氧化石墨烯修飾多孔復(fù)合涂層超長(zhǎng)開管液相色譜柱的制備與評(píng)價(jià)

張維冰 高羽 彭麗 趙祎曼 劉海燕

摘要采用原位聚合法在毛細(xì)管柱（3 m × 25 μm i.d.）內(nèi)壁制備粗糙結(jié)構(gòu)的聚氯甲基苯乙烯二乙烯基苯涂層，并將氧化石墨烯以共價(jià)鍵合的方式固定在涂層表面，制備成氧化石墨烯修飾多孔復(fù)合涂層超長(zhǎng)開管毛細(xì)管液相色譜柱。通過(guò)掃描電鏡、透射電鏡、拉曼光譜等手段對(duì)固定相的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，證實(shí)聚氯甲基苯乙烯二乙烯基苯涂層具有球形分散結(jié)構(gòu)，而片狀的氧化石墨烯均勻覆蓋在聚合物層表面。球狀的聚合物層及氧化石墨烯的覆蓋極大地提高了色譜柱的相比及樣品容量，乙腈水為流動(dòng)相可分離烷基苯、中性多環(huán)芳烴、酸性和堿性化合物，乙腈0.02 mol/L醋酸銨為流動(dòng)相可實(shí)現(xiàn)4種核酸堿基樣品的分離。制備的色譜柱具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，測(cè)試的日內(nèi)、日間、柱間重復(fù)性（n=6）相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均在0.3%～2.0%范圍內(nèi)。

關(guān)鍵詞 氧化石墨烯； 多孔復(fù)合涂層； 開管毛細(xì)管液相色譜

1引言

石墨烯具有二維蜂巢狀的單分子層結(jié)構(gòu)[1，2]，是碳質(zhì)材料的基本組成單元。氧化石墨烯（GO）是一種石墨烯改性功能化材料，具有優(yōu)異的電子、機(jī)械、熱性能和光學(xué)性能[3]。由于其高比表面積（理論值2630 m2/g）和非定域化的π電子體系[4，5]，氧化石墨烯在固相萃取（SPE）[6]、固相微萃?。⊿PME）[7]、磁固相萃?。∕SPE）[8]以及色譜固定相[9]等方面均有應(yīng)用。

氧化石墨烯的骨架和邊緣上分布著大量羧基、羥基、環(huán)氧基和羰基等活性氧基團(tuán)[10]，因此較易將其修飾到其它材料的表面[11]。據(jù)報(bào)道，氧化石墨烯可以通過(guò)其羧基與氨基的反應(yīng)化學(xué)鍵合到3氨丙基三乙氧基硅烷修飾的硅基質(zhì)表面[12]。Qu等[13]使用3氨丙基三甲氧基硅烷作為交聯(lián)劑，將氧化石墨烯納米片固定到毛細(xì)管柱內(nèi)壁，用于芳香族化合物的分離。由于GO結(jié)構(gòu)中具有大π鍵、大量羥基及羧基等作用位點(diǎn)，對(duì)多種樣品的吸附能力過(guò)強(qiáng)，限制了其作為色譜分離介質(zhì)的應(yīng)用。

毛細(xì)管開管柱具有制備方法簡(jiǎn)單、柱壓低等優(yōu)點(diǎn)，采用超長(zhǎng)毛細(xì)管開管柱可有效提高絕對(duì)柱效，改善分離效果，但毛細(xì)管開管柱同時(shí)又存在相比低、樣品容量小的缺點(diǎn)。多孔涂層開管（PLOT）[14，15]毛細(xì)管液相色譜柱，尤其是聚合物基質(zhì)的PLOT[16，17]能夠在一定程度上改善開管柱的色譜分離性能。Karger課題組[18，19]發(fā)表了一系列將超長(zhǎng)細(xì)內(nèi)徑PLOT柱用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究的文章，獲得了超低檢測(cè)限和超高峰容量。

本研究采用Luo 等[18]的方法制備PLOT柱，在毛細(xì)管內(nèi)壁形成球形分散結(jié)構(gòu)的聚氯甲基苯乙烯二乙烯基苯涂層，進(jìn)一步在聚合物涂層上修飾GO[20，21]，利用GO對(duì)樣品的強(qiáng)吸附作用彌補(bǔ)開管柱樣品容量不足的缺陷，并對(duì)制備的色譜柱加以表征和評(píng)價(jià)。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

P1201S高壓恒流泵（大連依利特分析儀器有限公司）；紫外檢測(cè)器（蘇州匯通色譜分離純化有限公司）；超聲波清洗儀（Autoscience，天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；Nova Nano SEM 450掃描電子顯微鏡 （SEM，荷蘭FEI公司）；JEM2100透射電子顯微鏡（TEM，日本JEOL公司）；Iuvia refl激光顯微拉曼光譜儀（英國(guó)Renishaw公司）；實(shí)驗(yàn)用水經(jīng) Sartorius Arium 611純水儀（德國(guó)Sartorius公司） 純化。

熔融石英毛細(xì)管（25 μm i.d.×365 μm o.d.，邯鄲市鑫諾光纖色譜有限公司）；4氯甲基苯乙烯（VBC）、苊、蒽、鄰苯二酚、對(duì)苯二酚、苯胺、對(duì)氯苯胺、1萘胺、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤（上海阿拉丁試劑有限公司）；異丙基苯、萘、間苯二酚（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；二乙烯基苯（DVB）、偶氮二異丁氰（AIBN）、3（三甲氧基甲硅基）甲基丙烯酸丙酯（γmaps）（美國(guó)SigmaAldrich公司）；乙二胺、硫脲、苯、甲苯、乙基苯（凌峰試劑有限公司）；2，4，6三氟苯胺（瑞士阿達(dá)瑪斯試劑公司）；氧化石墨烯（先豐納米有限公司）；乙腈（ACN，色譜純），甲醇（Methanol，色譜純）購(gòu)自山東禹王實(shí)業(yè)有限公司。

烷基苯類、多環(huán)芳烴類、苯酚類和苯胺類儲(chǔ)備液用乙腈進(jìn)行配制，混合樣品溶液用50% （V/V）ACN進(jìn)行稀釋；核酸堿基類樣品用1 mol/L NaOH進(jìn)行配制。所用樣品溶液使用前用0.45 μm濾膜過(guò)濾，并超聲5 min得到無(wú)氣泡均相溶液。

2.2GO修飾PLOT柱的制備

石英毛細(xì)管（3 m × 25 μm i.d. × 365 μm o.d.）依次用0.1 mol/L NaOH、H2O、0.1 mol/L HCl 和H2O沖洗1 h，N2吹干。用注射器推入γmaps甲醇溶液（1∶1，V/V），兩端封口后，60℃水浴加熱12 h。甲醇沖洗后N2吹干。取 AIBN（2 mg），VBC（200 μL）和DVB（200 μL）溶于甲醇（600 μL），超聲混勻后充入毛細(xì)管柱中，70℃水浴反應(yīng)16 h后以甲醇沖洗，N2吹干。處理后的毛細(xì)管通入乙二胺，70℃反應(yīng)24 h，進(jìn)行原位改性，以甲醇沖洗，N2吹干。將0.2 mg/mL GO分散液通入上述處理的PLOT柱，70℃水浴加熱反應(yīng)4 h，以H2O沖洗后保存?zhèn)溆?。GO修飾PLOT柱的制備機(jī)理如圖1所示。

3結(jié)果與討論

3.1GO修飾PLOT柱固定相結(jié)構(gòu)的表征

圖2為GOPLOT柱的橫截面掃描電鏡圖，可以看到毛細(xì)管柱內(nèi)壁均勻分布一層球狀物，說(shuō)明聚氯甲基苯乙烯二乙烯基苯涂層在毛細(xì)管柱內(nèi)呈現(xiàn)球形分散結(jié)構(gòu)，極大地增加了毛細(xì)管柱內(nèi)壁的比表面積。圖3是GO修飾前后聚合物顆粒的透射電鏡圖。圖3a中顆粒表面光滑，而圖3b中顆粒的表層上明顯覆蓋一層充滿褶皺的片狀物，證明氧化石墨烯已成功鍵合到聚合物涂層上。

對(duì)氧化石墨烯修飾前后的聚合物層進(jìn)行拉曼光譜分析（圖4）。氧化石墨烯涂覆后的聚合物層拉曼光譜（圖4b）與聚合物層拉曼光譜（圖4a）相比，在1350和1600 cm

Symbolm@@ 1左右有兩個(gè)明顯的吸收峰，分別為D峰和G峰，這兩個(gè)吸收峰是氧化石墨烯的特征峰。

通過(guò)以上掃描電鏡、透射電鏡和拉曼光譜等對(duì)固定相的表征，證明聚氯甲基苯乙烯二乙烯基苯涂層以球形分散結(jié)構(gòu)均勻分布于毛細(xì)管柱內(nèi)壁，片狀的氧化石墨烯通過(guò)化學(xué)鍵合覆蓋在球形聚合物層的表面。

3.2GOPLOT柱色譜性能評(píng)價(jià)

3.2.1烷基苯的分離圖5為苯，甲苯，乙基苯，異丙基苯的分離色譜圖。從圖5可見，4種烷基苯可以在GOPLOT色譜柱上實(shí)現(xiàn)良好分離，洗脫順序與它們的疏水性一致。說(shuō)明烷基苯與GOPLOT色譜柱之間以疏水相互作用為主，其分子量越大，疏水性越強(qiáng)，與氧化石墨烯的相互作用力越強(qiáng)，保留時(shí)間越長(zhǎng)。流動(dòng)相中乙腈含量與烷基苯保留因子對(duì)數(shù)的線性關(guān)系見圖6。4種烷基苯保留因子的對(duì)數(shù)與ACN

3.2.2多環(huán)芳烴的分離圖7為4種多環(huán)芳烴（PAHs）的分離效果圖。4種多環(huán)芳烴的峰寬隨洗脫時(shí)間增加逐步增大，并且出現(xiàn)了拖尾，以75%乙腈洗脫，不對(duì)稱因子達(dá)到3.04。氧化石墨烯具有大的離域π電子體系，多環(huán)芳烴也具有π電子結(jié)構(gòu)，二者之間既存在疏水相互作用，又有ππ堆疊作用[22]，因此多環(huán)芳烴類化合物與氧化石墨烯之間相互作用力較強(qiáng)，且共軛體系越大ππ堆疊作用也較強(qiáng)，最終導(dǎo)致苊和蒽拖尾。

3.2.3酸性化合物的分離3種弱酸性苯二酚異構(gòu)體在GOPLOT柱上的分離情況見圖8。氧化石墨烯和酚類化合物之間包含多種相互作用，除疏水相互作用和ππ堆疊作用外，還包含氫鍵相互作用。氧化石墨烯的骨架和邊緣處含有多種含氧官能團(tuán)，如羧基、羥基和環(huán)氧基等，這些含氧基團(tuán)與酚類化合物之間可以形成氫鍵相互作用。此外，毛細(xì)管內(nèi)壁上未完全覆蓋的硅羥基及聚合物層上殘留的氨基，也可能與分析物之間形成氫鍵作用。GOPLOT色譜柱與酚類物質(zhì)之間作用位點(diǎn)多，相互作用力多樣化，

有望用于復(fù)雜酚類物質(zhì)的分離。

3.2.4堿性化合物的分離如圖9所示，5種芳

香胺類弱堿性化合物在GOPLOT柱上實(shí)現(xiàn)了基線分離。表1列出了硫脲和5種胺類化合物的分離度、半峰寬和理論塔板數(shù)。分離度達(dá)到2.29以上，最大理論塔板數(shù)達(dá)到5萬(wàn)以上，5種化合物在20 min內(nèi)完成出峰，證明GOPLOT色譜柱具有高柱效、快速分析等優(yōu)點(diǎn)。

除了疏水相互作用，GOPLOT柱與芳香胺類化合物之間還存在ππ堆疊作用，從5種物質(zhì)的色譜圖可對(duì)分離機(jī)理進(jìn)行推測(cè)。1萘胺在5種檢測(cè)物中疏水性最強(qiáng)，另一方面，因其存在萘環(huán)，與氧化石墨烯之間ππ堆疊作用更強(qiáng)，因此保留時(shí)間最長(zhǎng)，峰寬最大；2，4，6三氟苯胺上的氟取代基具有很強(qiáng)的吸電子作用，減弱了其苯環(huán)上的π電子云密度，與柱內(nèi)壁氧化石墨烯之間的ππ堆疊作用減弱，比極性強(qiáng)于它的對(duì)氯苯胺更先出峰，說(shuō)明其與固定相之間的ππ堆疊作用占主導(dǎo)地位。其它3種物質(zhì)則極性強(qiáng)的先出峰，極性弱的物質(zhì)后出峰，以疏水相互作用為主導(dǎo)。

實(shí)驗(yàn)表明，中性、酸性和堿性化合物均可以在GOPLOT柱上實(shí)現(xiàn)良好分離。ππ堆疊作用、疏水相互作用和氫鍵作用形成的混合保留模式，使GOPLOT色譜柱與傳統(tǒng)的反相色譜柱相比擁有獨(dú)特的色譜分離性能。

3.2.5核酸堿基的分離核酸堿基由于極性較強(qiáng)，在反相色譜中幾乎沒有保留，通常很難實(shí)現(xiàn)分離。本研究選取一組核酸堿基在GOPLOT色譜柱上進(jìn)行分離，分離情況如圖10所示，4種核酸堿基在GOPLOT柱上的分離效果良好。氧化石墨烯的強(qiáng)吸附能力增大了核酸堿基的保留，這是疏水相互作用、ππ堆疊作用和氫鍵相互作用共同作用的結(jié)果。

3.3重復(fù)性及穩(wěn)定性考察

重復(fù)性及穩(wěn)定性是考察色譜柱性能的一項(xiàng)很重要的指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)選取鄰苯二胺、苯胺和2，4，6三氟苯胺3種組分對(duì)GOPLOT柱的重復(fù)性及穩(wěn)定性進(jìn)行考察，結(jié)果見表2。次間、日間以及柱間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差都在0.3%～2.0%范圍內(nèi)，證明在液相色譜模式下，所制備的GOPLOT色譜柱的穩(wěn)定性及重復(fù)性良好。實(shí)驗(yàn)中GOPLOT柱可正常運(yùn)行200次以上（圖11），如此長(zhǎng)的柱壽命也再一次證明氧化石墨烯納米片通過(guò)共價(jià)鍵合修飾在毛細(xì)管柱內(nèi)壁。

4結(jié) 論

通過(guò)共價(jià)鍵合的方式制備GO修飾的毛細(xì)管開管色譜柱，并采用SEM、TEM、Raman等手段對(duì)固定相結(jié)構(gòu)加以表征。結(jié)果表明，形成的球狀聚合物均勻分散在柱內(nèi)壁，而在其表面修飾的GO具有很高的比表面積，可極大地提高固定相的比表面積，改善所制備色譜柱的分離性能。與傳統(tǒng)的反相色譜柱相比， GOPLOT色譜柱具有獨(dú)特的色譜性能，這歸功于其多作用位點(diǎn)的混合保留模式，包括ππ堆疊作用、疏水相互作用和氫鍵相互作用等。烷基苯、中性多環(huán)芳烴、苯酚類化合物、苯胺類化合物以及核酸堿基等均可以得到良好分離。多次運(yùn)行后，次間、日間及柱間保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2.0%，證明GOPLOT色譜柱具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。所發(fā)展的柱制備方法及得到的結(jié)果為氧化石墨烯用于色譜固定相提供了一種可能的途徑。

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