ARDS大鼠血小板MEK1磷酸化水平變化研究

劉 宏，范曉枝,2，田新強(qiáng)，李 冰

（1.山西大同大學(xué)呼吸病與職業(yè)病研究所，山西大同037009；2.臨汾市第四人民醫(yī)院呼吸科，山西臨汾041000）

ARDS大鼠血小板MEK1磷酸化水平變化研究

劉 宏1，范曉枝1,2，田新強(qiáng)1，李 冰1

（1.山西大同大學(xué)呼吸病與職業(yè)病研究所，山西大同037009；2.臨汾市第四人民醫(yī)院呼吸科，山西臨汾041000）

目的探討急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）時(shí)血小板活化的信號(hào)通路。方法30只健康大鼠隨機(jī)分為5組。實(shí)驗(yàn)組4組，尾靜脈注射油酸（0.25ml/kg）制備ARDS模型；對(duì)照組1組，尾靜脈注射等量生理鹽水。注射油酸后2，6，24，72 h，注射生理鹽水后2 h，從腹主動(dòng)脈采血，分離血小板，提取血小板蛋白，用Western blotting技術(shù)檢測(cè)血小板內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信號(hào)通路上的主要蛋白激酶之一絲裂原活化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（MEK1）的磷酸化水平變化，探討ARDS時(shí)血小板MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變及其與ARDS發(fā)病的關(guān)系。結(jié)果6～72 h實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物血小板內(nèi)MEK1磷酸化水平明顯增高，在72 h表達(dá)量最高（P＜0.05）。結(jié)論ARDS時(shí)血小板發(fā)生了活化；其活化過(guò)程與MEK1-ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路啟動(dòng)有關(guān)。

急性呼吸窘迫綜合癥；血小板活化；絲裂原活化蛋白激酶；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；絲裂原活化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1

急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是一種由多種致病因素引起的以呼吸窘迫、進(jìn)展迅速、持續(xù)低氧血癥、肺部大面積病變?yōu)樘卣鞯募毙院粑ソ?，是臨床常見(jiàn)急危重病癥，治療困難，病死率較高。雖然近50年來(lái)醫(yī)學(xué)界對(duì)之進(jìn)行了大量研究，但其詳細(xì)的發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚。本課題組在既往研究中發(fā)現(xiàn)，ARDS時(shí)血液循環(huán)中存在高凝狀態(tài)，血小板發(fā)生活化并可能在ARDS發(fā)病中起重要作用[1]。本研究在既往研究基礎(chǔ)上，探討ARDS時(shí)血小板活化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而探討ARDS發(fā)病的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型制備

健康SD大鼠30只，體質(zhì)量250 g～400 g，隨機(jī)分為5組，每組6只。實(shí)驗(yàn)組（OA組）4組，尾靜脈注射油酸（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑公司產(chǎn)品）0.25 mL/kg制備ARDS模型。對(duì)照組（NS組）1組，尾靜脈注射等量生理鹽水。注射油酸后2，6，24，72 h，注射生理鹽水后2 h，處死動(dòng)物，取樣檢測(cè)。

1.2 肺濕/干重比值測(cè)定和病理學(xué)檢查

動(dòng)物處死后，立即開(kāi)胸取肺做大體觀察，稱(chēng)肺質(zhì)量并計(jì)算肺系數(shù)（肺系數(shù)=肺質(zhì)量/體質(zhì)量×100%）。左肺置10%福爾馬林溶液中固定1周后，按常規(guī)病理學(xué)方法切片，HE染色，光鏡觀察。右肺稱(chēng)重后置80℃烤箱內(nèi)烘干至恒重，計(jì)算肺濕/干重比值（R w/d）。

1.3 絲裂原活化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（MEK1）磷酸化水平測(cè)定

在注射油酸后2，6，24，72 h，注射生理鹽水后2 h，從動(dòng)物腹主動(dòng)脈采血，分離血小板，提取血小板蛋白,采用Western blotting技術(shù)檢測(cè)血小板內(nèi)MEK1的磷酸化水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本文中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用Graphpad Prism統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，各組間比較采用單因素方差分析，對(duì)差異顯著者用Newman-Kuels q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，同組數(shù)據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，結(jié)果以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物一般狀態(tài)

實(shí)驗(yàn)組大鼠在注射油酸后2～3 min即開(kāi)始出現(xiàn)呼吸困難，呼吸幅度增大，癱軟無(wú)力，活動(dòng)減少，行走時(shí)呈爬行步態(tài)，進(jìn)飲食減少;24 h后動(dòng)物一般狀態(tài)好轉(zhuǎn)；至72 h，活動(dòng)基本恢復(fù)正常。對(duì)照組無(wú)異常變化。

2.2 動(dòng)物肺系數(shù)和肺濕/干重比值變化

動(dòng)物肺系數(shù)和肺濕/干重比值變化見(jiàn)表1。從表中可見(jiàn)，注射油酸后2～24 h，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物體質(zhì)量、肺系數(shù)和肺濕/干重比值均有不同程度增加，以2 h最嚴(yán)重。對(duì)照組上述各項(xiàng)均無(wú)異常變化。

表1 各組動(dòng)物肺系數(shù)和肺濕/干重比值(±s)

表1 各組動(dòng)物肺系數(shù)和肺濕/干重比值(±s)

注：①OA=Oleic Acid。②*為與對(duì)照組相比P≤0.05

NS OA 2 h OA 6 h OA 24 h OA 72 h 354.2±60.2 368.5±46.0 372.8±39.6 406.7±40.0 252.5±5.2 2.2±0.7 4.8±1.1*4.1±0.8*3.6±0.3*2.4±0.3*0.6±0.1 1.3±0.2*1.1±0.1*0.9±0.1*0.9±0.1*3.3±0.3 6.0±0.6*5.6±0.2*5.3±1.4*4.8±0.7*

2.3 肺組織病理學(xué)檢查

肉眼觀察可見(jiàn)，對(duì)照組大鼠肺臟呈粉紅色，表面光滑，紋理清晰，大小正常；2～24 h實(shí)驗(yàn)組大鼠雙肺明顯腫脹，體積增大，重量增加，外觀呈紫紅色花斑狀；72 h實(shí)驗(yàn)組，肺臟腫脹減輕，外觀呈灰白色，彈性差。光鏡下，對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔干凈，肺泡壁無(wú)增厚；實(shí)驗(yàn)組2～24 h各組均有輕重不一的肺泡水腫和間質(zhì)水腫，肺泡內(nèi)可見(jiàn)有多量染色深紅均一的蛋白滲出物，肺泡、肺間質(zhì)出血，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，小血管擴(kuò)張、充血；72 h組，肺泡腔炎性滲出大部分吸收，肺泡腔縮小，肺泡間隔增厚，炎細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，纖維組織增生，有微血栓形成。

2.4 血小板內(nèi)MEK1磷酸化水平變化

各組動(dòng)物血小板MEK1磷酸化水平如圖1所示。與對(duì)照組相比，6～72 h實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物血小板內(nèi)蛋白激酶MEK1磷酸化水平明顯增高，在72 h表達(dá)量最高（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠血小板MEK1磷酸化水平

3 討論

ARDS是臨床上比較常見(jiàn)的疾病，早期階段或輕癥曾被稱(chēng)為急性肺損傷(ALI)。在美國(guó)，每年發(fā)病約20萬(wàn)例，死亡率接近50%[2]。它可由多種病因引起，但詳細(xì)發(fā)病機(jī)理尚未不清楚。

近年科學(xué)界對(duì)血小板的功能特性有了不少新的發(fā)現(xiàn)，使得人們對(duì)血小板在呼吸系統(tǒng)分子和細(xì)胞生物學(xué)中所起作用的看法發(fā)生了改變[3]。除參與止血及血栓形成外，血小板還參與免疫、炎癥、動(dòng)脈硬化、血管生成、淋巴管發(fā)育、腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移等病理過(guò)程[4-8]。血小板能表達(dá)多免疫受體(例如CD14，TLRs,FcR，CD40等)，釋放大量接近活化的細(xì)胞因子(如IL1β,MCP-1，TGFβ,CD40L，RANTES等)。這些受體、細(xì)胞因子共同使血小板吸引白細(xì)胞到血管損傷點(diǎn)，釋放炎性因子，產(chǎn)生微顆粒物質(zhì)，誘發(fā)凝血酶的生成。已證明這些過(guò)程對(duì)膿毒癥、動(dòng)脈粥樣硬化、肝炎、急性肺損傷、血管再狹窄和移植排斥反應(yīng)等疾患的發(fā)病過(guò)程至關(guān)重要[6]。

在生理狀態(tài)和在ARDS時(shí)，血小板、血小板前體與肺有多個(gè)級(jí)別的交互活動(dòng),血小板在ARDS時(shí)發(fā)生活化并可能在ARDS發(fā)病中起重要作用[3,9-10]，但其時(shí)血小板活化的具體機(jī)制和信號(hào)傳導(dǎo)通路仍不清楚。絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信號(hào)通路是細(xì)胞跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中具有至關(guān)重要作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，由一大群絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶組成。該信號(hào)通路存在于許多細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞外刺激信號(hào)向細(xì)胞及其核內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)并引起細(xì)胞發(fā)生生物學(xué)反應(yīng)的過(guò)程中起重要作用。在高等哺乳類(lèi)動(dòng)物的細(xì)胞內(nèi)主要有3條并行的三級(jí)聯(lián)MAPKs信號(hào)通路：細(xì)胞外調(diào)節(jié)的蛋白激酶(ERKs)信號(hào)通路，c-Jun氨基末端蛋白激酶(JNKs)信號(hào)通路和p38蛋白激酶(p38 kinase，p38 MAPK)信號(hào)通路。不同的細(xì)胞外刺激使用其中不同的通路，通過(guò)各條通路的相互調(diào)控而介導(dǎo)不同的細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)。

MEK1是ERKs通路上第二級(jí)聯(lián)的一個(gè)重要蛋白激酶[11]。它可使絲氨酸/蘇氨酸發(fā)生磷酸化，選擇性地激活ERK1和ERK2。目前有關(guān)ARDS時(shí)血液循環(huán)中血小板內(nèi)MEK1-ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究報(bào)道還很少。本研究結(jié)果顯示，6～72 h實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物血液循環(huán)中血小板內(nèi)MEK1蛋白激酶磷酸化水平明顯增高，在72 h表達(dá)量最高（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，ARDS時(shí)血小板發(fā)生了活化并有MEK1-ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的啟動(dòng)；該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的啟動(dòng)可能參與了血小板的活化過(guò)程。我們的研究只是對(duì)ARDS時(shí)血小板活化信號(hào)通路的初步探索，今后還需要大量的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行深入探討。

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Study on the Changes of Platelet MEk1 Phosphorylation Levels in Acute Respiratory Distress Syndrome Rats

LIU Hong1，F(xiàn)AN Xiao-zhi1,2，TIAN Xin-qiang1，LI Bing1
（1.Research Institute of Respiratory and Occupational Diseases，Datong University,Datong Shanxi,037009;2.Department of Respiratory Medicine，The Fourth People's Hospital of Linfen,Linfen Shanxi,041000)

Objective To investigate the signal pathway of platelet activation in acute respiratory distress syndrome(ARDS).Methods 30 healthy rats were randomly divided into 5 groups.4 groups of them were as the experimental group,which were made AR?DS rat models by intravenous injection of oleic acid(OA,0.25ml/kg).1 of 5 groups was as control group,was injected normal saline(NS)in same dose by intravenous.After injection of oleic acid 2 h,6h,24h,72h,saline 2h,drawing off blood from the abdominal aorta;sepa?rating platelets;extractting platelet protein;detecting platelet mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase 1（MEK1）phos?phorylation levels by Western blotting method,which is one of major protein kinases in the mitogen-activated protein kinases(MAPKs)signal pathway,to explore the changes of platelet MAPKs signal transduction pathway in ARDS,and the relationship between the changes and the pathogenesis of ARDS.Results Platelet MEK1 phosphorylation levels were significantly increased in 6～72h experi?mental animals;the highest expression at 72h(P＜0.05).Conclusion Platelet activation occurs in ARDS;the activation process of plate?lets are related with MEK1-ERK1/2 signaling pathway.

acute respiratory distress syndrome（ARDS）;platelet activation;mitogen-activated protein kinases(MAPKs);signal transduction;mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase 1（MEK1）

R563.8

A

1674-0874(2016)05-0046-03

2016-06-16

山西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目[2013011055-5];大同市基礎(chǔ)研究項(xiàng)目[2014105-2]

劉宏(1957-)，男，山西大同人，博士，教授，研究方向：內(nèi)科呼吸系統(tǒng)疾病和職業(yè)性肺病。

〔責(zé)任編輯 楊德兵〕