柚皮素對氧化應(yīng)激所致成骨細胞凋亡的影響及機制研究

吳新濤　石晶　高樂才　吳新峰　吳文元　龐石磊

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·論著·

柚皮素對氧化應(yīng)激所致成骨細胞凋亡的影響及機制研究

吳新濤石晶高樂才吳新峰吳文元龐石磊

目的觀察柚皮素對氧化應(yīng)激導(dǎo)致的成骨細胞凋亡的影響，并探討其機制。方法體外分離培養(yǎng)成骨細胞，細胞分空白對照組、單純H2O2作用組、H2O2+0.1 μmol/L柚皮素組、H2O2+1 μmol/L柚皮素組、H2O2+10 μmol/L柚皮素組。MTT法檢測成骨細胞活力；流式細胞術(shù)檢測成骨細胞凋亡率；熒光顯微鏡觀察活性氧(ROS)含量；比色法檢測丙二醛(MDA)含量；Real time-PCR 和Western-blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表達情況。結(jié)果與空白對照組比較，單純H2O2處理組細胞活性明顯降低，凋亡率及ROS、MDA含量明顯增加；同時Bcl-2 mRNA和蛋白表達明顯下調(diào)，Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白表達明顯上調(diào)(P<0.05)。 與單純H2O2處理組比較，柚皮素預(yù)處理24 h能夠明顯增強細胞活性，降低細胞凋亡率及ROS、MDA含量，上調(diào)Bcl-2 mRNA和蛋白表達，下調(diào)Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白表達，呈劑量依賴性(P<0.05)。結(jié)論柚皮素在氧化應(yīng)激條件下能夠促進成骨細胞增殖，抑制成骨細胞凋亡，其機制與上調(diào)Bcl-2表達，下調(diào)Bax、Caspase-3表達有關(guān)。

柚皮素；成骨細胞；氧化應(yīng)激；凋亡

近年來，骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率逐漸升高，已經(jīng)成為影響人們生活質(zhì)量的主要疾病之一[1]。傳統(tǒng)觀點認為雌激素缺乏是骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的主要原因，然而補充雌激素并未明顯改善骨質(zhì)疏松癥。越來越多的研究提出，氧化應(yīng)激在骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[2]。中草藥柚皮苷屬黃酮類物質(zhì)，具有抗氧化、保護神經(jīng)、治療骨質(zhì)疏松癥等藥理作用。柚皮素是柚皮苷的主要代謝產(chǎn)物，體外實驗表明柚皮素對大鼠成骨細胞促骨形成活性優(yōu)于柚皮苷[3,4]。然而，柚皮素促骨形成的具體機制尚不清楚。本研究利用體外培養(yǎng)的成骨細胞，觀察柚皮素對成骨細胞增殖、凋亡、活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)含量及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表達的影響，旨在闡明柚皮素防治骨質(zhì)疏松癥的具體分子機制。

1　材料與方法

1.1材料DMEM-H培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；兔抗鼠 Bcl-2、Bax、Caspase-3、β-actin多克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司；細胞裂解液、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG抗體、BCA蛋白濃度測定試劑盒、高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；Prime Script TM RT Master Mix(Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara公司；Trizol、實時熒光定量試劑盒購自美國Promega公司。

1.2儀器Chemi DocTM XRS+化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(Biorad公司)；頭一回7300 型Real time-PCR擴增儀(美國ABI公司)。

1.3成骨細胞培養(yǎng)參照相關(guān)文獻報道體外分離培養(yǎng)成骨細胞[5]。新生24 h大鼠處死后，75%乙醇浸泡10 min，無菌手術(shù)揭去頭皮，分離顱蓋骨，去除表面結(jié)締組織，PBS清洗2～3次后置于無血清DMEM培養(yǎng)基中，組織剪剪碎顱蓋骨，加入0.25%胰蛋白酶預(yù)消化30 min，加入含血清培養(yǎng)基終止消化。加入0.1% Ⅰ型膠原酶消化45 min，加入預(yù)冷PBS 終止消化。過濾后的消化液1 000 r/min 離心10 min，棄上清，培養(yǎng)液沖洗細胞，在37℃、5% CO2及飽和濕度條件下，將細胞懸液接種于含10%小牛血清的DMEM-H培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待細胞生長至80%融合時根據(jù)需要進行相關(guān)指標的檢測。

1.4觀察指標及方法

1.4.1MTT法檢測細胞活力:細胞消化后將懸液接種于96孔板中，調(diào)整細胞密度為1×104/孔。細胞分5組：空白對照組、單純H2O2作用組(300 μmol/L)、H2O2+0.1 μmol/L柚皮素組、H2O2+1 μmol/L柚皮素組、H2O2+10 μmol/L柚皮素組。5組細胞均置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)液，各組于第1，2，3，4天后每孔加入5 mg/L MTT，37℃孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μl DMSO，于570 nm波長處測定吸光度值。

1.4.2流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡:細胞以1×105/孔接種于24孔板，給藥1、2、3、4 d后培養(yǎng)48 h，胰酶消化細胞，用標記熒光素FITC的Annexin V和PI染色，1 h 內(nèi)檢測細胞凋亡率。

1.4.3熒光顯微鏡觀察細胞ROS含量:細胞以5×104/孔的密度接種于放有玻片(多聚賴氨酸包被過夜)的24孔板中，給藥后培養(yǎng)4 h，加入0.5 mmol/L MPP+培養(yǎng)48 h，之后加入10 μmol/L DCFH-DA，37℃培養(yǎng)箱中孵育20 min。用無血清的DMEM-H培養(yǎng)基洗3次。熒光顯微鏡拍照并測定熒光強度。

1.4.4比色法測定細胞MDA含量:細胞以2×105/孔的密度接種于6孔板中，給藥后預(yù)培養(yǎng)4 h，加入 0.5 mmol/L MPP+培養(yǎng)48 h。按照MDA檢測試劑盒說明書操作，比色法測定細胞MDA含量。

1.4.5Real time-PCR:Trizol提取細胞總RNA，按照試劑盒說明書加樣進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，ABI 7300型熒光定量PCR儀擴增。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。用儀器自帶的分析軟件得到各樣本、各基因擴增的Ct值，以β-actin為內(nèi)參照基因，目的基因表達相對值RQ=2ΔΔCt。見表1。

表1　Real time-PCR引物序列

1.4.6Western-blot:提取細胞總蛋白，半干法電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜，10%脫脂奶粉封閉2 h。依次加入特異性一抗和辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG，化學(xué)發(fā)光法顯色、定影。用UVP軟件掃描測定蛋白條帶IOD值，β-actin作為內(nèi)參照，以目的蛋白與β-actin吸光度值的比值表示目的蛋白相對表達水平。

2　結(jié)果

2.1柚皮素在H2O2介導(dǎo)下對成骨細胞增殖的影響與空白對照組比較，單純H2O2處理組成骨細胞數(shù)量明顯降低，給予不同劑量柚皮素能夠明顯增加成骨細胞數(shù)量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，呈劑量依賴性。見表2。

2.2柚皮素在H2O2介導(dǎo)下對成骨細胞凋亡的影響與空白對照組比較，單純H2O2處理組成骨細胞凋亡率明顯增加，給予不同劑量柚皮素能夠明顯降低成骨細胞凋亡率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，呈劑量依賴性。見表3。

2.3柚皮素在H2O2介導(dǎo)下對成骨細胞氧化應(yīng)激指標的影響與空白對照組比較，單純H2O2處理組成骨細胞ROS、MDA含量明顯增加，給予不同劑量柚皮素能夠明顯降低成骨細胞ROS、MDA含量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，呈劑量依賴性。見表4。

表2　柚皮素在H2O2介導(dǎo)下對成骨細胞增殖的影響　±s

注：與空白對照組比較,*P<0.05;與單純H2O2處理組比較,#P<0.05;與H2O2+0.1 μmol/L柚皮素組比較,△P<0.05;與H2O2+1 μmol/L柚皮素組比較,☆P<0.05

表3　柚皮素在H2O2介導(dǎo)下對成骨細胞凋亡的影響　±s

注：與空白對照組比較,*P<0.05;與單純H2O2處理組比較,#P<0.05;與H2O2+0.1 μmol/L柚皮素組比較,△P<0.05;與H2O2+1 μmol/L柚皮素組比較,☆P<0.05

表4　柚皮素在H2O2介導(dǎo)下對成骨細胞氧化應(yīng)激指標的影響　±s

注：與空白對照組比較,*P<0.05;與單純H2O2處理組比較,#P<0.05;與H2O2+0.1 μmol/L柚皮素組比較,△P<0.05;與H2O2+1 μmol/L柚皮素組比較,☆P<0.05

2.4柚皮素在H2O2介導(dǎo)下對成骨細胞Bcl-2、Bax表達的影響與空白對照組比較，單純H2O2處理組成骨細胞Bcl-2 mRNA和蛋白表達水平明顯降低，Bax mRNA和蛋白表達水平明顯增加，給予不同劑量柚皮素能夠明顯增加成骨細胞Bcl-2 mRNA和蛋白表達水平，降低Bax mRNA和蛋白表達水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，呈劑量依賴性。見表5、6。

組別Bcl-2mRNABaxmRNA空白對照組2.89±0.432.45±0.32單純H2O2處理組0.54±0.07*4.79±0.56*H2O2+0.1μmol/L柚皮素組0.97±0.13*#4.25±0.61*#H2O2+1μmol/L柚皮素組1.56±0.25*△3.67±0.52*△H2O2+10μmol/L柚皮素組2.03±0.34*☆2.98±0.43*☆

注：與空白對照組比較,*P<0.05;與單純H2O2處理組比較,#P<0.05;與H2O2+0.1 μmol/L柚皮素組比較,△P<0.05;與H2O2+1 μmol/L柚皮素組比較,☆P<0.05

2.5柚皮素在H2O2介導(dǎo)下對成骨細胞Caspase-3表達的影響與空白對照組比較，單純H2O2處理組成骨細胞Caspase-3 mRNA和蛋白表達水平明顯增加，給予不同劑量柚皮素能夠明顯降低成骨細胞Caspase-3 mRNA和蛋白表達水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，呈劑量依賴性。見表7。

表6　柚皮素在H2O2介導(dǎo)下對成骨細胞Bcl-2、Bax蛋白表達的影響　±s

注：與空白對照組比較,*P<0.05;與單純H2O2處理組比較,#P<0.05;與H2O2+0.1 μmol/L柚皮素組比較,△P<0.05;與H2O2+1 μmol/L柚皮素組比較,☆P<0.05

組別Caspase-3mRNA蛋白空白對照組0.98±0.120.87±0.12單純H2O2處理組2.99±0.44*2.78±0.41*H2O2+0.1μmol/L柚皮素組2.41±0.35*#2.30±0.31*#H2O2+1μmol/L柚皮素組1.96±0.23*△1.83±0.21*△H2O2+10μmol/L柚皮素組1.41±0.20*☆1.30±0.17*☆

注：與空白對照組比較,*P<0.05;與單純H2O2處理組比較,#P<0.05;與H2O2+0.1 μmol/L柚皮素組比較,△P<0.05;與H2O2+1 μmol/L柚皮素組比較,☆P<0.05

3　討論

骨質(zhì)疏松癥是由于遺傳、環(huán)境、雌激素缺乏等因素導(dǎo)致成骨細胞合成新骨不足或破骨細胞吸收舊骨過多的骨平衡過程失衡，最終導(dǎo)致骨骼完整性的破壞、骨量減少、骨密度降低[6]。研究顯示，激素、炎性因子、生長因子通過影響成骨細胞和破骨細胞的增殖、分化和成熟影響骨重建過程。近年來多項研究表明，ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激在骨質(zhì)疏松發(fā)病機制中占重要地位[7-9]。過多的ROS通過影響細胞因子、酶活性、受體配體的表達水平調(diào)控Wnt/β-catenin、PKCβ/p53/p66shc/JNK等信號通路，誘導(dǎo)與骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)、成骨細胞、破骨細胞增殖、分化、凋亡相關(guān)基因的表達，最終造成骨吸收速率超過骨形成速率、破骨細胞吸收骨組織和成骨細胞形成骨組織的動態(tài)平衡過程失衡及骨質(zhì)疏松癥發(fā)生[10]。目前認為，成骨細胞與骨質(zhì)疏松癥發(fā)病密切相關(guān)，是骨質(zhì)疏松癥治療領(lǐng)域研究的熱點。采用藥物干預(yù)體外培養(yǎng)的成骨細胞并探討其分子機制是進行抗骨質(zhì)疏松癥并評價其藥效學(xué)的重要手段。

Bcl-2家族是影響細胞凋亡的關(guān)鍵因素之一。其中Bcl-2分布于線粒體外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，參與調(diào)控與細胞凋亡有關(guān)的過程。Hawkins等[11,12]研究顯示，Bcl-2過表達通過抑制鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運、線粒體通透性及通透轉(zhuǎn)換孔的形成，從而抑制凋亡進程。Bax定位于細胞質(zhì)，是Bcl-2家族中發(fā)揮促凋亡作用的重要成員，其中 BH3是Bax發(fā)揮促凋亡作用的必須結(jié)構(gòu)域，凋亡信息激活Bax后可通過末端疏水結(jié)構(gòu)域錨固在線粒體膜上，改變線粒體通透性，從而促使細胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子和凋亡蛋白酶激活因子1的釋放，進而激活Caspase系統(tǒng)及細胞凋亡進程[13,14]。Caspase-3屬于Caspase蛋白家族，是凋亡效應(yīng)子，能夠被上游效應(yīng)子激活作用于特異性底物，從而造成細胞形態(tài)和生化改變。研究發(fā)現(xiàn)，中草藥柚皮苷能夠?qū)琴|(zhì)疏松小鼠模型發(fā)揮一定程度保護作用，而柚皮苷經(jīng)口服途徑進入體內(nèi)后的主要代謝物為柚皮素。體外實驗表明柚皮素對大鼠成骨細胞也具有促骨形成活性，且較柚皮苷有所增加[3,4]。本研究在細胞水平觀察柚皮素對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的成骨細胞增殖、凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達的影響，結(jié)果顯示，柚皮素在氧化應(yīng)激狀態(tài)下能夠明顯促進成骨細胞增殖、抑制成骨細胞凋亡、上調(diào)凋亡抑制蛋白Bcl-2 mRNA和蛋白表達、下調(diào)凋亡蛋白Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白表達(P<0.05)，呈劑量依賴性。

綜上所述，柚皮素對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的成骨細胞凋亡具有拮抗作用，其機制與上調(diào)Bcl-2表達、下調(diào)Bax、Caspase-3表達有關(guān)。本研究闡明了柚皮素促進成骨細胞增殖、抑制成骨細胞凋亡的可能機制，這不僅有助于認識骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機制，還揭示了中藥柚皮素治療骨質(zhì)疏松癥的分子機制。

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Effects of naringenin on apoptosis of osteoblasts mediated by oxidative stress and its action mechanism

WUXintao,SHIJing,GAOLecai,etal.

DepartmentofOrthopedics,CangzhouHospitalsofIntegratedTCMandWesternMedicine,Hebei,Cangzhou061001,China

ObjectiveTo observe the effects of naringenin on apoptosis of osteoblasts mediated by oxidative stress, and to explore its action mechanism.MethodsThe osteoblasts were separated and cultured in vitro. The experiment was divided into 5 groups: blank control group,simple H2O2group, H2O2+naringenin low-does group (0.1μmol/L), H2O2+naringenin medium-dose group (1μmol/L) and H2O2+naringenin high-dose group (10μmol/L). The cell viabilities of osteoblasts were detected by MTT assay. The cell apoptosis rates were detected by flow cytometry.The levels of reactive oxygen species (ROS) were observed by fluorescence microscopy. MDA contents were measured by colorimetric technique. The expression levels of Bcl-2, Bax and Caspase-3 mRNA and protein were detected by Real time-PCR and Western Blot,respectively.ResultsAs compared with those in blank control group,the cell viabilities in simple H2O2group were obviously decreased,however, the cell apoptosis rates and the levels of ROS and MDA were significantly increased, meanwhile,the expression levels of Bcl-2 mRNA and protein were obviously down-regulated, however, the expression levels of Bax and Caspase-3 mRNA and protein were significantly up-regulated (P<0.05). As compared with those in simple H2O2group, the cell viabilities in naringenin groups pretreated for 24 hours were obviously increased, and the cell apoptosis rates and the levels of ROS and MDA were significantly decreased,moreover, the expression levels of Bcl-2 mRNA and protein were obviously up-regulated, however, the expression levels of Bax and Caspase-3 mRNA and protein were significantly down-regulated,with a dose-dependent manner (P<0.05). ConclusionNaringenin can promote proliferation of osteoblasts and inhibit apoptosis of osteoblasts mediated by oxidative stress, and its action mechanism may be correlated to up-regulating the expressions of Bcl-2 and down-regulating the expressions of Bax and Caspase-3.

naringenin;osteoblasts; oxidative stress; apoptosis

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.19.008

061001河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科(吳新濤、石晶、高樂才、吳文元、龐石磊)；河北省鹽山縣人民醫(yī)院外科(吳新峰)

R 681.4

A

1002-7386(2016)19-2915-04

2016-01-17)

項目來源：河北省中醫(yī)藥管理局科研計劃項目(編號:2016267)