• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    miR—148b對(duì)肝癌SMMC7721細(xì)胞衰老的影響

    2016-10-21 16:46:58張軍港石英黃東勝張成武洪德飛
    中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生 2016年5期
    關(guān)鍵詞:明顯增加癌基因糖苷酶

    張軍港 石英 黃東勝 張成武 洪德飛

    [摘要] 目的 探討miR-148b對(duì)肝癌SMMC7721細(xì)胞衰老的影響。 方法 分別使用50 nmol/L的miR-148b mimics(miR-148b)和negative control(miR-NC)轉(zhuǎn)染肝癌SMMC7721細(xì)胞48 h后,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)miR-148b表達(dá)的變化。通過(guò)β-半乳糖苷酶染色法檢測(cè)細(xì)胞衰老的變化,應(yīng)用western blot檢測(cè)P21表達(dá)的影響。 結(jié)果 與對(duì)照組相比,miR-148b能明顯增加肝癌SMMC7721細(xì)胞中miR-148b的表達(dá)。50 nmol/L的 miR-148b轉(zhuǎn)染SMMC7721細(xì)胞48 h后,細(xì)胞形態(tài)變得大而扁平,衰老細(xì)胞比例明顯增加[(9.67±2.08)% vs (43.67±3.51)%,P<0.01]。miR-148b使肝癌細(xì)胞P21蛋白的表達(dá)也明顯增加。 結(jié)論 miR-148b可能通過(guò)影響P21的表達(dá)促進(jìn)肝癌SMMC7721細(xì)胞的衰老,miR-148b有可能成為肝癌SMMC7721細(xì)胞生物治療的新靶點(diǎn)。

    [關(guān)鍵詞] 肝癌;miR-148b;衰老;P21

    [中圖分類號(hào)] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701(2016)05-0025-04

    microRNAs是一類長(zhǎng)度為20~24 bp、具有基因調(diào)控功能的非編碼小分子RNA,主要通過(guò)影響mRNA的穩(wěn)定及翻譯調(diào)控基因表達(dá)功能[1]。大量研究發(fā)現(xiàn),microRNAs在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、衰老等多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[2-4]。miR-148b在多種腫瘤中異常表達(dá),與腫瘤的生物學(xué)功能及預(yù)后密切相關(guān)。前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-148b在肝癌組織和細(xì)胞中低表達(dá),與肝癌的增殖侵襲密切相關(guān)[5,6],目前miR-148b對(duì)肝癌細(xì)胞衰老的影響機(jī)制尚不清楚。本研究在2013年10~12月將50 nmol/L的miR-148b的類似物轉(zhuǎn)染肝癌SMMC7721細(xì)胞48 h后,觀察對(duì)細(xì)胞衰老特性及衰老相關(guān)蛋白P21的影響,為探討miR-148b作為肝癌治療靶點(diǎn)提供基礎(chǔ)依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 材料與方法

    1.1 一般材料

    RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco BRL公司, 肝癌細(xì)胞系SMMC7721購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色試劑盒購(gòu)自碧云天生物有限公司。miR-148b mimics(miR-148b)和negative control(miR-NC)轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)有限公司。LipofectmanineTM2000及Trizol試劑均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。兔抗人P21和GAPDH一抗購(gòu)自美國(guó) Santa Cruz公司,辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的二抗購(gòu)自武漢博士德公司。

    1.2 方法

    1.2.1 常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng) 肝癌SMMC7721細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基,在37℃、含5%CO2培育箱下常規(guī)培養(yǎng)。

    1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR) 采用TaKaRa公司的試劑盒,miR-148b和內(nèi)參U6的引物探針由廣州瑞博公司設(shè)計(jì)合成。miR-148b:5-AAGTTCTGTTATACACTCAGGC-3,內(nèi)參基因U6:5-CTCGCTTCGGCA-GCACA-3。反應(yīng)體系為 SYBRR Green qRT-PCR Mix(2×)10 μL,PCR Forward Primer和Reverse Primer各0.4 μL,ROX 0.4 μL,ddH2O 7.8 μL,cDNA 1 μL。其反應(yīng)條件:95 ℃ 30 s,95℃ 5 s, 60℃ 30 s×40循環(huán),儀器為ABI公司7500型Real-time PCR儀。ABI step-one附帶qRT-PCR分析軟件分析CT(cycle threshold)值。目的基因RNA的相對(duì)表達(dá)量=2-Δ Δ CT, Δ Δ CT=待測(cè)樣本(CT目的基因-CT內(nèi)參)-對(duì)照組(CT目的基因-CT內(nèi)參)。

    1.2.3 β-半乳糖苷酶染色法檢測(cè)細(xì)胞衰老 轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后離心后重懸,以1×105個(gè)/孔接種于12孔培養(yǎng)板中,貼壁 24 h 后用細(xì)胞衰老檢測(cè)試劑盒染色,在37℃孵育過(guò)夜,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)均勻一致藍(lán)色細(xì)顆粒表示β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性,即細(xì)胞出現(xiàn)衰老改變。

    1.2.4 Western blot檢測(cè)P21蛋白的變化 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h后, 提取細(xì)胞蛋白??偟鞍滋崛》椒▍⒄誃eyotime公司操作說(shuō)明進(jìn)行。分別將相同適量蛋白含量的樣品和2×蛋白上樣緩沖液等體積混合,沸水中煮5 min使蛋白變性,10% SDS-PAGE電泳后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,然后 5 g/L脫脂奶粉封閉,加入1:1000稀釋的一抗,4℃過(guò)夜,加入1∶2000稀釋的二抗,室溫1 h,TBS漂洗膜,ECL增強(qiáng)發(fā)光,X線曝光。以GAPDH蛋白作為內(nèi)參照,BANDSCAN圖像分析軟件光密度積分值分析。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 13.0進(jìn)行分析,經(jīng)方差齊性檢驗(yàn),數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布,所有數(shù)據(jù)以(x±s)表示,組間差異比較采用t檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 miR-148b對(duì)肝癌SMMC7721細(xì)胞中miR-148b表達(dá)的影響

    將50 nmol/L miR-148b或miR-NC作用SMMC 7721細(xì)胞48 h,采用qRT-PCR的方法,檢測(cè)miR-148b表達(dá)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比(1.00±0.08),miR-148b明顯增加了肝癌細(xì)胞miR-148b的表達(dá)(151.22±9.77),差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=21.73,P<0.01)(圖1)。

    2.2 miR-148b對(duì)肝癌SMMC7721細(xì)胞衰老的影響

    將50 nmol/L miR-148b 或miR-NC作用SMMC7721細(xì)胞48 h,采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,miR-148b處理組的部分細(xì)胞形態(tài)變得更加大而扁平(封三圖1A)。進(jìn)一步采用β-半乳糖苷酶染色檢測(cè)細(xì)胞衰老變化。結(jié)果顯示,與對(duì)照組(9.67±2.08)%相比,miR-148b引起的衰老細(xì)胞比率明顯增加(43.67±3.51)%,差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.42,P<0.01)(封三圖1B)。

    2.3 miR-148b對(duì)肝癌SMMC7721細(xì)胞衰老相關(guān)p21蛋白的影響

    采用Western blot方法檢測(cè)P21蛋白變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,50 nmol/L的miR-148b作用SMMC 7721細(xì)胞48 h后,P21蛋白的表達(dá)明顯增加(圖2A)。具體灰度值變化見圖2B(灰度值:1.16±0.02 vs 0.77±0.03),差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.89,P<0.01)(圖2B)。

    3 討論

    肝癌是世界上死亡率最高的惡性腫瘤之一。由于肝癌的發(fā)病隱匿,早期無(wú)特異性的臨床癥狀,且病程進(jìn)展迅速,當(dāng)患者出現(xiàn)明顯的自覺(jué)癥狀時(shí),往往已到了中晚期[7]。目前肝癌的治療仍以手術(shù)為主,而不能手術(shù)的患者則以化療為主。手術(shù)的效果受限于手術(shù)時(shí)機(jī),而化療藥物易產(chǎn)生耐藥性、腫瘤殺傷效率不高。因此迫切需要尋找有效地早期生物標(biāo)志物機(jī)開發(fā)新的有效藥物治療肝癌。

    肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素多步驟多階段的病理過(guò)程, 涉及到很多相關(guān)癌基因和抑癌基因的變化。研究結(jié)果顯示,microRNA可能通過(guò)類似于抑癌基因、癌基因或其它方式來(lái)調(diào)控腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過(guò)程,表現(xiàn)為同抑癌基因或癌基因相似的生物學(xué)效應(yīng)[8]。microRNA主要通過(guò)與特定靶基因mRNA 的 3-非翻譯區(qū)(3-UTR)完全或不完全配對(duì),導(dǎo)致靶基因mRNA降解或翻譯抑制,從而參與個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡、分化、衰老和代謝等生命活動(dòng)的調(diào)控[2,9,10]。

    近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)miR-148b參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。Ghasemkhani N等[11]研究發(fā)現(xiàn)miR-148b在肺癌中低表達(dá),同肺癌的TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后密切相關(guān)。Zhao等[12]研究發(fā)現(xiàn)miR-148b在胰腺癌低表達(dá),通過(guò)影響AMPKα1信號(hào)通路影響腫瘤的生物學(xué)行為。我們前期已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miR-148b在肝癌中低表達(dá),通關(guān)過(guò)調(diào)控WNT1/β-catenin通路抑制肝癌的增殖和侵襲行為[5]。然而miR-148b同肝癌細(xì)胞衰老的關(guān)系未做進(jìn)一步研究。細(xì)胞衰老是指細(xì)胞不可逆地離開細(xì)胞周期、發(fā)生形態(tài)及細(xì)胞學(xué)改變的現(xiàn)象。細(xì)胞衰老作為細(xì)胞潛在的抗腫瘤機(jī)制,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要屏障作用,能夠有效防止腫瘤發(fā)生[13,14]。

    本研究結(jié)果顯示miR-148b能夠使SMMC7721中的miR-148b表達(dá)明顯增加,miR-148b使SMMC 7721細(xì)胞的形態(tài)變得大而扁平,呈現(xiàn)出衰老狀態(tài)。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)miR-148b使β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)目明顯增加,進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-148b能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞衰老,使肝惡性腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為發(fā)生一定程度逆轉(zhuǎn)。

    P21是細(xì)胞周期調(diào)控家族的重要成員之一,是依賴于細(xì)胞周期蛋白激酶(CDK)的抑制物,它能夠通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期過(guò)程,參與細(xì)胞的增殖、分化、衰老及死亡過(guò)程[15-17]。已知P21是通過(guò)依賴p53和不賴p53的途徑調(diào)節(jié)的。既往研究發(fā)現(xiàn),P21能增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)的ROS水平,而ROS的抑制劑N-乙酰半胱氨酸能夠明顯阻止P21誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老,表明P21可能通過(guò)ROS積聚機(jī)制誘導(dǎo)衰老[18]。Hu B等[19]研究發(fā)現(xiàn)女貞果實(shí)提取物通過(guò)正調(diào)控P21誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的衰老和凋亡。既往研究發(fā)現(xiàn)阿霉素能夠誘導(dǎo)結(jié)腸癌野生型HCT-116細(xì)胞發(fā)生衰老樣生長(zhǎng)停滯,而這種作用對(duì)敲除P21的HCT-116細(xì)胞株作用大大降低,表明P21在結(jié)腸癌的衰老過(guò)程中起重要作用[20]。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-148b能夠使P21蛋白的表達(dá)量明顯增加,表明miR-148b可能通過(guò)調(diào)通P21的表達(dá)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的衰老過(guò)程。

    綜上所述,本研究結(jié)果顯示,miR-148b能夠通過(guò)調(diào)控P21來(lái)誘導(dǎo)肝癌SMMC7721細(xì)胞衰老,我們將進(jìn)一步深入研究miR-148b在肝癌中的功能和調(diào)控分子機(jī)制,系統(tǒng)闡明miR-148b參與肝癌發(fā)生發(fā)展可能的機(jī)制,為肝癌的治療提供新的靶點(diǎn)。

    [參考文獻(xiàn)]

    [1] Lundmark M,K?覬rner CJ,Nielsen TH. Global analysis of microRNA in Arabidopsis in response to phosphate starvation as studied by locked nucleic acid-based microarrays[J]. Physiol Plant,2010,140(1):57-68.

    [2] Hata A,Lieberman J. Dysregulation of microRNA biogenesis and gene silencing in cancer[J]. Sci Signal,2015,8(368):re3.

    [3] Zhu X,Wu L,Yao J,et al. MicroRNA let-7c inhibits cell proliferation and induces cell cycle arrest by targeting CDC25A in Human hepatocellular carcinoma[J]. PLoS One,2015,10(4):e0124266.

    [4] Ramalinga M,Roy A,Srivastava A,et al. MicroRNA-212 negatively regulates starvation induced autophagy in prostate cancer cells by inhibiting SIRT1 and is a modulator of angiogenesis and cellular senescence[J]. Oncotarget,2015,6(33):34446-34457.

    [5] Zhang JG,Shi Y,Hong DF,et al. MiR-148b suppresses cell proliferation and invasion in hepatocellular carcinoma by targeting WNT1/β-catenin pathway[J]. Sci Rep,2015, 5:8087.

    [6] Sadeghian Y,Kamyabi-Moghaddam Z,Nodushan SM,et al. Profiles of tissue microRNAs,miR-148b and miR-25 serve as potential prognostic biomarkers for hepatocellular carcinoma[J]. Tumour Biol,2015. [Epub ahead of print]

    [7] Parkin DM,Bray F,F(xiàn)erlay J,et al. Global cancer statistics,2002[J]. CA Cancer J Clin,2005,55(2):74-108.

    [8] Valeri N,Braconi C,Gasparini P,et al. MicroRNA-135b promotes cancer progression by acting as a downstream effector of oncogenic pathways in colon cancer[J]. Cancer Cell,2014,25(4):469-483.

    [9] Liu C,Lou CH,Shah V,et al. Identification of microRNAs and microRNA Targets in Xenopus gastrulae:The role of miR-26 in the regulation of Smad1[J]. Dev Biol,2015. pii:S0012-1606(15)30277-3.

    [10] Li J,Wan X,Qiang W,et al. MiR-29a suppresses prostate cell proliferation and induces apoptosis via KDM5B protein regulation[J]. Int J Clin Exp Med,2015,8(4):5329-5339.

    [11] Ghasemkhani N,Shadvar S,Masoudi Y,et al. Down-regulated MicroRNA 148b expression as predictive biomarker and its prognostic significance associated with clinicopathological features in non-small-cell lung cancer patients[J]. Diagn Pathol,2015,10(1):164.

    [12] Zhao G,Zhang JG,Liu Y,et al. MiR-148b functions as a tumor suppressor in pancreatic cancer by targeting AMPKα1[J]. Mol Cancer Ther,2013,12(1):83-93.

    [13] Qi H,Zuo DY,Bai ZS,et al. COH-203,a novel microtubule inhibitor,exhibits potent anti-tumor activity via p53-dependentsenescence in hepatocellular carcinoma[J].Biochem Biophys Res Commun,2014,455(3-4):262-268.

    [14] Gewirtz DA,Holt SE,Elmore LW. Accelerated senescence:an emerging role in tumor cell response to chemotherapy and radiation[J]. Biochem Pharmacol,2008, 76(8):947-957.

    [15] Wang C,Chen Z,Ge Q,et al. Up-regulation of p21(WAF1/CIP1) by miRNAs and its implications in bladder cancer cells[J]. FEBS Lett,2014,588(24):4654-4664.

    [16] Romanov VS,Pospelov VA,Pospelova TV. Cyclin-dependent kinase inhibitor p21(Waf1):Contemporary view on its role in senescence and oncogenesis[J]. Biochemistry(Mosc),2012,77(6):575-584.

    [17] Chen TC,Wadsten P,Su S,et al. The type Ⅳ phosphodiesterase inhibitor rolipram induces expression of the cell cycle inhibitors p21(Cip1) and p27(Kip1),resulting in growth inhibition,increased differentiation,and subsequent apoptosis of malignant A-172 glioma cells[J]. Cancer Biol Ther,2002,1(3):268-276.

    [18] Macip S,Igarashi M,F(xiàn)ang L,et al. Inhibition of p21-mediated ROS accumulation can rescue p21-induced senescence[J]. EMBO J,2002,21(9):2180-2188.

    [19] Hu B,Du Q,Deng S,et al. Ligustrum lucidum Ait. fruit extract induces apoptosis and cell senescence in human hepatocellular carcinoma cells through upregulation of p21[J]. Oncol Rep,2014,32(3):1037-1042.

    [20] Chang BD,Xuan Y,Broude EV,et al. Role of p53 and p21waf1/cip1 in senescence-like terminal proliferation arrest induced in human tumor cells by chemotherapeutic drugs[J]. Oncogene,1999,18(34):4808-4818.

    (收稿日期:2015-11-05)

    猜你喜歡
    明顯增加癌基因糖苷酶
    黃河在咆哮
    知母中4種成分及對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用
    中成藥(2018年5期)2018-06-06 03:11:58
    木蝴蝶提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用
    中成藥(2017年8期)2017-11-22 03:19:32
    法國(guó)針對(duì)華人暴力搶劫增加
    人民周刊(2016年17期)2016-11-05 21:29:41
    神回復(fù)
    家庭百事通(2016年9期)2016-09-08 18:03:13
    抑癌基因P53新解讀:可保護(hù)端粒
    健康管理(2016年2期)2016-05-30 21:36:03
    探討抑癌基因FHIT在皮膚血管瘤中的表達(dá)意義
    抑癌基因WWOX在口腔腫瘤的研究進(jìn)展
    六種花提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性研究
    抑癌基因p53在裸鼴鼠不同組織中表達(dá)水平的差異
    久久香蕉国产精品| 国产三级在线视频| 亚洲国产精品sss在线观看 | 欧美大码av| 精品午夜福利视频在线观看一区| 在线观看日韩欧美| 免费在线观看亚洲国产| 亚洲欧美精品综合久久99| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 黄色丝袜av网址大全| 国产精品一区二区在线不卡| 91在线观看av| 一边摸一边做爽爽视频免费| ponron亚洲| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 乱人伦中国视频| 久久人人精品亚洲av| 在线观看一区二区三区| 久久香蕉国产精品| 麻豆av在线久日| av福利片在线| 制服人妻中文乱码| 亚洲情色 制服丝袜| 精品卡一卡二卡四卡免费| 欧美大码av| 日日爽夜夜爽网站| 久久影院123| 在线观看免费高清a一片| 高清欧美精品videossex| 欧美日韩精品网址| 亚洲 国产 在线| 新久久久久国产一级毛片| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产精品日韩av在线免费观看 | 午夜免费成人在线视频| 日本欧美视频一区| 久久久国产精品麻豆| 高清黄色对白视频在线免费看| 中文欧美无线码| 免费搜索国产男女视频| 交换朋友夫妻互换小说| 69精品国产乱码久久久| 成人18禁在线播放| 我的亚洲天堂| av免费在线观看网站| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产又爽黄色视频| 天堂√8在线中文| 免费观看人在逋| 99riav亚洲国产免费| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产av一区在线观看免费| 国产1区2区3区精品| 日韩免费高清中文字幕av| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 高清毛片免费观看视频网站 | e午夜精品久久久久久久| 久久久久亚洲av毛片大全| 亚洲avbb在线观看| www.www免费av| 久久久久九九精品影院| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 久久影院123| 一级片免费观看大全| 亚洲精品一二三| avwww免费| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产熟女xx| 淫妇啪啪啪对白视频| 日本a在线网址| 久久久水蜜桃国产精品网| 搡老岳熟女国产| 村上凉子中文字幕在线| 国产三级黄色录像| 欧美丝袜亚洲另类 | av电影中文网址| 韩国精品一区二区三区| 日本a在线网址| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲一区中文字幕在线| 国产欧美日韩一区二区三| 亚洲一码二码三码区别大吗| 婷婷丁香在线五月| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲av熟女| 91麻豆av在线| 黄色成人免费大全| www.999成人在线观看| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产精品 欧美亚洲| 国产乱人伦免费视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 成人黄色视频免费在线看| 免费在线观看日本一区| 国产三级在线视频| 在线视频色国产色| 免费高清在线观看日韩| 精品日产1卡2卡| 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲,欧美精品.| 高清毛片免费观看视频网站 | 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲三区欧美一区| 亚洲中文av在线| 热99re8久久精品国产| 美国免费a级毛片| 国产精品久久久av美女十八| 丝袜人妻中文字幕| 两个人看的免费小视频| 国产一区二区三区视频了| 成年人免费黄色播放视频| 久久这里只有精品19| 香蕉久久夜色| 国产精品久久久人人做人人爽| 十八禁人妻一区二区| 亚洲精品久久午夜乱码| 日韩成人在线观看一区二区三区| 18美女黄网站色大片免费观看| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 成人国产一区最新在线观看| 一夜夜www| 精品日产1卡2卡| 久久国产精品影院| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲免费av在线视频| 欧美人与性动交α欧美软件| 丰满的人妻完整版| 视频区图区小说| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 午夜亚洲福利在线播放| 国产高清videossex| 丰满饥渴人妻一区二区三| 一二三四社区在线视频社区8| 精品一区二区三区四区五区乱码| 手机成人av网站| 国产欧美日韩一区二区三| 麻豆国产av国片精品| 色播在线永久视频| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | e午夜精品久久久久久久| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 精品久久久久久,| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 黄频高清免费视频| 亚洲情色 制服丝袜| 自线自在国产av| 免费观看人在逋| www.熟女人妻精品国产| 97碰自拍视频| 日韩大码丰满熟妇| 韩国av一区二区三区四区| 国产一区在线观看成人免费| tocl精华| 热99国产精品久久久久久7| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 日韩大码丰满熟妇| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 精品国产亚洲在线| 男女午夜视频在线观看| 亚洲国产精品999在线| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 国产精品永久免费网站| 久久青草综合色| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲一区二区三区色噜噜 | 中文字幕人妻丝袜制服| 麻豆av在线久日| 很黄的视频免费| 黄色丝袜av网址大全| 91老司机精品| 色播在线永久视频| 色老头精品视频在线观看| 国产av在哪里看| 一夜夜www| 最近最新中文字幕大全电影3 | 搡老乐熟女国产| 日韩欧美国产一区二区入口| 又大又爽又粗| 韩国av一区二区三区四区| 黄色女人牲交| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 亚洲熟女毛片儿| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 成年女人毛片免费观看观看9| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 天堂√8在线中文| 久久草成人影院| 夜夜看夜夜爽夜夜摸 | 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 午夜a级毛片| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产伦一二天堂av在线观看| www.999成人在线观看| 国产成人欧美在线观看| 国产高清视频在线播放一区| 一级,二级,三级黄色视频| 真人做人爱边吃奶动态| 国产主播在线观看一区二区| 交换朋友夫妻互换小说| 精品日产1卡2卡| 亚洲国产精品合色在线| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 久久久久久大精品| 波多野结衣一区麻豆| 精品第一国产精品| 91九色精品人成在线观看| 一二三四在线观看免费中文在| 国产深夜福利视频在线观看| 亚洲激情在线av| 久久久久久久精品吃奶| 一边摸一边抽搐一进一小说| 精品欧美一区二区三区在线| 久久 成人 亚洲| 很黄的视频免费| 午夜免费鲁丝| 9热在线视频观看99| 国产一区二区三区视频了| 99热只有精品国产| 麻豆av在线久日| 亚洲av成人一区二区三| 久久精品影院6| 成人亚洲精品av一区二区 | 夜夜夜夜夜久久久久| 又紧又爽又黄一区二区| 日本a在线网址| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产高清激情床上av| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 日韩视频一区二区在线观看| xxxhd国产人妻xxx| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | xxx96com| 国产av一区二区精品久久| 亚洲欧美激情综合另类| 久久香蕉精品热| 丝袜美腿诱惑在线| 丁香六月欧美| 亚洲,欧美精品.| 大码成人一级视频| 韩国精品一区二区三区| 久9热在线精品视频| 老司机在亚洲福利影院| 90打野战视频偷拍视频| 久久热在线av| 在线视频色国产色| 三级毛片av免费| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 日韩有码中文字幕| 亚洲专区国产一区二区| 日韩欧美免费精品| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲伊人色综图| 中国美女看黄片| 无限看片的www在线观看| 欧美午夜高清在线| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 中文亚洲av片在线观看爽| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 美女大奶头视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲av五月六月丁香网| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 午夜成年电影在线免费观看| 天堂俺去俺来也www色官网| 99re在线观看精品视频| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 免费人成视频x8x8入口观看| 校园春色视频在线观看| 一级黄色大片毛片| 婷婷六月久久综合丁香| 欧美日韩一级在线毛片| 久久精品国产综合久久久| 美女大奶头视频| 国产精品 国内视频| 欧美中文综合在线视频| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲av电影在线进入| 国产成人av教育| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲美女黄片视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 欧美日韩视频精品一区| 中文字幕高清在线视频| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 日韩成人在线观看一区二区三区| 88av欧美| 视频在线观看一区二区三区| 免费在线观看黄色视频的| 精品高清国产在线一区| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 日本黄色视频三级网站网址| 自线自在国产av| 欧美黑人欧美精品刺激| 丝袜人妻中文字幕| 欧美大码av| 国产又爽黄色视频| 亚洲成国产人片在线观看| 999久久久国产精品视频| 国产精品 国内视频| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 男女床上黄色一级片免费看| 久久影院123| 亚洲第一av免费看| 99热国产这里只有精品6| 午夜激情av网站| 欧美日韩乱码在线| 国产精品久久久久成人av| 久久香蕉国产精品| 久久青草综合色| 99热只有精品国产| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 一本大道久久a久久精品| 黑人操中国人逼视频| 久久久久久久久免费视频了| 国产精品综合久久久久久久免费 | 欧美成人免费av一区二区三区| 脱女人内裤的视频| 亚洲专区中文字幕在线| 精品久久久久久久毛片微露脸| 性欧美人与动物交配| 精品国产国语对白av| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 一二三四社区在线视频社区8| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 桃色一区二区三区在线观看| 久久久久久久久中文| 婷婷精品国产亚洲av在线| 日韩精品免费视频一区二区三区| 女性生殖器流出的白浆| 国产黄色免费在线视频| 成人国语在线视频| 美女福利国产在线| av中文乱码字幕在线| 亚洲av第一区精品v没综合| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产成+人综合+亚洲专区| 久久亚洲精品不卡| 18美女黄网站色大片免费观看| 最新美女视频免费是黄的| 九色亚洲精品在线播放| 丰满的人妻完整版| a级毛片在线看网站| 精品日产1卡2卡| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国产黄a三级三级三级人| 长腿黑丝高跟| 久久性视频一级片| 制服人妻中文乱码| 欧美亚洲日本最大视频资源| 精品国产美女av久久久久小说| 国产熟女午夜一区二区三区| 欧美亚洲日本最大视频资源| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 高清黄色对白视频在线免费看| 香蕉久久夜色| 国产亚洲精品久久久久5区| 无限看片的www在线观看| videosex国产| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 免费高清视频大片| 精品国产乱子伦一区二区三区| 国产高清激情床上av| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 午夜视频精品福利| 日韩大码丰满熟妇| 999久久久精品免费观看国产| 男人的好看免费观看在线视频 | 午夜亚洲福利在线播放| 一本大道久久a久久精品| 天天添夜夜摸| 精品国产国语对白av| 99国产综合亚洲精品| 在线观看舔阴道视频| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 51午夜福利影视在线观看| 午夜福利影视在线免费观看| 久久人妻熟女aⅴ| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 90打野战视频偷拍视频| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 大陆偷拍与自拍| 91在线观看av| 欧美激情高清一区二区三区| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 色精品久久人妻99蜜桃| 超碰97精品在线观看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 动漫黄色视频在线观看| 99香蕉大伊视频| 97碰自拍视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产又爽黄色视频| 色尼玛亚洲综合影院| 丰满的人妻完整版| 国产精品一区二区免费欧美| 国产精品日韩av在线免费观看 | 国产野战对白在线观看| 少妇的丰满在线观看| 搡老岳熟女国产| 精品日产1卡2卡| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 高清在线国产一区| 岛国视频午夜一区免费看| 看免费av毛片| 国产亚洲欧美在线一区二区| 中文字幕精品免费在线观看视频| 久久精品国产亚洲av高清一级| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲一区二区三区欧美精品| 日本黄色视频三级网站网址| 中文字幕人妻熟女乱码| 波多野结衣高清无吗| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲精品国产一区二区精华液| 一进一出好大好爽视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 99国产精品免费福利视频| 亚洲色图综合在线观看| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产成+人综合+亚洲专区| 男女之事视频高清在线观看| 中文字幕av电影在线播放| 免费av毛片视频| 免费不卡黄色视频| 热re99久久精品国产66热6| 91成年电影在线观看| 成人18禁在线播放| 97人妻天天添夜夜摸| 天堂√8在线中文| 女人被狂操c到高潮| 九色亚洲精品在线播放| 嫩草影院精品99| 亚洲在线自拍视频| 精品人妻1区二区| 久久久久国内视频| 亚洲欧美一区二区三区久久| av视频免费观看在线观看| 日本wwww免费看| 欧美精品亚洲一区二区| 黑丝袜美女国产一区| 搡老乐熟女国产| 亚洲美女黄片视频| 热99re8久久精品国产| 天堂俺去俺来也www色官网| 这个男人来自地球电影免费观看| 黄色 视频免费看| 99久久国产精品久久久| 亚洲成人免费av在线播放| √禁漫天堂资源中文www| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 黄色视频不卡| 91九色精品人成在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 国产视频一区二区在线看| 亚洲人成电影免费在线| 精品久久久久久,| 在线播放国产精品三级| 一二三四社区在线视频社区8| 久久精品国产综合久久久| 最近最新中文字幕大全免费视频| 动漫黄色视频在线观看| 精品无人区乱码1区二区| 国产成人系列免费观看| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲精品美女久久av网站| 一级毛片高清免费大全| 欧美成人性av电影在线观看| 久久国产精品影院| 亚洲人成电影免费在线| 啦啦啦免费观看视频1| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 99国产精品免费福利视频| 色综合婷婷激情| 欧美在线一区亚洲| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产欧美日韩一区二区三区在线| 精品国产一区二区久久| 美女午夜性视频免费| 欧美久久黑人一区二区| 久久久久久久午夜电影 | 嫁个100分男人电影在线观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 18美女黄网站色大片免费观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 91在线观看av| videosex国产| 午夜免费鲁丝| 亚洲av美国av| 成人影院久久| 亚洲精品在线观看二区| 91国产中文字幕| 激情在线观看视频在线高清| 久久香蕉国产精品| 高清在线国产一区| 丁香欧美五月| 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲中文字幕日韩| 1024视频免费在线观看| 岛国在线观看网站| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 最新美女视频免费是黄的| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 狂野欧美激情性xxxx| 日本欧美视频一区| 最新在线观看一区二区三区| 韩国精品一区二区三区| 一级作爱视频免费观看| 欧美精品亚洲一区二区| 大型av网站在线播放| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 日韩有码中文字幕| 国产真人三级小视频在线观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 午夜福利免费观看在线| 国产精品国产高清国产av| 久久久国产成人免费| 亚洲美女黄片视频| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 一进一出抽搐动态| 在线观看一区二区三区激情| 首页视频小说图片口味搜索| 精品乱码久久久久久99久播| 91精品国产国语对白视频| 91av网站免费观看| 亚洲精品中文字幕在线视频| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 在线观看一区二区三区| 麻豆一二三区av精品| 最近最新中文字幕大全免费视频| 色哟哟哟哟哟哟| 少妇的丰满在线观看| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 欧美性长视频在线观看| 久久精品亚洲av国产电影网| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产精品永久免费网站| 成在线人永久免费视频| 一二三四在线观看免费中文在| 免费在线观看亚洲国产| 午夜免费观看网址| 精品久久久精品久久久| 久久午夜亚洲精品久久| 久久人人精品亚洲av| 午夜免费鲁丝| 久久99一区二区三区| 12—13女人毛片做爰片一| 成熟少妇高潮喷水视频| 女性生殖器流出的白浆| 国产精品免费视频内射| 国产麻豆69| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 1024视频免费在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| √禁漫天堂资源中文www| 日韩视频一区二区在线观看| 在线观看www视频免费| 老司机午夜十八禁免费视频| 18禁国产床啪视频网站| 欧美乱色亚洲激情| tocl精华| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 一级毛片高清免费大全| 免费看十八禁软件| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 精品国产乱子伦一区二区三区| 交换朋友夫妻互换小说| www.自偷自拍.com| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 久久精品人人爽人人爽视色| 午夜两性在线视频| 国产亚洲欧美98| 88av欧美| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 三级毛片av免费| 欧美黄色片欧美黄色片| 免费日韩欧美在线观看| 久9热在线精品视频| 一区福利在线观看| 丝袜美足系列| 国产黄色免费在线视频| 搡老岳熟女国产| 日日爽夜夜爽网站| 日韩大码丰满熟妇| 美女大奶头视频| 看片在线看免费视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产在线观看jvid| 免费在线观看日本一区| 久久久久久久久久久久大奶| www.自偷自拍.com| 精品第一国产精品| 亚洲黑人精品在线| 国产深夜福利视频在线观看|