短葉對齒蘚組織培養(yǎng)的研究

高葉青， 任冬梅， 趙小丹，趙東平，隋嫣鴻

(內(nèi)蒙古大學 生命科學學院，呼和浩特010021)

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短葉對齒蘚組織培養(yǎng)的研究

高葉青， 任冬梅*， 趙小丹，趙東平，隋嫣鴻

(內(nèi)蒙古大學 生命科學學院，呼和浩特010021)

以采自白云鄂博主礦區(qū)的短葉對齒蘚為試驗材料，研究了不同消毒劑以及不同濃度植物激素6-BA和IAA對短葉對齒蘚愈傷組織誘導(dǎo)和分化的影響。結(jié)果表明：短葉對齒蘚配子體最佳消毒劑及作用時間為體積濃度百分比75%乙醇浸泡30 s，再用質(zhì)量濃度0.1 g/L升汞消毒90 s；采用Knop培養(yǎng)基培養(yǎng)短葉對齒蘚莖葉段，質(zhì)量濃度為0.1 mg/L 6-BA促進愈傷組織分化形成配子體，質(zhì)量濃度1.0 mg/L 6-BA則抑制短葉對齒蘚愈傷組織形成，IAA有助于原絲體的萌發(fā)生長。

短葉對齒蘚；組織培養(yǎng)；植物激素

短葉對齒蘚(Didymodontectorum)屬于苔蘚植物門蘚綱叢蘚科對齒蘚屬[1]。植物體高1.0～1.5 cm，密集墊狀叢生，多見于鈣質(zhì)土壤或巖石，綠色或棕黃色。莖直立，單一或分枝，莖橫切面具厚壁細胞和透明細胞，中軸明顯分化。假根著生于基部。葉干燥時緊貼于莖，潮濕時傾立，闊卵狀披針形，從中部突然狹窄至葉尖，葉上部明顯凹陷；葉細胞單層，KOH反應(yīng)呈紅色。葉邊全緣，強烈背卷，單層細胞；中肋極頂或輕微突出葉尖，中肋中上部腹表面細胞短矩形或方形，具疣；中肋橫切面呈橢圓形或圓形，主細胞1～2層，腹厚壁細胞帶弱，1～2層或不分化，背厚壁細胞帶顯著，2～4層。葉上部細胞圓方形或方形，細胞壁稍加厚，具有1～3個鈍圓疣或分叉疣；基部細胞不分化或輕微分化，短矩形或圓方形，不透明，光滑，細胞壁薄，無壁孔；基部邊緣細胞不分化，方形或亞方形。葉腋處著生大量芽胞，棕色或棕黃色，球形，由4～8個細胞構(gòu)成，表面光滑[2]。雌雄異株。雌苞葉顯著長于莖葉，分化明顯。蒴柄和孢蒴直立，紅棕色，孢蒴圓柱形或卵圓形，蒴齒條狀，齒片32[1-2]。

很多種類的苔蘚植物生長于裸露巖石、巖面薄土或石壁上，生命力極強，能抵抗極端干旱環(huán)境[3-4]，對污染物反應(yīng)敏感，并對包括稀土元素在內(nèi)的各種重金屬元素有著顯著的吸收與富集作用。因此，苔蘚植物現(xiàn)被廣泛作為一種監(jiān)測環(huán)境的指示植物[5]。以苔蘚作為試驗材料研究其對白云鄂博礦區(qū)稀土元素的富集特性，及其在礦區(qū)環(huán)境修復(fù)方面的作用具有重要意義。

為探索并驗證苔蘚植物對稀土元素的富集能力，需要運用大量無菌、均一化的苔蘚植物材料。苔蘚對植物激素十分敏感，對添加的種類要求苛刻，有些植物激素起到正向誘導(dǎo)作用，有些則有抑制作用[6]。因此，不同種類的苔蘚植物誘導(dǎo)愈傷組織時對植物激素的種類要求有所不同。陳靜文[7]使用Knop培養(yǎng)基成功地研究出誘導(dǎo)小立碗蘚產(chǎn)生愈傷組織最佳的植物激素及其濃度配比。目前，有關(guān)短葉對齒蘚組織培養(yǎng)研究在國內(nèi)還鮮有報道，本試驗研究了2種植物激素6-BA和IAA對短葉對齒蘚愈傷組織誘導(dǎo)和分化的影響，為短葉對齒蘚植物快繁體系建立提供科學依據(jù)。

1　材料和方法

1.1材料

2013～2014年從白云鄂博礦區(qū)采集新鮮的苔蘚植物樣，放置于通風干燥處自然晾干。待土樣干燥后裝到牛皮紙質(zhì)的植物標本袋內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

通過室內(nèi)鏡檢(Leica EZ4 HD)觀察鑒定苔蘚植物種類，挑選叢蘚科、對齒蘚屬的短葉對齒蘚標本作為組培材料標本號201308044。白云鄂博主礦石下土生，從短葉對齒蘚純?nèi)郝渲须S機選取30株，測量植物體高度，植物體高度在1.5～2.2 cm之間，平均高度為1.87 cm。

1.2材料清洗準備

將選好的植株放入培養(yǎng)皿中用蒸餾水浸泡，至植物體完全舒展開，接著用自來水流水沖洗20～30 min，至表面的泥土、沙粒等雜質(zhì)被全部沖洗干凈，然后再用無菌水浸泡并用超聲波洗滌3次，每次6 min，洗凈后撈出，剪取植株上部綠色部分，截成0.2～0.3 cm的莖葉段，作為組培外植體材料，放置于墊有滅菌濾紙的培養(yǎng)皿上備用。

1.3消毒劑及消毒時間的篩選

在無菌超凈工作臺內(nèi)，將處理好的外植體用75% 的酒精浸泡30 s，依次放入無菌水中漂洗3次，然后分別用0.01、0.05和0.1 g/L升汞(貴州省銅仁化學試劑廠)溶液消毒各10、30、60、90和120 s，再用無菌水漂洗5次，取出，用滅菌濾紙吸干外植體表面的水分。將各處理分別接種于Knop(各成分均由國藥集團化學試劑有限公司提供)基本培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)皿中接4個外植體。本實驗均選用Knop作為基本培養(yǎng)基，pH值為7.5，蔗糖濃度為1.5%，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度20 ℃，光照強度3 300 Lx，光培養(yǎng)16 h暗培養(yǎng)8 h[8]。

將另外一組外植體用體積濃度1%、1.5% 和2%NaClO溶液消毒處理各45、60和90 s作為對照組，分別接種于Knop培養(yǎng)基上，20 d后發(fā)現(xiàn)僅1.5% NaClO溶液消毒90 s的未染菌，至30 d時全部染菌。消毒劑篩選結(jié)果表明：用75%酒精和0.1 g/L升汞消毒后外植體污染率最低。

2　結(jié)果與分析

2.1愈傷組織的誘導(dǎo)

選取75%酒精和0.1 g/L升汞消毒處理，將處理好的短葉對齒蘚外植體接入到100 mL的培養(yǎng)瓶中，每個培養(yǎng)瓶中接入5個外植體，并且將0.5、1.0和1.5 mg/L 6-BA和IAA依次添加到6個培養(yǎng)瓶中，1個對照，該實驗設(shè)置3個重復(fù)。光照培養(yǎng)箱(上海一恒科學有限公司)培養(yǎng)。

40 d后，挑選愈傷組織一樣分別添加0.5 mg/L 6-BA和0.5 mg/L IAA的培養(yǎng)瓶(各1瓶)水平放倒，經(jīng)過5 d后發(fā)現(xiàn)瓶內(nèi)植株長勢快速，在愈傷組織下方產(chǎn)生大量深綠色、致密、墊狀的原絲體，原絲體增多，微小的配子體植株數(shù)量也很多，而呈直立放置的0.5 mg/L 6-BA和0.5 mg/L IAA培養(yǎng)瓶中愈傷長勢較慢、明顯稀疏。這體現(xiàn)了濕度條件對植物發(fā)育的影響(圖1)。50 d后觀察發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶中愈傷組織未繼續(xù)增殖，并開始出現(xiàn)很多褐色的原絲體，這可能是老化的表現(xiàn)，也可能是次生代謝物造成的影響。60 d后將有褐色原絲體的短葉對齒蘚無菌苗和愈傷組織重新進行繼代培養(yǎng)10瓶，并在培養(yǎng)基中加入了1%的活性炭，以防止褐變、老化現(xiàn)象的發(fā)生。經(jīng)過12 d的培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，除了1瓶被污染外(整瓶顏色呈紫紅色，屬于一種細菌污染)，其余9瓶長得非常好，污染率僅1%，而且之前產(chǎn)生的次生代謝物明顯被活性炭所吸收，有更多的原絲體和配子體出現(xiàn)在培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)得到的短葉對齒蘚植株非常健壯，長出來的小植株苗通過顯微鏡觀察測量了它們的高度：最短的植株是0.11 mm，最長的是1.2 mm。

2.2愈傷組織的分化

再一次選取IAA和6-BA這2種植物激素，將愈傷組織誘導(dǎo)中生長狀況良好，大小一致的愈傷組織轉(zhuǎn)接到添加不同濃度(0.1 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L)生長激素的Knop分化培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)皿中接3塊愈傷組織。

CK是對照組，不添加任何激素；1號培養(yǎng)基中加入0.5 mg/L IAA；2號培養(yǎng)基中加入0.1 mg/L 6-BA；3號培養(yǎng)基中加入1.0 mg/L 6-BA；4號培養(yǎng)基中加入0.5 mg/L 6-BA；5號培養(yǎng)基中加入1.0 mg/L IAA；6號培養(yǎng)基中加入0.1 mg/L IAA。

經(jīng)過10 d后觀察記錄,結(jié)果顯示：對照組CK中愈傷組織周圍經(jīng)過再分化都長出了嫩綠色的原絲體；1號中培養(yǎng)基顏色發(fā)黃，愈傷組織無分化；2號愈傷組織周圍長出極少數(shù)的原絲體，但其上長出的配子體最多；3號培養(yǎng)基中出現(xiàn)少數(shù)的原絲體，配子體分化較多；4號培養(yǎng)基中只有2個愈傷組織周圍長出一點原絲體，配子體居多；5號培養(yǎng)基中顏色發(fā)黃，

愈傷組織無分化；6號培養(yǎng)基中有2個長出了原絲體，統(tǒng)計結(jié)果見表1。只有添加了6-BA的2號、3號和4號的培養(yǎng)基中長出了配子體，表明6-BA可以促進愈傷組織分化形成配子體；而不添加任何激素的對照組中原絲體最多，生長最好；低濃度的IAA(0.1 mg/L)有助于愈傷組織分化形成原絲體。

對上述生長90 d后的原絲體和配子體再1次拍照記錄，結(jié)果如圖2。在3種濃度的IAA中，0.1mg/L IAA分化出的原絲體最長，直徑最大(圖2，A、G)；而1.0 mg/L IAA中原絲體短而稠密，呈鮮綠色(圖2，C)；0.5 mg/L IAA原絲體相對較長，呈黃綠色(圖2，B)。不同濃度的6-BA中，0.1 mg/L的6-BA和0.5 mg/L 6-BA中都有配子體(圖2，D、E)，但1.0 mg/L的6-BA中配子體很少，原絲體居多(圖2，F(xiàn))。

表1　激素對愈傷組織分化的影響Table 1　Effect of hormones on callus differentiation

注：+表示有；++表示較多；+++表示很多；-表示無

Note: +A few; ++ More; +++ The most; - None

A. 0.5 mg/L IAA誘導(dǎo)形成的愈傷；B. 20倍解剖鏡下拍攝的配子體；C. 0.5 mg/L 6-BA誘導(dǎo)形成的愈傷；D. 30倍解剖鏡下拍攝的愈傷圖1　40 d后的愈傷組織A. Cullus induced by 0.5 mg/L IAA; B. Gametophyte filmed in 20 times anatormical lens; C. Cullus induced by 0.5 mg/L 6-BA; D. Cullus filmed in 30 times anatormical lensFig.1　The callus after 40 days

A～C依次為0.1、0.5、 1.0 mg/L IAA分化出的原絲體；D～F依次為0.1、0.5、1.0 mg/L 6-BA分化出的配子體及原絲體；CK為對照，G為35倍解剖鏡下拍攝的0.1 mg/L IAA分化出的原絲體圖2　90 d后生長的配子體和原絲體A-C. Protonemata differentiated by 0.1, 0.5 and 1.0 mg/L IAA, respectively; D-F. Gametophyte differentiated by 0.1, 0.5 and 1.0 mg/L 6-BA, respectively; CK. Contrast; G. Filmed in 35 times anatormical lens of the protonemata differentiated by 0.1 mg/L IAAFig. 2　Growth of gametophyte and protonemata after 90 days

3　討　論

本研究通過組織培養(yǎng)技術(shù)成功建立了短葉對齒蘚配子體的再生體系，獲得了大量純凈、均一化的組培植物材料，以供后續(xù)試驗之用。主要研究結(jié)論如下：

(1)短葉對齒蘚配子體最佳消毒方法為：用蒸餾水浸泡0.5 h左右，將其在流水下沖洗20～30 min，再用超聲波洗滌3次，然后用濃度為75%酒精浸泡30 s和0.1 g/L升汞消毒90～120 s，無菌水漂洗至少3次。

(2)短葉對齒蘚愈傷組織誘導(dǎo)中，培養(yǎng)基中添加不同激素及其不同濃度有不同的影響。1.0 mg/L 6-BA容易誘導(dǎo)外植體形成原絲體；0.5 mg/L 6-BA和IAA單獨添加時都可以誘導(dǎo)短葉對齒蘚形成愈傷。濕度增加會促進原絲體生長，水平放倒的培養(yǎng)瓶中原絲體數(shù)量較直立放置的明顯增多；添加1%活性炭可以吸收次生代謝物，有效防止褐化現(xiàn)象產(chǎn)生。

(3)短葉對齒蘚愈傷組織分化中，初期(10 d)不添加任何生長激素的愈傷組織分化形成原絲體最好；到90 d時低濃度的IAA(0.1 mg/L)促進原絲體生長也較好；而較低濃度的6-BA(0.1和0.5 mg/L)促進愈傷組織分化形成配子體數(shù)量較多。

本試驗得出的短葉對齒蘚最佳擴繁條件是：使用Knop培養(yǎng)基，蔗糖濃度為1.5%，IAA和6-BA都能誘導(dǎo)出愈傷組織，但添加低濃度的6-BA和IAA(0.5 mg/L)形成的愈傷組織較好。陳靜文[7]認為糖濃度為2%，同時添加0.05 mg/L 6-BA愈傷組織最好；而添加IAA可長出更多的原絲體。同時她認為培養(yǎng)基中稍加一定量酒石酸銨，pH 6.5，糖濃度為0.5%時，培養(yǎng)在(25±1)℃、3 500 Lx的光照下，小立碗蘚的配子體生長最好。高永強等[6]用不同的植物激素誘導(dǎo)牛角蘚的愈傷組織，認為GA3和2,4-D效果最好；IAA和GA3對苔蘚的原絲體和蒴柄的生長有促進效果。李艷紅等[9]培養(yǎng)立碗蘚原絲體時，發(fā)現(xiàn)0.5 mg/L 2,4-D和6-BA能長出愈傷。而對于白云鄂博礦區(qū)的短葉對齒蘚，IAA和6-BA都能誘導(dǎo)出愈傷組織，并且濃度不同的6-BA對短葉對齒蘚愈傷誘導(dǎo)影響很大。而且關(guān)于原絲體變成褐色這種現(xiàn)象，潘一廷等[10]報道認為可能是細胞內(nèi)多酚氧化物增加、積累從而被多酚酶氧化后造成的；魏華等[11]報道從苔蘚植物中分離到的次生代謝物質(zhì)有生物堿、黃酮、萜類、木脂體和酚類化合物等。就次生物質(zhì)來講，凡是被子植物中有的苔蘚植物中都有。然而加入活性炭后可將苔蘚植物分泌的次生代謝物吸收。曾有人報道6-BA濃度為1.5 mg/L時原絲體分化出芽體；然而白云鄂博礦區(qū)的短葉對齒蘚愈傷組織在0.1 mg/L 6-BA中分化出的芽體最多，而不添加任何激素的培養(yǎng)基中愈傷組織分化出的原絲體團數(shù)最大。

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(編輯:宋亞珍)

Tissue Culture ofDidymodontectorum

GAO Yeqing, REN Dongmei*, ZHAO Xiaodan, ZHAO Dongping, SUI Yanhong

(College of Life Science, Inner Mongolia University, Hohhot 010021, China)

WithDidymodontectorumcollected from the main mine of Baiyun obo as experimental material, we studied the effect of different disinfectants and different concentrations of plant hormone 6-BA and IAA, respectively on callus induction and differentiation. It showed that the best disinfectant forD.tectorumgametophyte is 75% alcohol immersion for 30 s and 0.1 g/L mercuric chloride for 90 s. Using Knop medium to culture the upper stem-leaf segments ofD.tectorum, and a low concentration of 6-BA (0.1 mg/L) promotes callus differentiation and gametophyte formation. However, high concentration of 6-BA (1.0 mg/L) restrains the callus formation. IAA helps protonemata germinate.

Didymodontectorum; tissue culture; plant hormone

1000-4025(2016)09-1900-05doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.09.1900

2016-04-05;修改稿收到日期:2016-08-18

國家自然科學基金(31360142, 31260046)；內(nèi)蒙古大學高層次人才引進項目

高葉青(1991-)，女，在讀碩士研究生，主要從事苔蘚植物組織培養(yǎng)研究。E-mail:1562405242@qq.com

任冬梅，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事苔蘚植物分類及區(qū)系生態(tài)研究。E-mail: rendongmei1970@aliyun.com

Q813.1; Q949.35

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