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    miR—148b對(duì)肝癌SMMC7721細(xì)胞衰老的影響

    2016-10-21 16:46:58張軍港石英黃東勝張成武洪德飛
    中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生 2016年5期
    關(guān)鍵詞:明顯增加癌基因糖苷酶

    張軍港 石英 黃東勝 張成武 洪德飛

    [摘要] 目的 探討miR-148b對(duì)肝癌SMMC7721細(xì)胞衰老的影響。 方法 分別使用50 nmol/L的miR-148b mimics(miR-148b)和negative control(miR-NC)轉(zhuǎn)染肝癌SMMC7721細(xì)胞48 h后,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)miR-148b表達(dá)的變化。通過(guò)β-半乳糖苷酶染色法檢測(cè)細(xì)胞衰老的變化,應(yīng)用western blot檢測(cè)P21表達(dá)的影響。 結(jié)果 與對(duì)照組相比,miR-148b能明顯增加肝癌SMMC7721細(xì)胞中miR-148b的表達(dá)。50 nmol/L的 miR-148b轉(zhuǎn)染SMMC7721細(xì)胞48 h后,細(xì)胞形態(tài)變得大而扁平,衰老細(xì)胞比例明顯增加[(9.67±2.08)% vs (43.67±3.51)%,P<0.01]。miR-148b使肝癌細(xì)胞P21蛋白的表達(dá)也明顯增加。 結(jié)論 miR-148b可能通過(guò)影響P21的表達(dá)促進(jìn)肝癌SMMC7721細(xì)胞的衰老,miR-148b有可能成為肝癌SMMC7721細(xì)胞生物治療的新靶點(diǎn)。

    [關(guān)鍵詞] 肝癌;miR-148b;衰老;P21

    [中圖分類號(hào)] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701(2016)05-0025-04

    microRNAs是一類長(zhǎng)度為20~24 bp、具有基因調(diào)控功能的非編碼小分子RNA,主要通過(guò)影響mRNA的穩(wěn)定及翻譯調(diào)控基因表達(dá)功能[1]。大量研究發(fā)現(xiàn),microRNAs在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、衰老等多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[2-4]。miR-148b在多種腫瘤中異常表達(dá),與腫瘤的生物學(xué)功能及預(yù)后密切相關(guān)。前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-148b在肝癌組織和細(xì)胞中低表達(dá),與肝癌的增殖侵襲密切相關(guān)[5,6],目前miR-148b對(duì)肝癌細(xì)胞衰老的影響機(jī)制尚不清楚。本研究在2013年10~12月將50 nmol/L的miR-148b的類似物轉(zhuǎn)染肝癌SMMC7721細(xì)胞48 h后,觀察對(duì)細(xì)胞衰老特性及衰老相關(guān)蛋白P21的影響,為探討miR-148b作為肝癌治療靶點(diǎn)提供基礎(chǔ)依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 材料與方法

    1.1 一般材料

    RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco BRL公司, 肝癌細(xì)胞系SMMC7721購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色試劑盒購(gòu)自碧云天生物有限公司。miR-148b mimics(miR-148b)和negative control(miR-NC)轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)有限公司。LipofectmanineTM2000及Trizol試劑均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。兔抗人P21和GAPDH一抗購(gòu)自美國(guó) Santa Cruz公司,辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的二抗購(gòu)自武漢博士德公司。

    1.2 方法

    1.2.1 常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng) 肝癌SMMC7721細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基,在37℃、含5%CO2培育箱下常規(guī)培養(yǎng)。

    1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR) 采用TaKaRa公司的試劑盒,miR-148b和內(nèi)參U6的引物探針由廣州瑞博公司設(shè)計(jì)合成。miR-148b:5-AAGTTCTGTTATACACTCAGGC-3,內(nèi)參基因U6:5-CTCGCTTCGGCA-GCACA-3。反應(yīng)體系為 SYBRR Green qRT-PCR Mix(2×)10 μL,PCR Forward Primer和Reverse Primer各0.4 μL,ROX 0.4 μL,ddH2O 7.8 μL,cDNA 1 μL。其反應(yīng)條件:95 ℃ 30 s,95℃ 5 s, 60℃ 30 s×40循環(huán),儀器為ABI公司7500型Real-time PCR儀。ABI step-one附帶qRT-PCR分析軟件分析CT(cycle threshold)值。目的基因RNA的相對(duì)表達(dá)量=2-Δ Δ CT, Δ Δ CT=待測(cè)樣本(CT目的基因-CT內(nèi)參)-對(duì)照組(CT目的基因-CT內(nèi)參)。

    1.2.3 β-半乳糖苷酶染色法檢測(cè)細(xì)胞衰老 轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后離心后重懸,以1×105個(gè)/孔接種于12孔培養(yǎng)板中,貼壁 24 h 后用細(xì)胞衰老檢測(cè)試劑盒染色,在37℃孵育過(guò)夜,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)均勻一致藍(lán)色細(xì)顆粒表示β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性,即細(xì)胞出現(xiàn)衰老改變。

    1.2.4 Western blot檢測(cè)P21蛋白的變化 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h后, 提取細(xì)胞蛋白??偟鞍滋崛》椒▍⒄誃eyotime公司操作說(shuō)明進(jìn)行。分別將相同適量蛋白含量的樣品和2×蛋白上樣緩沖液等體積混合,沸水中煮5 min使蛋白變性,10% SDS-PAGE電泳后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,然后 5 g/L脫脂奶粉封閉,加入1:1000稀釋的一抗,4℃過(guò)夜,加入1∶2000稀釋的二抗,室溫1 h,TBS漂洗膜,ECL增強(qiáng)發(fā)光,X線曝光。以GAPDH蛋白作為內(nèi)參照,BANDSCAN圖像分析軟件光密度積分值分析。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 13.0進(jìn)行分析,經(jīng)方差齊性檢驗(yàn),數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布,所有數(shù)據(jù)以(x±s)表示,組間差異比較采用t檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 miR-148b對(duì)肝癌SMMC7721細(xì)胞中miR-148b表達(dá)的影響

    將50 nmol/L miR-148b或miR-NC作用SMMC 7721細(xì)胞48 h,采用qRT-PCR的方法,檢測(cè)miR-148b表達(dá)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比(1.00±0.08),miR-148b明顯增加了肝癌細(xì)胞miR-148b的表達(dá)(151.22±9.77),差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=21.73,P<0.01)(圖1)。

    2.2 miR-148b對(duì)肝癌SMMC7721細(xì)胞衰老的影響

    將50 nmol/L miR-148b 或miR-NC作用SMMC7721細(xì)胞48 h,采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,miR-148b處理組的部分細(xì)胞形態(tài)變得更加大而扁平(封三圖1A)。進(jìn)一步采用β-半乳糖苷酶染色檢測(cè)細(xì)胞衰老變化。結(jié)果顯示,與對(duì)照組(9.67±2.08)%相比,miR-148b引起的衰老細(xì)胞比率明顯增加(43.67±3.51)%,差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.42,P<0.01)(封三圖1B)。

    2.3 miR-148b對(duì)肝癌SMMC7721細(xì)胞衰老相關(guān)p21蛋白的影響

    采用Western blot方法檢測(cè)P21蛋白變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,50 nmol/L的miR-148b作用SMMC 7721細(xì)胞48 h后,P21蛋白的表達(dá)明顯增加(圖2A)。具體灰度值變化見圖2B(灰度值:1.16±0.02 vs 0.77±0.03),差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.89,P<0.01)(圖2B)。

    3 討論

    肝癌是世界上死亡率最高的惡性腫瘤之一。由于肝癌的發(fā)病隱匿,早期無(wú)特異性的臨床癥狀,且病程進(jìn)展迅速,當(dāng)患者出現(xiàn)明顯的自覺(jué)癥狀時(shí),往往已到了中晚期[7]。目前肝癌的治療仍以手術(shù)為主,而不能手術(shù)的患者則以化療為主。手術(shù)的效果受限于手術(shù)時(shí)機(jī),而化療藥物易產(chǎn)生耐藥性、腫瘤殺傷效率不高。因此迫切需要尋找有效地早期生物標(biāo)志物機(jī)開發(fā)新的有效藥物治療肝癌。

    肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素多步驟多階段的病理過(guò)程, 涉及到很多相關(guān)癌基因和抑癌基因的變化。研究結(jié)果顯示,microRNA可能通過(guò)類似于抑癌基因、癌基因或其它方式來(lái)調(diào)控腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過(guò)程,表現(xiàn)為同抑癌基因或癌基因相似的生物學(xué)效應(yīng)[8]。microRNA主要通過(guò)與特定靶基因mRNA 的 3-非翻譯區(qū)(3-UTR)完全或不完全配對(duì),導(dǎo)致靶基因mRNA降解或翻譯抑制,從而參與個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡、分化、衰老和代謝等生命活動(dòng)的調(diào)控[2,9,10]。

    近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)miR-148b參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。Ghasemkhani N等[11]研究發(fā)現(xiàn)miR-148b在肺癌中低表達(dá),同肺癌的TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后密切相關(guān)。Zhao等[12]研究發(fā)現(xiàn)miR-148b在胰腺癌低表達(dá),通過(guò)影響AMPKα1信號(hào)通路影響腫瘤的生物學(xué)行為。我們前期已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miR-148b在肝癌中低表達(dá),通關(guān)過(guò)調(diào)控WNT1/β-catenin通路抑制肝癌的增殖和侵襲行為[5]。然而miR-148b同肝癌細(xì)胞衰老的關(guān)系未做進(jìn)一步研究。細(xì)胞衰老是指細(xì)胞不可逆地離開細(xì)胞周期、發(fā)生形態(tài)及細(xì)胞學(xué)改變的現(xiàn)象。細(xì)胞衰老作為細(xì)胞潛在的抗腫瘤機(jī)制,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要屏障作用,能夠有效防止腫瘤發(fā)生[13,14]。

    本研究結(jié)果顯示miR-148b能夠使SMMC7721中的miR-148b表達(dá)明顯增加,miR-148b使SMMC 7721細(xì)胞的形態(tài)變得大而扁平,呈現(xiàn)出衰老狀態(tài)。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)miR-148b使β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)目明顯增加,進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-148b能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞衰老,使肝惡性腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為發(fā)生一定程度逆轉(zhuǎn)。

    P21是細(xì)胞周期調(diào)控家族的重要成員之一,是依賴于細(xì)胞周期蛋白激酶(CDK)的抑制物,它能夠通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期過(guò)程,參與細(xì)胞的增殖、分化、衰老及死亡過(guò)程[15-17]。已知P21是通過(guò)依賴p53和不賴p53的途徑調(diào)節(jié)的。既往研究發(fā)現(xiàn),P21能增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)的ROS水平,而ROS的抑制劑N-乙酰半胱氨酸能夠明顯阻止P21誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老,表明P21可能通過(guò)ROS積聚機(jī)制誘導(dǎo)衰老[18]。Hu B等[19]研究發(fā)現(xiàn)女貞果實(shí)提取物通過(guò)正調(diào)控P21誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的衰老和凋亡。既往研究發(fā)現(xiàn)阿霉素能夠誘導(dǎo)結(jié)腸癌野生型HCT-116細(xì)胞發(fā)生衰老樣生長(zhǎng)停滯,而這種作用對(duì)敲除P21的HCT-116細(xì)胞株作用大大降低,表明P21在結(jié)腸癌的衰老過(guò)程中起重要作用[20]。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-148b能夠使P21蛋白的表達(dá)量明顯增加,表明miR-148b可能通過(guò)調(diào)通P21的表達(dá)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的衰老過(guò)程。

    綜上所述,本研究結(jié)果顯示,miR-148b能夠通過(guò)調(diào)控P21來(lái)誘導(dǎo)肝癌SMMC7721細(xì)胞衰老,我們將進(jìn)一步深入研究miR-148b在肝癌中的功能和調(diào)控分子機(jī)制,系統(tǒng)闡明miR-148b參與肝癌發(fā)生發(fā)展可能的機(jī)制,為肝癌的治療提供新的靶點(diǎn)。

    [參考文獻(xiàn)]

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    (收稿日期:2015-11-05)

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