沙漠小球藻的蛋白雙向電泳分析

牟　云，汪文倫，嚴　國，王會敏，高劍峰

(石河子大學 生命科學學院，新疆石河子 832000)

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沙漠小球藻的蛋白雙向電泳分析

牟云，汪文倫，嚴國，王會敏，高劍峰*

(石河子大學 生命科學學院，新疆石河子 832000)

為建立適用于小球藻(Chlorellasp. TLD6B)蛋白質(zhì)組分析的雙向電泳體系，該研究比較了TCA/丙酮沉淀法和Trisol提取法對小球藻蛋白的提取效果，不同pH梯度IPG膠條(pH3～10和 pH4～7)、不同蛋白質(zhì)上樣量、不同聚焦程序?qū)π∏蛟宓鞍椎姆蛛x效果。結果表明：(1)采用Trisol提取法可獲得較高純度蛋白，當選擇24 cm pH 3～10的線性IPG膠條時，上樣量為500 μg，聚焦80 000 Vh效果最佳，可分辨蛋白點達726個；當選擇24 cm pH 4～7的線性IPG膠條時，上樣量為1 000 μg，聚焦80 000 Vh效果最佳，可分辨蛋白點達1 230個。(2)該實驗隨機挑選了10個膠內(nèi)蛋白點進行MALDI-TOF/TOF-MS鑒定分析表明，其中8個蛋白點鑒定成功，進一步說明Trisol提取法可適用于小球藻雙向電泳分析。

小球藻；雙向電泳；Trisol提取法

雙向電泳(2-DE)作為蛋白質(zhì)組學研究的核心技術由O’Farrell于1975年建立[1]，其利用蛋白質(zhì)等電點和分子量的差異可一次性分離幾千甚至幾萬的蛋白質(zhì)點，具有較高的靈敏度和分辨率。目前，2-DE技術已在細菌、真菌、動植物[2-4]中被廣泛應用，但關于微藻、特別是小球藻的2-DE技術則報道的相對較少。在2-DE技術中，蛋白提取和體系優(yōu)化是最為重要的環(huán)節(jié)，小球藻中含有大量的多糖、淀粉、脂質(zhì)等干擾物質(zhì)，因此尋求適合的蛋白提取方法極為重要；此外，由于不同植物的生物學特征、生理生化特征不盡相同，不同植物的最適電泳條件也不盡相同[5]，所以探求小球藻的最適電泳條件有一定的必要性。

小球藻為球形或橢圓形、綠色、單細胞藻類植物，也是真核微生物的一種。其細胞直徑3～8 μm，是地球上最早的生命之一，出現(xiàn)在20多億年前，遺傳相對保守，其廣泛分布于海洋、土壤和荒漠。作為分布廣泛的單細胞低等生物，小球藻是在單細胞水平上研究植物逆境脅迫條件下蛋白表達及其調(diào)控的絕佳材料。目前，國內(nèi)外關于藻類抗逆蛋白組學的研究日趨活躍。同時，小球藻作為重要的生物質(zhì)能源的儲備資源也被廣泛應用。Wang等[6]通過雙向電泳技術研究了雨生紅球藻細胞壁蛋白質(zhì)對氧化應激的反應。Liska等[7]從蛋白組學角度分析了杜氏鹽藻的耐鹽性機制。Wagner等[8]通過雙向電泳技術研究了雷氏衣藻的晝夜節(jié)律蛋白。Murugaiyan J等[9]研究了致病無綠藻和非致病無綠藻之間的蛋白組學差異。Song等[10]通過雙向電泳技術比較分析了正常和缺氮組球等鞭金藻的蛋白組學變化，從蛋白組學水平揭示了氮元素對小球藻產(chǎn)油的影響。

沙漠小球藻作為一種低等的單細胞植物，其個體生長的分子機制尚不明確；截止至今大規(guī)模培養(yǎng)小球藻未取得突破性進展。為了深入研究小球藻個體生長的分子機制和其對干旱、高鹽等逆境的應答機制，從蛋白組學和基因組學水平研究其蛋白和基因的表達差異就顯得尤為重要。因此，本研究比較了TCA/丙酮沉淀法和Trisol提取法對小球藻蛋白的提取效果，同時比較了不同pH梯度IPG膠條(pH3～10和 pH4～7)、不同蛋白質(zhì)上樣量、不同聚焦程序?qū)π∏蛟宓鞍椎姆蛛x效果；建立了一套沙漠小球藻2-DE技術方法，不僅為沙漠小球藻抗逆蛋白組學研究提供了技術條件，也為其他陸生藻類的蛋白組學研究提供了基礎資料。

1　材料與方法

1.1材料

實驗所用藻種由本實驗室從新疆塔克拉瑪干沙漠沙樣中分離、純化并鑒定。將Chlorellasp.(TLD6B)原藻液以10%接種量轉(zhuǎn)至3個裝有500 mL BBM培養(yǎng)基的1 000 mL三角瓶中；接種后的藻樣置于光照箱中培養(yǎng)，光照強度4 000 lx，12 h光照，溫度23 ℃；至對數(shù)生長期離心收集藻體用于后續(xù)實驗。

1.2實驗方法

1.2.1蛋白質(zhì)提取(1)TCA/丙酮沉淀法參見Damerval等[11]的方法。(2)Trisol提取法參見Fred等[12]的方法。具體步驟為：取適量藻液6 000 r/min離心5 min，所得藻泥用蒸餾水洗3次；液氮研磨破壁，加入1 mLTrisol試劑，室溫下靜置5 min，加入200 μL三氯甲烷于細胞裂解產(chǎn)物中，充分混勻，室溫下靜置5 min，之后4℃、12 000 r/min離心15 min，棄無色頂層；加入300 μL乙醇，4℃、12 000 r/min離心5 min；將上清轉(zhuǎn)移到新離心管中并加入1.5 mL異丙醇，室溫下靜置20 min，之后12 000 r/min離心10 min；所得沉淀用95%乙醇清洗之后在用80%預冷丙酮沉淀30 min，12 000 r/min 離心10 min，棄上清，沉淀空氣中干燥。

1.2.2蛋白樣品的裂解及定量加入一定體積的裂解液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4%CHAPS，2%IPG buffer,1%DTT)溶解蛋白，30℃水浴促溶2 h，15 000 r/min離心30 min；上清即為蛋白液。采用蛋白質(zhì)定量試劑盒(2-D Quant-Kit, GE-Healthcare)對所提蛋白進行定量。

1.2.3SDS-PAGE 蛋白電泳采用常規(guī)SDS-PAGE對所提蛋白進行分離；其中分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%，上樣量為30 μg；電泳完畢采用考馬斯亮藍法進行染色。

1.2.4雙向電泳一向等電聚焦采用24 cm線性IPG膠條(GE-Healthcare)，根據(jù)蛋白濃度確定上樣量，用水化液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，2%CHAPS，0.5%IPG buffer,1%DTT，0.0002%溴酚藍)補齊至450 μL。在泡脹盤中對膠條進行過夜被動泡脹后，使用Ettan IPGphor3等電聚焦儀進行第一向等電聚焦，聚焦程序為：100 V 2 h；300 V 3 h；1 000 V 3 h；3 000 V 3 h；8 000 V 3 h；8 000 V，分別聚焦60 000 Vh、70 000 Vh、80 000 Vh；500 V，任意時間。聚焦完成的膠條立即進行平衡，平衡分兩步，每次15 min。平衡液Ⅰ含6 mol/L 尿素、2% SDS、75 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8)、20% Glycerol (甘油)、0.000 2%溴酚藍和1% DTT，平衡液Ⅱ含6 mol/L 尿素、2% SDS、75 mmol/L pH 8.8Tris-HCl、20% Glycerol和2.5% Iodacetamide(碘乙酰胺)。每次平衡后用蒸餾水沖洗膠條并于濾紙上瀝干水分。將平衡后的膠條放入二向膠上，并用0.5%低熔點瓊脂糖封膠，使用EttanDaltSix垂直板電泳儀進行第二向SDS-PAGE蛋白電泳，調(diào)恒溫水浴15 ℃，每張10 mA電泳30 min，然后每張38 mA電泳5～6 h，待溴酚藍前沿到達凝膠底部停止電泳。

1.2.5圖像掃描與分析使用ImageScannerⅢ對圖像進行掃描，并用Labscan軟件進行照相，圖像分辨率300 dpi；用ImageMaster Platinum 7.0對掃描結果進行分析。

1.2.6挖點及膠內(nèi)酶解與質(zhì)譜分析根據(jù)ImageMaster Platinum 7.0軟件分析的結果，用200 μL槍頭(根據(jù)蛋白點大小減去前端適當部分)插取蛋白點，并放入PCR小管中，送上海生工生物工程股份有限公司完成膠內(nèi)酶解及質(zhì)譜分析。將得到的肽質(zhì)量指紋圖提交到Mascot (www.matrixscience.com)蛋白數(shù)據(jù)庫進行搜索，搜索參數(shù)設定如下：檢索數(shù)據(jù)庫為NCBInr，物種選擇綠色植物，胰蛋白酶酶解，固定修飾為Carbamidomethyl (C)，可變修飾為Acetyl (Protein N-term)、Deamidated (NQ)、Dioxidation (W)、Oxidation (M)，肽段偏差100 ppm。

2　結果與分析

2.1不同蛋白質(zhì)提取方法的比較分析

采用Trisol提取法和TCA/丙酮沉淀法提取小球藻的全蛋白，結果(圖1)顯示。2種蛋白提取方法均能獲得較為清晰的條帶，Trisol法提取的蛋白大致分布在18.4 ～116.0 kD之間；TCA/丙酮沉淀法提取的蛋白大致分布在25.0 ～116.0 kD之間，說明對于分子量小于25.0 kD的蛋白該方法不能有效提取，造成了蛋白的丟失(圖1，A)。Trisol提取法獲得的蛋白溶液濃度為(9.87±0.52) mg/mL，而TCA/丙酮沉淀法所獲蛋白濃度則為(4.93±0.56) mg/mL(圖1,B)。綜上說明Trisol提取法更適用于小球藻蛋白的提取和后續(xù)的雙向電泳實驗。

2.2不同蛋白上樣量的雙向電泳結果比較

為了使電泳圖像有更高的分辨率，對雙向電泳中蛋白的上樣量進行了對比分析。

用Trisol提取法提取小球藻全蛋白，分別選用24 cm、pH 3～10和pH 4～7 IPG膠條。選用24 cm、pH 3～10的IPG膠條時分別取1 100、800和500 μg的蛋白樣品進行上樣;選用24 cm、pH 4～7 IPG膠條時分別取1 200和1 000 μg蛋白樣品進行上樣。結果(圖2)顯示，采用pH 3～10 IPG膠條，上樣量為1 100 μg時，蛋白基本不能聚焦成規(guī)則的點且橫條紋嚴重，蛋白圖譜中可識別的蛋白點僅有172個(圖2，A)；上樣量為800 μg時，蛋白點數(shù)較多，但一些高豐度蛋白點過大導致飽和重疊現(xiàn)象的發(fā)生，蛋白圖譜中可識別的蛋白點有333個(圖2，B)；上樣量為500 μg時，蛋白點清晰且無橫條紋，聚焦效果好，蛋白圖譜中可識別的蛋白點高達726個，能更好地滿足實驗分析的需求(圖2，C)。采用pH 4～7 IPG膠條，上樣量為1 200 μg時，同樣高豐度蛋白掩蓋了部分低豐度蛋白的分離，可識別蛋白點有935個(圖2，D)；減少上樣量至1 000 μg，蛋白點相對清晰，圖譜質(zhì)量較佳，可識別的蛋白點高達1 230個(圖2，E)。

A.不同蛋白提取方法制備的蛋白SDS-PAGE分析；B.不同蛋白提取方法所得蛋白濃度比較；M.蛋白質(zhì)標準分子量；1～3和a. Trisol提取法；4～6和b. TCA/丙酮沉淀法圖1　不同蛋白提取方法的比較A. SDS-PAGE of proteins extracted by different methods; B.Comparison of protein concentrations; M. Protein molecular weight marker; 1～3 and a.Trisol extraction;4～6 and b.TCA/acetone precipitationFig.1　Comparison of different protein extraction methods

A～C為pH 3～10 IPG膠條所得圖譜，上樣量分別為1 100、800和500 μg；D～E為pH 4～7 IPG膠條所得圖譜，上樣量分別為1 200和1 000 μg圖2　不同上樣量2-DE圖譜比較 A～C were 2-DE maps which using pH 3～10 linear IPG strip, loading volume were 1 100 ,800 and 500 μg, respectively; D～E were 2-DE maps which using pH 4～7 linear IPG strip, loading volume were 1 200 and 1 000 μg, respectivelyFig.2　2-DE maps of different loading volumes

圖3　不同聚焦程序的2-DE圖譜比較A.60 000 Vh；B. 70 000 Vh；C.80 000 VhFig.3　2-DE maps of different IEF time

2.3不同聚焦程序的雙向電泳結果比較

采用pH 3～10 IPG膠條，上樣量500 μg，聚焦時間分別為60 000 Vh、70 000 Vh和80 000 Vh，電泳結果(圖3)顯示，聚焦時間為60 000 Vh時，電泳圖譜中存在大量的橫條紋且可分辨的蛋白點較少，僅有196個(圖3，A)；聚焦時間為70 000 Vh時，圖譜中的橫條紋相對減少，但仍存在部分橫條紋，說明一些蛋白還未充分聚焦，可分辨的蛋白點為398個(圖3，B)；聚焦時間為80 000 Vh時，圖譜中橫條紋明顯減少，可分辨的蛋白點達到763個(圖3，C)。而pH 4～7 IPG膠條的聚焦程序優(yōu)化建立在pH 3～10 IPG膠條的基礎之上，采用80 000 Vh的聚焦時間可獲得較高質(zhì)量的蛋白圖譜(圖2，E)。由此可見，采用pH 3～10和pH 4～7IPG膠條時，聚焦80 000 Vh可獲得分辨率高且橫條紋少的電泳圖譜。

2.4小球藻蛋白的質(zhì)譜分析鑒定

隨機選取pH 4～7的2-DE圖譜中10個蛋白點進行質(zhì)譜鑒定(圖4)，8個蛋白點鑒定成功(表1)，其中點C15得分210，序列覆蓋度為15%，為捕光葉綠素a/b結合蛋白I型；點C16得分151，序列覆蓋度為7%，為一個表達蛋白；點C17得分108，序列覆蓋度為5%，為ABC轉(zhuǎn)運蛋白底物結合蛋白；點C18得分102，序列覆蓋度為9%，為外膜蛋白/肽聚糖結合(脂)蛋白；點C19得分290，序列覆蓋度為2%，為ATP合酶β亞基；點C21得分58，序列覆蓋度為1%，為假想蛋白VITISV_024100；點C22得分98，序列覆蓋度為33%，為核酮糖磷酸異構酶；點C24得分108，序列覆蓋度為3%，為假想蛋白CHLNCDRAFT_138237。說明從電泳圖譜中挖取的蛋白點可較好地滿足后續(xù)的實驗分析要求。

圖4　用于質(zhì)譜分析的10個蛋白點Fig.4　Ten randomly selected protein spots on 2-DE gel wereidentified by mass spectrometry表1　蛋白點MALDI-TOF-TOF 質(zhì)譜鑒定結果Table 1　Identification of selected protein spots using MALDI-TOF-TOF

樣品名SamplenameGI號GInumber等電點Isoelectricpoint分子量Proteinmass匹配的肽段Matchedpeptide序列覆蓋度Sequencecoverage/%搜索得分Mascotscorea蛋白名稱ProteinnameC157604419815.93267832(2)15210Chlorophylla-bbindingproteinofLHCIItypeI捕光葉綠素a/b結合蛋白I型C165528460794.51193762(2)7151Expressedprotein表達蛋白C174937780374.99469042(1)5108ABCtransportersubstrate-bindingproteinABC轉(zhuǎn)運蛋白底物結合蛋白C183977183554.81138691(1)9102Outermembraneprotein/peptidoglycan-associated(lipo)protein,partial外膜蛋白/肽聚糖結合(脂)蛋白,部分C197604378715.301517882(2)2290ATPsynthasesubunitbeta,mitochondrialATP合酶β亞基,線粒體C211478162126.71880621(1)158HypotheticalproteinVITISV_024100假想蛋白VITISV_024100C2291879874.3846333(2)3398Putativeribulose-phosphate3-epimerase核酮糖磷酸異構酶C245528454245.69286801(1)371HypotheticalproteinCHLNCDRAFT_138237假想蛋白CHLNCDRAFT_138237

3　討　論

在雙向電泳整個環(huán)節(jié)中，蛋白提取、IPG膠條pH范圍選擇、上樣量和聚焦時間是影響電泳圖譜質(zhì)量的必要因素。由于不同植物所含蛋白量和組分各不相同，因而對每種植物都需要進行體系優(yōu)化[5]。

TCA/丙酮沉淀法是現(xiàn)今提取植物蛋白的常用方法之一，已在國內(nèi)外被廣泛應用[13-14]。但此方法最大的弊端在于所提蛋白很難復溶，會導致一部分蛋白的缺失。Fred Wang-Fat Lee等[12]以亞歷山大藻和斯克里普藻為研究對象，采用Trisol提取法對這兩種微藻的蛋白進行提取，得到的雙向電泳圖譜分辨率高，重復性好。

朱方超等[15]比較了TCA/丙酮沉淀法和改良酚法對水稻種子提取效果的影響，發(fā)現(xiàn)TCA/丙酮沉淀法獲得的電泳圖譜中存在部分蛋白點的丟失，類似的情況在本實驗中也得到了體現(xiàn)。與TCA/丙酮沉淀法相比，Trisol提取法可更有效去除小球藻中的色素、多糖、脂質(zhì)等干擾電泳結果的物質(zhì)且所提蛋白相對完整；此外，該方法還可減少高豐度蛋白對電泳結果的影響。所以，本實驗采用Trisol提取法提取小球藻蛋白。

理論上，pH 3～10 IPG膠條比pH4～7 IPG膠條可分離得到更多的蛋白點，能更好地反映植物組織細胞內(nèi)蛋白的表達情況。但是小球藻蛋白大多集中在pH5～7之間，極酸、極堿蛋白相對較少，采用pH3～10的IPG膠條就會使蛋白過于集中，無法使不同蛋白點有效分開，從而導致電泳圖譜的分辨率降低。多數(shù)學者采用pH4～7的IPG膠條進行植物蛋白的分離，如甘露等[16]采用pH4～7 IPG膠條對甘藍型油菜蛋白進行分離，王珊珊等[17]也采用pH4～7 IPG膠條對黃瓜根系蛋白進行分離，Nicola等[18]在研究缺氮條件下硅藻的蛋白變化時采用了pH4～7 IPG膠條。但并非所有植物都可采用pH 4～7IPG膠條進行分離，當研究極酸和堿性蛋白時，采用pH3～10 IPG膠條才可達到分離效果[19]。本實驗分別研究了pH4～7和pH3～10 IPG膠條的最適電泳條件，為后續(xù)的實驗奠定了基礎。

在雙向電泳過程中，上樣量也決定了實驗的成敗。提高上樣量有利于低豐度蛋白的檢出，但過高的上樣量則會導致鹽離子濃度過高，從而使一向等電聚焦不完全，蛋白圖譜則會出現(xiàn)較多的橫條紋，嚴重影響實驗分析[20]；而過低的上樣量則不利用低豐度蛋白的顯現(xiàn)。梁文裕等[21]在發(fā)菜雙向電泳的優(yōu)化實驗中采用24 cm、pH4～7 IPG膠條，上樣量為1 500 μg時能得到較清晰的蛋白圖譜。石海波等[22]在玉米籽粒的雙向電泳優(yōu)化實驗中采用24 cm、pH3～10 IPG膠條，上樣量為800 μg時能得到較清晰的蛋白圖譜。因此，上樣量的選擇不僅要根據(jù)IPG膠條的pH范圍來考慮，還要根據(jù)實驗材料、IPG膠條的長度、染色方法等因素綜合考慮。在本實驗中，當選擇24 cm、pH3～10 IPG膠條時，上樣量為500 μg，效果最佳；當選擇24 cm、pH4～7 IPG膠條時，上樣量為1 000 μg，效果最佳。

等電聚焦程序設置的好壞直接影響電泳圖譜的分辨率，一般采用低電壓除鹽、緩慢升壓的方式進行等電聚焦。因植物蛋白樣品中含大量的鹽分，低電壓則有助于鹽分的去除，使電壓最終能升到預設值。本實驗對24 cm pH4～7和pH3～10 IPG膠條聚焦80 000 Vh，均可得到分辨率較高的蛋白圖譜。

本研究的小球藻分離自塔克拉瑪干沙漠，生長于此的小球藻及其他植物經(jīng)過百萬年的進化，已經(jīng)完全適應了沙漠的極端環(huán)境。為了深入了解其逆境適應性，采用雙向電泳技術揭示干旱脅迫和高鹽脅迫下小球藻蛋白調(diào)控機制，不僅能從單細胞水平闡明低等植物在水、鹽脅迫下蛋白表達情況，更重要的是，能夠通過比較分析了解低等植物的單個細胞和高等植物組織中的每個細胞在抗逆過程中的功能，從而能夠解析高等植物的細胞、組織和器官乃至整個植株在抗逆過程中各自發(fā)揮的作用，從而為更加全面、系統(tǒng)地認識植物抗逆分子機制奠定基礎。

本研究通過對沙漠小球藻雙向電泳體系優(yōu)化，建立了一套適用于小球藻的雙向電泳技術體系。采用Trisol提取法提取蛋白的純度和濃度均能達到實驗的要求；當選用24 cm pH3～10線性IPG膠條時，上樣量為500 μg，聚焦80 000 Vh，所得蛋白圖譜分辨率高，可分辨蛋白點達726個；當選用24 cm pH4～7線性IPG膠條時，上樣量為1 000 μg，聚焦80 000 Vh，所得蛋白圖譜分辨率高，可分辨蛋白點達1 230個。

[1]O’FARRELL PH. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins[J].JournalofBiologicalChemistry, 1975, 250(10):4 007-4 021.

[2]MOLLOY MP, PHADKE ND, MADDOCK JR, et al. Two-dimensional electrophoresis and peptide mass fingerprinting of bacterial outer membrane proteins[J].Electrophoresis, 2001,22(9):1 686-1 696.

[3]SHIGEMITSU T, SAITO Y, MORITA S,etal. Separation and identification of rice prolamins by two-dimensional gel electrophoresis and amino acid sequencing[J].BioscienceBiotechnology&Biochemistry,2012,76(3):594-597.

[4]顏新培,鐘伯雄,徐孟奎,等.家蠶催青前期胚胎蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜分析[J].昆蟲學報, 2005,48(2):295-300.

YAN X P, ZHONG B X, XU M K,etal. Analysis of protein patterns from embryo of silkworm Bombyxmori at earlier stage by two dimensional polyacrylamide gel electrophoresis[J].ActaEntomologicaSinica, 2005,48(2):295-300.

[5]趙玲玲,畢青,周雪,等.大白菜根系蛋白質(zhì)雙向電泳體系優(yōu)化[J].分子植物育種,2015,(1):178-183.

ZHAO L L,BI Q,ZHOU X,etal.Optimizing two-dimensional gel electrophoresis system for root proteins of Chinese Cabbage (BrassicarapaL. ssp.Pekinensis)[J].MolecularPlantBreeding,2015,(1):178-183.

[6]WANG S B, CHEN F, SOMMERFELD M,etal. Proteomic analysis of molecular response to oxidative stress by the green algaHaematococcuspluvialis(Chlorophyceae)[J].Planta, 2004,220(1):17-29.

[7]LISKA A J, SHEVCHENKO A, PICK U,etal. Enhanced photosynthesis and redox energy production contribute to salinity tolerance in Dunaliella as revealed by homology-based proteomics[J].PlantPhysiology,2004,136(1):2 806-2 817.

[8]WAGNER V, FIEDLER M, MARKERT C,etal. Functional proteomics of circadian expressed proteins fromChlamydomonasreinhardtii[J].FebsLetters, 2004,559(1-3):129-135.

[9]MURUGAIYAN J, WEISE C, BERGEN MV,etal. Two-dimensional proteome reference map ofProtothecazopfiirevealed reduced metabolism and enhanced signal transduction as adaptation to an infectious life style[J].Proteomics, 2013,13(17):2 664-2 669.

[10]SONG P P, LI L, LIU J. Proteomic analysis in nitrogen-deprivedIsochrysisgalbanaduring lipid accumulation[J].PlosOne, 2013,8(12):1-13.

[11]DAMERVAL C, DE VIENNE D, ZIVY M,etal. Technical improvements in two‐dimensional electrophoresis increase the level of genetic variation detected in wheat-seedling proteins[J].Electrophoresis, 1986,7(7):52-54.

[12]LEE W F, LO C L. The use of Trizol reagent (phenol/guanidine isothiocyanate) for producing high quality two-dimensional gel electrophoretograms (2-DE) of dinoflagellates.[J].JournalofMicrobiologicalMethods,2008,73(1):26-32.

[13]HAO R, ADOLIGBE C, JIANG B,etal. An optimized trichloroacetic acid/acetone precipitation method for two-dimensional gel Electrophoresis analysis of Qinchuan Cattle Longissimus Dorsi Muscle Containing High Proportion of Marbling[J].PlosOne, 2015,10(4):1-12.

[14]賴童飛,董薇,賈銀華,等.棉花胚珠蛋白三氯乙酸丙酮法與酚抽提法的比較分析[J].農(nóng)業(yè)生物技術學報,2009,17(2):317-322.

LAI T F, DONG W, JIA Y H,etal. Evaluations of Trichloroacetic acid-acetone method and phenol method for protein extraction from cotton ovule[J].JournalofAgriculturalBiotechnology, 2009,17(2):317-322.

[15]朱方超,賈瑞宗,孫勇,等.水稻種子蛋白雙向電泳方法的建立和質(zhì)譜初步分析[J].分子植物育種,2015,(11):2 446-2 452.

ZHU F C，JIA R Z，SUN Y,etal. Establishment of two-dimensional electrophoresis protocol and primary analysis by mass spectrometry for rice (OryzasativaL.) Seed Proteome[J].MolecularPlantBreeding, 2015,(11):2 446-2 452.

[16]甘露,李殿榮,臧新,等.甘藍型油菜蛋白質(zhì)雙向電泳體系的建立[J].作物學報，2010,36(4):612-619.

GAN L，LI D R，ZANG X,etal. Construction of protein two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis system forBrassicanapus[J].ActaAgronomicaSinica,2010,36(4):612-619.

[17]王珊珊,郝宇涵,任婧祺,等.黃瓜根系蛋白質(zhì)組分析的雙向電泳技術條件優(yōu)化.[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學學報, 2012,43(2): 233-236.

WANG S S,HAO Y H,REN J Q,etal. Optimization of two-dimensional electrophoresis for proteome of cucumber root[J].JournalofShenyangAgriculturalUniversity, 2012,43(2):233-236

[18]HOCKIN NL, MOCK T, MULHOLLAND F,etal. The response of diatom central carbon metabolism to nitrogen starvation is different from that of green algae and higher plants[J].PlantPhysiology, 2012,158(1):299-312.

[19]李肖芳,韓和平,王旭初,等.適用于鹽生植物的雙向電泳樣品制備方法[J]. 生態(tài)學報,2006,26(6):1 848-1 853.

LI X F,HAN H P,WANG X C,etal. A protein extraction method suitable for two dimensional electrophoresis analysis of halophytes[J].ActaEcologicaSinica, 2006,26(6):1 848-1 853.

[20]A G?RG R G A, BOGUTH G, UUML,etal. Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis with immobilized pH gradients in the first dimension (IPG-Dalt): the state of the art and the controversy of vertical versus horizontal systems[J].Electrophoresis, 1995,16(7): 1 079-1 086.

[21]梁文裕,王星,焦廣飛,等.發(fā)菜蛋白質(zhì)組雙向電泳技術的建立及優(yōu)化[J]. 西北植物學報, 2009,29(8):1 550-1 556.

LIANG W Y,WANG X,JIAO G F,etal. Establishment and optimization of two-dimensional gel electrophoresis for proteome of nostoc flagelliforme[J].ActaBot.Boreal.-Occident.Sin., 2009,29(8):1 550-1 556.

[22]石海波, 王云生, 馮勇, 高聚林, 白海, 蘇二虎. 玉米籽粒蛋白質(zhì)雙向電泳技術體系的優(yōu)化[J].華北農(nóng)學報,2015,30(1):171-176.

SHI H B,WANG Y S,FENG Y,etal. Optimization of maize grain protein two-dimensional electrophoresis system[J].ActaAgriculturaeBoreali-Sinica,2015,30(1):171-176.

(編輯:宋亞珍)

Analysis of Two-dimensional Electrophoresis Protocol For Desert Chlorella(Chlorellasp. TLD6B) Proteome

MU Yun, WANG Wenlun, YAN Guo,WANG Huiming, GAO Jianfeng*

(College of Life Science, Shihezi University, Shihezi, Xinjiang 832000,China)

In order to establish a two-dimensional gel electrophoresis (2D-E)protocol for proteomic study of desert chlorella (Chlorellasp. TLD6B), we compared the performances of protein extraction methods from desert chlorella betweenTCA/ acetone precipitation method and Trisol extraction. The chose pH gradient gel strips and protein loading volume were also optimized. Our results showed that: (1) trisol extraction could obtain high pure protein. The improved 2-DE system for desert chlorella was come out as follows: we distinguished 726 proteins with linear IPG strips of 24 cm in length with the pH ranges from 3 to 10, 500 μg loading volume, 80000 Vh of IEF time. We distinguished 1230 proteins with linear IPG strips of 24 cm in length with the pH ranges from 4 to 7, 1 000 μg loading volume, 80 000 Vh of IEF time. (2) Ten randomly selected protein spots were identified by using MALDI-TOF/TOF-MS to confirm the establishment of two-dimensional electrophoresis protocol could be used for primary analysis of desert chlorella proteome.

Chlorella；two-dimensional gel electrophoresis (2D-E)；Trisol extraction

1000-4025(2016)09-1905-07doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.09.1905

2016-05-20;修改稿收到日期:2016-07-27

國家自然科學基金(31460276)

牟 云(1992-)，女，在讀碩士研究生,主要從事可再生能源的開發(fā)與利用相關研究。E-mail：1171534413@qq.com

高劍峰，教授，博士生導師，主要從事可再生能源的開發(fā)與利用相關研究。E-mail：jianfengg@shzu.edu.cn

Q503

A