA干擾

中圖分類號：S917.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

RNA干擾（RNA interference）是指雙鏈RNA（dsRNA）在細(xì)胞內(nèi)特異性的誘導(dǎo)與之同源互補的mRNA的降解，從而使相應(yīng)基因的表達(dá)關(guān)閉，最終引發(fā)基因轉(zhuǎn)錄后水平沉默的現(xiàn)象（PTGS）[1-3]。到目前為止，RNA干擾是最準(zhǔn)確和有效的在“體外”和“體內(nèi)”條件下抑制特異基因表達(dá)的方法[4]?，F(xiàn)在，RNA干擾技術(shù)被越來越廣泛地應(yīng)用于水生動物基因組學(xué)的研究中。Genciana Terova等[5]利用dsRNA和shRNA抑制肌肉生長抑制素（MSTN）的表達(dá)，從而驗證該基因的功能。Liu等[6]使用dsRNA使QM表達(dá)沉默，表明QM對于凡納濱對蝦和太平洋白蝦的主動防御起到了正向調(diào)節(jié)作用。在進行體內(nèi)RNA干擾時，可以通過浸泡、飼喂和注射等方式將人工構(gòu)建的RNA干擾序列導(dǎo)入實驗動物體內(nèi)。Genciana Terova等[5]分別通過電脈沖和注射的方式成功地將dsRNA和shRNA導(dǎo)入海鱸體內(nèi)。Naoki等[7]的研究表明動物體內(nèi)RNA干擾存在劑量和時間依賴性的效應(yīng)。

刺參（Apostuchopus japonicas）具有較高的經(jīng)濟價值和藥用價值[8]，是目前中國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的主要養(yǎng)殖品種之一。但是，近年來刺參細(xì)菌性和病毒性病害屢屢大面積發(fā)生，給養(yǎng)殖業(yè)者帶來了巨大損失[9-10]。故提升刺參養(yǎng)殖業(yè)者的防病和治病能力顯得愈發(fā)迫切。溶菌酶是生物體內(nèi)極為重要的一種非特異性免疫因子，在機體免疫過程中不僅能催化水解細(xì)菌細(xì)胞壁而導(dǎo)致細(xì)菌溶解死亡[11-12]，還可誘導(dǎo)其他免疫因子。水生動物血清溶菌酶活力的高低是衡量機體免疫狀態(tài)的指標(biāo)之一。血清溶菌酶活力提高，其免疫能力也相應(yīng)提高[13]。Nermeen M Abu-Elala等[14]使用生物活性免疫增強劑-殼源殼聚糖刺激尼羅羅非魚（Oreochrmis niloticus），吞噬活性/指數(shù)、NBT、溶菌酶活性及ACH50等免疫參數(shù)均顯著上升，且對嗜水氣單胞菌的抗感染能力增強。Patrizia Pagliara等[15]使用高濃度鋅處理海膽（Paracentrotus lividus）后，溶菌酶活性等免疫指標(biāo)出現(xiàn)短暫下降，同時抗溶藻弧菌V. alginolyticus活性也相應(yīng)下降，表明海膽的免疫力下降。

本研究以刺參溶菌酶基因的cDNA序列為依據(jù)，設(shè)計用于RNA干擾的miRNA前體序列，分析不同注射方式和注射劑量條件下刺參溶菌酶基因的表達(dá)量變化，為構(gòu)建刺參體內(nèi)RNA干擾體系提供參考依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 實驗材料

實驗用刺參取自遼寧省大連市東北部海域，暫養(yǎng)于水槽內(nèi)，飼養(yǎng)溫度為12～16℃，飼料為海參配合飼料。

1.2 主要實驗試劑

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞和壯觀霉素購自美國Sigma公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購自北京天根公司，Entranster-in vivo轉(zhuǎn)染試劑購自北京英格恩公司，Trizol總RNA提取試劑購自Life Technologies公司，EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，SYBR Premix Ex TaqTMII購自大連寶生物工程有限公司， BLOCK-iT Pol II miR RNAi Expression Vector Kit with EmGFP 均購置于Invitrogen公司，HQ高純度質(zhì)粒抽提試劑盒購置Invitrogen公司。引物合成和測序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

2 方法與操作

2.1 刺參溶菌酶基因miRNA干擾前體序列及主要引物的設(shè)計

根據(jù)刺參溶菌酶基因（GenBank： KF773759.1）序列設(shè)計刺參溶菌酶基因的miRNA干擾前體序列。設(shè)計所得序列見表1。

2.2 刺參溶菌酶基因RNA干擾重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將合成的寡聚單鏈DNA退火連接成雙鏈DNA，然后將退火的雙鏈DNA與RNA干擾載體按下列體系在室溫連接30 min構(gòu)建RNA干擾重組質(zhì)粒：5×ligation buffer 4 μL、pcDNA6.2-GW/EmGFP 2 μL、ds oligo（10 nm） 4 μL、T4 DNA ligase（1 U/μL）1 μL、ddH2O 9 μL。接下來將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中并涂布于含壯觀霉素的LB固體培養(yǎng)基上于37 ℃恒溫過夜培養(yǎng)至平板上有可見菌落。最后，挑取一個單菌落放入1.5 mL離心管中（試管內(nèi)有1 mL含壯觀霉素的LB液體培養(yǎng)基），于200 r/min、37 ℃培養(yǎng)箱中搖菌過夜培養(yǎng)。運用PCR技術(shù)對菌液進行檢測后選取含正確條帶的陽性克隆菌液送上海生工公司測序。

2.3 制備RNA干擾重組質(zhì)粒

在含壯觀霉素的LB培養(yǎng)基中接種目標(biāo)菌株，于37 ℃搖床200 r/min振蕩培養(yǎng) 16 h，按照北京天根公司的質(zhì)粒提取試劑盒的說明書提取質(zhì)粒，完成后將質(zhì)粒置于-20℃保存以用于后續(xù)試驗。

2.4 RNA干擾重組質(zhì)粒的篩選

轉(zhuǎn)染前一天將刺參體腔液原代培養(yǎng)細(xì)胞以5×106個/mL 濃度接種于24孔板中。轉(zhuǎn)染前換用1 mL無血清和抗生素的LB液體培養(yǎng)基。每孔加入的轉(zhuǎn)染復(fù)合物體積為18 μL，其中含2 μg RNA干擾重組質(zhì)粒、2 μL Lipofecter脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑和相應(yīng)體積的待用培養(yǎng)液。接下來將細(xì)胞在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h后，換上含抗生素的完全培養(yǎng)液，放置在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每24 h更換一次培養(yǎng)液。在細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染48 h后，提取細(xì)胞樣品中的總RNA用于測定溶菌酶基因的表達(dá)量，所用引物如表2所示。qPCR反應(yīng)體系的總體積為20 μL且各組分的體積如下：SYBR 10 μL，Primer F/R 各0.8 μL，ROX 0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL；反應(yīng)條件如下：預(yù)熱階段為95 ℃，30 s，PCR反應(yīng)階段共40個循環(huán)分別為95 ℃，5 s、60 ℃，32 s，獲得熔解曲線階段為95 ℃，15 s，60 ℃，60 s，95 ℃，15 s，60 ℃，15 s。

2.5 刺參體內(nèi)RNA干擾方法的探索

2.5.1 刺參體內(nèi)RNA干擾的最佳注射方式 選取生長一致、健康狀況良好的刺參隨機分為5組，每組3頭，使用250 μL規(guī)格的微量進樣器注射RNA干擾重組質(zhì)粒，每頭刺參的注射劑量為0.625 μg/g。其中：第一、二組為實驗組，第一組為體腔注射RNA干擾重組質(zhì)粒miRNA-2，第二組為口腔注射RNA干擾重組質(zhì)粒miRNA-2；第三、四組為陰性對照組，第三組以體腔注射陰性對照質(zhì)粒，第四組以口腔注射陰性對照質(zhì)粒；第五組為空白對照組，未做任何處理。注射48 h后，提取刺參體腔液、管足和肌肉組織的總RNA，使用qPCR技術(shù)檢測刺參溶菌酶基因的相對表達(dá)量。

2.5.2 刺參體內(nèi)RNA干擾的最佳注射劑量 選取生長一致、健康狀況良好的刺參隨機分為6組，每組3頭，第一、二、三和四組為實驗組，第五組為陰性對照組，第六組為空白對照組。均以口腔注射的方式將轉(zhuǎn)染復(fù)合物注射進入刺參體內(nèi)。其中，第一組每頭刺參注射0.5 μg RNA干擾重組質(zhì)粒miRNA-2，第二組每頭刺參注射5 μg RNA干擾重組質(zhì)粒miRNA-2，第三組每頭刺參注射10 μg RNA干擾重組質(zhì)粒miRNA-2，第四組每頭刺參注射25 μg RNA干擾重組質(zhì)粒miRNA-2，第五組每頭刺參注射等體積的陰性對照質(zhì)粒，第六組刺參不做任何處理。注射48 h后，分別提取各實驗組刺參體腔液、管足和肌肉組織的總RNA，使用qPCR技術(shù)檢測溶菌酶基因的相對表達(dá)量。

2.5.3 刺參體內(nèi)RNA干擾的時間效應(yīng) 選取生長一致、健康狀況良好的刺參隨機分為7組，每組3頭，用250 μL微量進樣器以口腔注射的方式注射RNA干擾重組質(zhì)粒。其中：第一、二組分別為空白對照組和陰性對照組，每頭刺參分別注射等體積的PBS和10 μg陰性對照質(zhì)粒，然后提取刺參各組織總 RNA；第三至七組為實驗組，每頭刺參分別注射10 μg RNA干擾重組質(zhì)粒miRNA-2，依次于12、24、48 h及4 d和8 d后提取各組織用于后續(xù)實驗。最后，應(yīng)用qPCR技術(shù)檢測溶菌酶基因的相對表達(dá)量，并使用溶菌酶活性檢測試劑盒檢測各組織樣品中的溶菌酶活性（具體操作見南京建成生物科技有限公司的產(chǎn)品說明書）。

2.6 數(shù)據(jù)處理

基因相對表達(dá)量的計算采用2-ΔΔCT法。溶菌酶基因的表達(dá)量是與內(nèi)參基因CYTB相比的相對表達(dá)量?！鳌鰿T=（待測樣品目的基因CT的平均值-待測樣本內(nèi)參基因CT的平均值）-（對照樣品目的基因CT的平均值-對照樣本內(nèi)參基因CT的平均值）?；虻谋磉_(dá)量F=2-△△CT ，目標(biāo)基因的干擾效率為1-2-△△CT。

此外，溶菌酶活性按下述公式計算：

待測樣本蛋白濃度（g/L）= [（測定OD值-空白OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值）]

×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（0.563 g/L）

溶菌酶的活力（U/mL）=（空白OD值-測定OD值）×1 000×稀釋倍數(shù)

溶菌酶的比活（U/mg）=測試物溶菌酶活力（U/mL）/測試物蛋白濃度（mg/mL）

3 實驗結(jié)果

3.1 RNA干擾重組質(zhì)粒的鑒定與測序

將轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌中的RNA干擾重組質(zhì)粒進行普通PCR檢測后，使用瓊脂糖凝膠電泳觀察片段長度，電泳圖顯示目的片段長度與預(yù)期一致，282 bp（圖1 ）；為進一步檢測插入RNA干擾重組質(zhì)粒中的DNA片段是否為相應(yīng)的目的片段及插入方向是否正確，將菌檢正確的菌樣送至生工公司測序，結(jié)果表明各個RNA干擾重組質(zhì)粒中插入的DNA片段均為正確的目的片段且插入方向正確（圖2 ）。

3.2 溶菌酶基因特異性的RNA干擾重組質(zhì)粒篩選結(jié)果

將溶菌酶基因特異性的RNA干擾重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的刺參體腔液原代細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞并提取總RNA進行qPCR檢測。3種RNA干擾重組質(zhì)粒對溶菌酶基因的沉默效率分別為40 %、45 %、0 %（見表3）。

3.3 刺參體內(nèi)RNA干擾的最佳注射方式

為了探索刺參體內(nèi)RNA干擾時RNA干擾重組質(zhì)粒的最佳注射方式，運用qPCR技術(shù)對分別從刺參口腔和腹腔注射RNA干擾重組質(zhì)粒48 h后的刺參各組織樣品中溶菌酶基因表達(dá)量進行檢測。結(jié)果如圖3所示：從體腔注射RNA干擾重組質(zhì)粒后，各組織中溶菌酶基因表達(dá)量均出現(xiàn)了顯著的上升；而從口腔注射RNA干擾重組質(zhì)粒后，體腔液和肌肉中溶菌酶基因表達(dá)量均出現(xiàn)非常顯著的下降，而管足中溶菌酶基因表達(dá)量略微上升。

3.4 刺參體內(nèi)RNA干擾的最佳注射劑量

為確定RNA干擾重組質(zhì)粒的最佳注射劑量，分別以口腔注射的方式給各實驗組刺參注射不同劑量的RNA干擾重組質(zhì)粒。結(jié)果如圖4所示：注射劑量為0.5 μg時刺參各組織中溶菌酶基因表達(dá)量均出現(xiàn)顯著上升（P<0.05）；注射劑量為5 μg時管足和體腔液中的溶菌酶基因表達(dá)量出現(xiàn)極為顯著的上升（P<0.01），而在肌肉的表達(dá)量則顯著下降（P<0.05）；注射劑量為10 μg時，管足、肌肉和體腔液中溶菌酶基因表達(dá)量均出現(xiàn)顯著地下降（P<0.05）；注射劑量為25 μg時，管足、肌肉和體腔液中溶菌酶基因表達(dá)量亦出現(xiàn)顯著下降（P<0.05），且刺參個體中出現(xiàn)吐腸現(xiàn)象。

3.5 刺參體內(nèi)RNA干擾的時間效應(yīng)

為探索刺參體內(nèi)RNA干擾在其各個組織中的表達(dá)模式，使用 RNA干擾重組質(zhì)粒miRNA -2對刺參進行體內(nèi)RNA干擾，以口腔注射的方式將其注射進入刺參體內(nèi)，分別在轉(zhuǎn)染后12、24、48 h、4 d和8 d提取刺參體腔液、肌肉、體壁、疣足和管足組織樣品測定其mRNA表達(dá)量和溶菌酶活性，計算每個實驗組3個平行樣品的平均值并作圖，結(jié)果如圖5所示：體腔液中溶菌酶基因的表達(dá)量在前48 h呈下降趨勢，之后其表達(dá)量快速上升，而其酶活性卻持續(xù)下降；肌肉中溶菌酶基因的表達(dá)量呈階梯下降并在48 h達(dá)到最小值0.1，之后逐步回升，而其酶活性呈波動式變化并在12 h達(dá)到最大值468 U/mL；體壁中溶菌酶基因表達(dá)量及其酶活性的變化趨勢基本一致，分別在12 h達(dá)到最大值1.4和245 U/mL，之后呈下降趨勢；疣足中溶菌酶基因表達(dá)量及其酶活性在前48 h未出現(xiàn)顯著變化，分別在48 h達(dá)到其最小值，之后其表達(dá)量開始逐步回升；管足中溶菌酶基因的表達(dá)量在12 h顯著上升（P< 0.05），在48 h其表達(dá)量達(dá)到最小值0.18，之后逐步回升而其酶活性在12 h達(dá)到最大值，之后逐漸下降。

4 討論

自1998年Fire和Mello發(fā)現(xiàn)了RNA干擾現(xiàn)象以來[3]，RNA干擾技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于癌癥研究、抗病毒及基因功能研究等眾多領(lǐng)域。隨著RNA干擾技術(shù)的逐漸成熟，近年來RNA干擾技術(shù)在水產(chǎn)動物研究中的應(yīng)用逐漸增多。本研究旨在刺參中探索建立一種穩(wěn)定的RNA干擾技術(shù)，以幫助研究人員進行刺參基因功能研究及抗病毒等方面的研究。

在動物機體中，RNA干擾質(zhì)粒可以用電穿孔導(dǎo)入和液體動力注射導(dǎo)入靜脈、皮下及肌肉等方法導(dǎo)入體內(nèi)[16]。Genciana Terova等[5]用肌肉注射然后使用電脈沖儀導(dǎo)入的方法成功介導(dǎo)了RNA干擾使靶基因沉默。而Liu等[6]通過在太平洋白蝦和凡納濱對蝦腹部注射的方法成功介導(dǎo)RNA干擾使QM沉默，證明QM對于凡納濱對蝦和太平洋白蝦的主動防御起到了正向調(diào)節(jié)作用。在本研究中，分別從刺參的體腔和口腔注射RNA干擾重組質(zhì)粒以介導(dǎo)RNA干擾使溶菌酶基因沉默，結(jié)果表明：體腔注射的方法未能成功介導(dǎo)RNA干擾使溶菌酶基因沉默，而通過口腔注射則可以成功介導(dǎo)RNA干擾使溶菌酶基因沉默，體腔液和肌肉等組織中的溶菌酶基因表達(dá)量出現(xiàn)了極為顯著的下降。

以往的研究表明：RNA干擾對靶基因的抑制效率具有一定的劑量依賴效應(yīng)[17]。Naoki等[7]給小鼠尾靜脈注射不同劑量的pu6-stem21 RNA干擾重組質(zhì)粒后發(fā)現(xiàn)隨著質(zhì)粒DNA劑量的增加，RNA干擾的沉默效率逐漸提高。此外，何國平等[18]將外源報告基因和編碼短發(fā)夾RNA的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293H細(xì)胞，結(jié)果表明：在一定范圍內(nèi)，RNA干擾載體介導(dǎo)的抑制效應(yīng)與干擾載體劑量大小有關(guān)，當(dāng)劑量加大到足以抑制外源基因表達(dá)時，抑制效應(yīng)則維持在一“平臺期”。由此，從刺參口腔注射不同劑量的RNA干擾重組質(zhì)粒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)RNA干擾重組質(zhì)粒的注射劑量為0. 5 μg和5 μg時，刺參體腔液、肌肉和管足中溶菌酶基因的表達(dá)量顯著上升，這與Naoki等[7]的實驗結(jié)果基本一致，即RNA干擾重組質(zhì)粒的注射劑量過低時，其靶基因的表達(dá)不僅未受到抑制，相反其表達(dá)量出現(xiàn)顯著上升，可能是由于靶基因的mRNA未被充分地降解并在細(xì)胞自身的調(diào)節(jié)下大量轉(zhuǎn)錄靶基因mRNA予以補充，接下來隨著質(zhì)粒DNA劑量的增加，RNA干擾的沉默效率逐漸提高，但是，當(dāng)RNA干擾重組質(zhì)粒劑量為25 μg時，RNA干擾重組質(zhì)粒介導(dǎo)的抑制效應(yīng)未出現(xiàn)顯著提升且刺參出現(xiàn)吐腸現(xiàn)象，初步推測是由于RNA干擾質(zhì)粒劑量過大導(dǎo)致刺參出現(xiàn)了強烈的應(yīng)激反應(yīng)，從而削弱了RNA干擾重組質(zhì)粒的抑制效應(yīng)。

研究表明：在體內(nèi)和體外RNA干擾中，RNA干擾具有時間依賴性。Naoki等[7]對小鼠的體內(nèi)RNA干擾實驗顯示：在注射RNA干擾重組質(zhì)粒6 h后靶基因的表達(dá)量才開始下降；而何國平等[18]進行的體外RNA干擾實驗顯示：EGFP mRNA表達(dá)水平在6 h無變化，直到12 h后才出現(xiàn)微弱的降低，表明細(xì)胞內(nèi)siNRAs生成需要一定時間誘導(dǎo)表達(dá)。在本實驗中，注射RNA干擾重組質(zhì)粒后12 h，溶菌酶基因表達(dá)量上升，之后其表達(dá)量下降，表明轉(zhuǎn)染12 h后，刺參體內(nèi)開始產(chǎn)生有效的RNA干擾效應(yīng)，而12 h時溶菌酶基因表達(dá)量上升可能是在注射時刺參體內(nèi)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。此外，RNA干擾效應(yīng)在不同組織之間的傳遞是RNA干擾系統(tǒng)性發(fā)生的決定性因素。以前的研究表明，RNA干擾的系統(tǒng)性在不同物種中是不一樣的[19]。某些甲殼動物和線蟲的RNA干擾效應(yīng)能夠系統(tǒng)性發(fā)生[20-21]，而果蠅的 RNA 干擾效應(yīng)則不能系統(tǒng)性發(fā)生[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同注射部位能夠引起不同的RNA干擾效應(yīng)-體腔注射不會引發(fā)RNA干擾效應(yīng)：從體腔注射RNA干擾重組質(zhì)粒時只在個別組織如管足中引發(fā)RNA干擾效應(yīng)，而從口腔注射則能夠系統(tǒng)性地在刺參各個組織中引發(fā)RNA干擾效應(yīng)；在刺參體內(nèi)RNA干擾的時間效應(yīng)實驗中，注射RNA干擾重組質(zhì)粒12 h后，刺參管足中溶菌酶基因的表達(dá)量持續(xù)下降，而其酶活性下降后從24 h開始逐步回升，與體腔液中溶菌酶基因的表達(dá)量變化趨勢基本一致。通過對刺參的解剖實驗表明：管足和疣足等組成刺參的水管系統(tǒng)，管足中的體液來自體腔液和疣足。推測體腔液和疣足中合成的溶菌酶通過體液循環(huán)到達(dá)管足，從而導(dǎo)致管足中溶菌酶活性上升。

綜上所述，當(dāng)RNA干擾重組質(zhì)粒的注射劑量為10 μg且從口腔注射時能夠在刺參體內(nèi)引發(fā)有效的RNA干擾效應(yīng)，該RNA干擾效應(yīng)具有系統(tǒng)性即能夠在不同組織之間的傳遞，且RNA干擾重組質(zhì)粒介導(dǎo)的刺參體內(nèi)RNA干擾最長能持續(xù)4 d左右。

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（收稿日期：2016-05-19；修回日期：2016-05-23）