氧化石墨烯色譜固定相的制備及其在食品中三聚氰胺分析中的應用

張瑤琴,艾連峰,王曼曼,王學生*,劉　珊,侯　寧

(1.華北理工大學　公共衛(wèi)生學院，河北　唐山　063000；2.河北出入境檢驗檢疫局,河北　石家莊　050000)

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氧化石墨烯色譜固定相的制備及其在食品中三聚氰胺分析中的應用

張瑤琴1,艾連峰2,王曼曼1,王學生1*,劉珊1,侯寧1

(1.華北理工大學公共衛(wèi)生學院，河北唐山063000；2.河北出入境檢驗檢疫局,河北石家莊050000)

以N,N-二環(huán)己基碳二亞胺為偶聯(lián)劑，利用氧化石墨烯表面的羧基與氨基化硅球表面的氨基反應合成了一種氧化石墨烯鍵合硅球色譜固定相，通過掃描電鏡和拉曼光譜對其進行表征，并考察了極性小分子在柱上的色譜行為。與氨基化硅球固定相相比，在相同的色譜條件下，三聚氰胺、雙氰胺等氨基化合物的保留因子明顯提高，且該固定相在親水模式下對氨基化合物具有良好的保留性能，將其作為分析柱用于雞蛋和牛奶中三聚氰胺的分析。該方法在0.2～50 μg/mL范圍內線性良好，相關系數(shù)(r)為0.999 9，定量下限為0.87 mg/kg。在1，2，10 mg/kg加標水平下的回收率為84.7%～93.9%，相對標準偏差為4.1%～6.3%。關鍵詞：氧化石墨烯；固定相；三聚氰胺；牛奶；雞蛋；高效液相色譜(HPLC)

石墨烯(Graphene)是由碳原子緊密堆積成單層二維蜂窩狀晶格結構的一種碳質新材料，因具有獨特的物理化學性質而受到廣泛關注[1]。氧化石墨烯(Graphene oxide，GO)是石墨烯的重要衍生物，由于其在單層碳原子構成的二維空間無限延伸的表面含有大量可修飾的基團(如羥基、羧基、環(huán)氧基、羰基等)，因此可在水和多種有機溶劑中較好地分散，親水性佳，生物兼容性好[2]。另外，氧化石墨烯具有較大的比表面積(石墨烯單片層表面積的理論計算值為2 630 m2/g)、高熱穩(wěn)定性和機械穩(wěn)定性，因此有望成為一種理想的分離材料[3-5]。

目前，石墨烯材料已成功用于毛細管電泳、毛細管電色譜、氣相色譜以及液相色譜固定相的合成[6-9]。2012年，Wang等[10]在毛細管中通過酸引發(fā)作用合成一種新型的GO摻雜聚合物毛細管色譜柱，并成功用于苯系物和多環(huán)芳烴的分離；Chen課題組[11]以3-氨丙基甲基二乙氧基硅烷為偶聯(lián)劑將GO修飾到毛細管柱的內壁上，并用于甲苯、乙苯和萘等有機物的分離分析；2013年，Zhang等[12]以N-羥基琥珀酰亞胺/N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS/EDC)為偶聯(lián)劑將GO鍵合到氨基硅膠表面得到一種新型液相色譜固定相，通過與C18柱對比，發(fā)現(xiàn)該固定相對于中性化合物和非極性化合物具有良好的分離性能；Liang等[13]通過層層自組裝法將GO鍵合到氨基化硅球表面，在反相色譜模式下，將得到的固定相用于苯胺、苯酚、多環(huán)芳烴和不同取代基的苯混合物的分離分析。目前，GO修飾的液相色譜固定相主要作為反相色譜模式分離目標物；且GO修飾的氣相色譜固定相和液相色譜固定相多用于具有π-π共軛結構的苯系物和多環(huán)芳烴類等中性或弱極性物質的分離，而用于極性化合物的分析較少，特別是用于實際樣品中極性小分子分析的研究未見報道。極性物質由于自身的性質，在傳統(tǒng)C18色譜柱上保留較弱或難以保留。因此，常用的色譜固定相為正相或親水固定相。如三聚氰胺是一種三嗪類含氮雜環(huán)的小分子極性化合物，采用C18柱分析時需加入辛烷磺酸鈉等離子對試劑來實現(xiàn)三聚氰胺的保留，但會造成色譜系統(tǒng)的平衡時間長，且會降低色譜柱的使用壽命。因此，目前三聚氰胺的色譜分離多采用親水型色譜柱(HILIC柱)[14-15]。

本研究以N,N-二環(huán)己基碳二亞胺為偶聯(lián)劑，通過GO表面的羧基與氨基化硅球表面的氨基反應，將GO鍵合到氨基化硅球表面得到GO@SiO2固定相。考察了三聚氰胺、4-氨基安替比林、三聚氰酸等極性化合物在GO@SiO2固定相的色譜行為。GO@SiO2固定相對三聚氰胺、4-氨基安替比林等極性化合物在親水模式下具有良好的保留性能?；谠摴潭ㄏ鄬O性分子的保留特點，將其用于三聚氰胺的分離分析，并通過優(yōu)化色譜條件建立了該固定相分析檢測雞蛋和牛奶中三聚氰胺的新方法。

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

Waters UPLC-H-class超高效液相色譜儀(UPLC，美國Waters公司)；LC-2010高效液相色譜儀(日本島津公司)；MS-H-S10 10通道標準加熱磁力攪拌器(大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司)；VORTEX GENIE旋渦混合器(美國Scientific Industries公司)；固相萃取裝置(美國Agilent Technologies公司)；TRABOVAP 氮氣吹干裝置(美國Caliper Life Sciences公司)；Milli-Q純化系統(tǒng)(美國Millipore公司)；S-4800型掃描電子顯微鏡(日本日立公司)；DXR激光拉曼光譜儀(美國Thermo公司)。

除特別說明外，所用試劑均為分析純。氨基化硅球(5 μm，天津博瑞鍵合有限公司)；氧化石墨烯(GO，中國科學院山西煤炭化學研究所)；N,N-二甲基甲酰胺(DMF，天津光復精細化工研究所)；N,N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC，北京百靈威科技有限公司)；醋酸銨(NH4OAc，北京迪馬科技)；氨水(石家莊試劑廠)；色譜純甲醇和乙腈購自Fisher Scientific(赫爾，比利時)。

標準物質：水楊酸(美國Sigma公司)，雙氰胺(DICY，美國Agela公司)，三聚氰酸(CYA)、三聚氰胺(MEL)、克倫特羅、4-氨基安替比林(AA)、4-甲氨基安替比林(MAA)(德國Dr.Ehrenstorfer公司)。

1.2GO@SiO2固定相的制備與表征

以DCC為偶聯(lián)劑，通過GO表面的羧基與氨基化硅球表面的氨基反應合成GO@SiO2填料(圖1)[16-17]：將75 mg GO分散至75 mL DMF溶液中，超聲30 min得到GO分散液。加入75 mg DCC和0.6 g氨基化硅球，并于50 ℃下攪拌24 h。反應結束后以8 000 r/min離心10 min，并用水和甲醇多次洗滌以除去未反應的GO和雜質，80 ℃烘干。將得到的GO@SiO2填料進行掃描電鏡和拉曼光譜表征。利用濕法裝柱，將空白氨基化硅球填料和合成的GO@SiO2填料裝入不銹鋼柱管(100 mm ×2.1 mm i.d.)得到色譜分析柱。

實驗考察了GO用量(7.5，37.5，75，150 mg)和包覆次數(shù)(1次、2次)對GO@SiO2填料性能的影響。以三聚氰胺、雙氰胺、克倫特羅、4-氨基安替比林、4-甲氨基安替比林、水楊酸和三聚氰酸作為目標物，對GO@SiO2色譜柱的色譜行為進行考察，通過保留因子(k)評價色譜性能。

1.3基于構筑的GO@SiO2分析柱分析測定牛奶及雞蛋中三聚氰胺

1.3.1樣品處理牛奶：取2.0 g牛奶于50 mL離心管中，加入14 mL乙腈和6 mL 10 g/L三氯乙酸溶液，搖勻，超聲20 min，振蕩提取10 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液置于另一干凈離心管中。

雞蛋：取雞蛋1枚，將蛋液攪勻，稱取5.0 g于50 mL離心管中，加入23 mL乙腈-三氯乙酸混合溶液(體積比7∶3)和2 mL 22 g/L的乙酸鉛溶液，搖勻，超聲20 min，振蕩提取10 min，10 000 r/min離心10 min，取10 mL上清液，待凈化。

凈化：按照國家標準方法[18]利用混合型陽離子固相萃取柱(PXC)對提取液進行凈化，得到的洗脫液用50 ℃氮氣吹干，加入1 mL乙腈定容，渦旋振蕩1 min，過0.22 μm濾膜，待測。

1.3.2液相色譜條件色譜柱為合成的GO@SiO2分析柱(100 mm×2.1 mm)；流動相為乙腈-10 mmol/L乙酸銨緩沖溶液(體積比80∶20)；流速為0.3 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長220 nm；進樣量為5 μL。

回收率與精密度：在牛奶、雞蛋的陰性樣品中分別添加三聚氰胺標準溶液，制成1.0,2.0，10.0 mg/kg 3個水平的加標樣品，按照前處理步驟進行提取和凈化，平行測定6次，計算回收率和精密度。

2　結果與討論

2.1GO@SiO2固定相的制備與表征

2.1.1GO用量固定DMF的用量為75 mL，GO與DCC的質量比為1∶1，選擇GO的用量分別為7.5，37.5，75，150 mg進行填料的合成。通過目標物三聚氰胺在色譜柱上的峰形和保留因子k評價不同條件所得色譜柱的性能。結果顯示，隨著GO用量的增大，GO@SiO2色譜柱對三聚氰胺的保留增強，k值增大；但當GO用量為150 mg時，在實驗條件下峰形展寬且拖尾嚴重，因此選擇GO用量為75 mg。

2.1.2GO包覆次數(shù)選擇GO用量為75 mg，固定反應條件，分別包覆1次和2次。相比于GO包覆1次的GO@SiO2色譜柱，包覆2次時，三聚氰胺的保留時間增長，k值明顯增大。但過多的GO使三聚氰胺的色譜峰展寬且拖尾嚴重，因此實驗選擇GO包覆1次的GO@SiO2色譜柱。

2.1.3GO@SiO2的表征通過掃描電鏡對氨基化硅球和GO@SiO2的表面形貌進行分析。如圖2所示，氨基化硅球的表面粗糙，經過實驗方法反應后得到的GO@SiO2可以明顯看出其表面的GO褶皺結構，說明GO成功鍵合到氨基化硅球的表面。氨基化硅球和GO@SiO2的拉曼光譜見圖3，與氨基化硅球相比，GO@SiO2在1 350 cm-1和1 580 cm-1處有明顯的特征峰，分別為D帶和G帶，進一步說明GO已成功鍵合到氨基化硅球的表面。

圖2氨基化硅球(A)和GO@SiO2(B)的掃描電鏡圖
Fig.2SEM images of NH2-SiO2(A) and GO@SiO2(B)

2.1.4GO@SiO2色譜柱對極性目標物的色譜性能考察將氨基化硅球色譜柱和GO@SiO2色譜柱分別接入高效液相色譜儀，選擇極性氨基化合物(三聚氰胺、雙氰胺、克倫特羅、4-氨基安替比林以及4-甲氨基安替比林)、酸性化合物(水楊酸和三聚氰酸)作為目標物，進行色譜行為的考察，通過保留因子k評價色譜性能。如表1所示，與氨基化硅球色譜柱相比，由于GO的引入，上述兩類目標物在保留行為上產生了較大變化。在相同色譜條件下，酸性目標物三聚氰酸和水楊酸在氨基硅球色譜柱的k高于GO@SiO2色譜柱；極性氨基化合物在GO@SiO2色譜柱上的k均高于氨基化硅球色譜柱。結果表明，該填料具有一定的親水性，在親水模式下，對所考察的帶有氨基的極性小分子具有較好的保留行為。這可能是由于GO@SiO2表面帶有未被GO包覆的氨基硅球上的氨基、硅羥基，GO表面的羧基、羥基以及非極性作用的碳鏈、石墨碳片層等基團，這些基團使得該填料具有親水色譜模式的氫鍵作用、偶極作用和靜電作用等多種次級效應。

表1　不同物質在氨基化硅球色譜柱和GO@SiO2色譜柱上色譜行為的比較Table 1　Comparison of chromatographic behavior of different substances in the NH2-SiO2 column and GO@SiO2 column

(續(xù)表1)

2.2基于GO@SiO2柱測定牛奶、雞蛋中的三聚氰胺

2.2.1流動相的選擇固定有機溶劑與水相的體積比為8∶2，考察了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液以及乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)作為流動相時對三聚氰胺分離分析的影響。結果顯示，以乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液和乙腈-10 mmol/L乙酸銨緩沖溶液(含0.1%甲酸)作為流動相時，峰展寬嚴重。而以乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液作為流動相時，峰形尖銳，響應值較高，因此選擇乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液為最佳流動相。

2.2.2流動相配比的選擇考察了不同配比的乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液流動相條件下，三聚氰胺標準溶液的保留時間和峰形。結果表明，隨著流動相中乙腈含量的增加，三聚氰胺的保留時間增長，但峰展寬、拖尾嚴重，峰形變差。綜合考慮，實驗選擇乙腈-10 mmol/L乙酸銨的比例為80∶20。

2.2.3線性范圍用乙腈將三聚氰胺標準工作液稀釋成0.2，0.5，1，2，5，10，20，50 μg/mL的系列濃度標準溶液，在優(yōu)化色譜條件下進行測定，以三聚氰胺的濃度為橫坐標(X，μg/mL)，峰面積為縱坐標(Y)作圖，得回歸方程為Y=532.33X-66.06，相關系數(shù)(r)為0.999 9，說明三聚氰胺在0.2～50 μg/mL范圍內線性關系良好。2.2.4回收率與精密度取空白牛奶、雞蛋樣品，在選定的色譜條件下進行加標回收實驗，加標水平分別為1，2，10 mg/kg，按照樣品處理方法進行提取凈化，每個水平平行測定6次。得牛奶樣品的加標回收率為84.7%～90.0%，相對標準偏差(RSD)為4.1%～6.0%；雞蛋樣品的加標回收率為89.2%～93.9%，RSD為4.1%～6.3%。圖4為牛奶、雞蛋的空白和加標樣品的色譜圖。

圖4牛奶(A,B)和雞蛋(C,D)的空白樣品及加標后的色譜圖
Fig.4Chromatograms of blank and fortified milk(A,B)and egg(C,D)samples A,C：blank samples；B,D：fortified samples

2.2.5檢出限與定量下限在優(yōu)化條件下，以基線噪聲3倍峰面積(S/N=3)對應的三聚氰胺濃度計算得到檢出限為0.25 mg/kg，以基線噪聲10倍峰面積(S/N=10)對應的三聚氰胺濃度得定量下限為0.87 mg/kg，能夠達到國家標準GB/T 22388-2008基于液相色譜對乳制品中三聚氰胺定量下限為2 mg/kg的分析要求。

3　結　論

本文合成了GO@SiO2固定相，并考察了極性化合物在該柱上的色譜行為，結果表明GO表面的含氧基團對氨基化合物具有良好的保留作用。將GO@SiO2固定相作為液相色譜固定相用于牛奶和雞蛋中三聚氰胺的分析，能夠滿足國家標準對三聚氰胺的測定要求。該GO@SiO2色譜填料的制備，擴充了氧化石墨烯固定相的應用范圍，同時也是商業(yè)化親水柱的又一補充，GO@SiO2色譜柱具有成本低、色譜行為佳、實用價值高的特點。

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Fabrication of Graphene Oxide@SiO2as Stationary Phase and Its Application in Determination of Melamine in Food Samples

ZHANG Yao-qin1,AI Lian-feng2,WANG Man-man1,WANG Xue-sheng1*，LIU Shan1，HOU Ning1

(1.School of Public Health,North China University of Science and Technology,Tangshan063000,China；2.Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantion Bureau,Shijiazhuang050000,China )

Graphene oxide(GO) has received great interest for its unique properties and potential applications in separation.Here,(GO)@SiO2composites-based stationary phase for high performance liquid chromatography(HPLC) were fabricated by covalently bonding GO onto aminosilica microspheres using N,N-dicyclohexylcarbodiimide as coupling agent.The reaction was achieved via coupling the amino groups of aminosilica and the carboxyl groups of GO.The prepared GO@SiO2was characterized by scanning electron microscopy and Raman spectroscopy.GO@SiO2composites were developed as stationary phase,and the chromatographic properties of bare SiO2and GO@SiO2were investigated by a series of polar compounds including melamine,cyanuric acid,clenbuterol,4-aminoantipyrine and 4-methylaminoantipyrine.Under the same conditions,GO@SiO2column obtained a better separation for polar analytes in hydrophilic mode and the column was used as an analytical column for the determination of melamine in egg and milk samples.The proposed method was linear over the range of 0.2-50.0 μg/mL with a correlation coefficient(r) of 0.999 9.The limit of quantitation for melamine was 0.87 mg/kg.The recoveries of melamine at three spiked levels of 1,2,10 mg/kg ranged from 84.7% to 93.9% with relative standard deviations (RSDs) of 4.1%-6.3%.

graphene oxide(GO);stationary phase;melamine;milk;egg;high performance liquid chomatography(HPLC)

2016-02-05；

2016-03-10

國家自然科學基金項目(21305028)；河北省自然科學基金項目(B2013209238，H2016209018)；河北省教育廳自然科學項目(Q2012155)；國家質檢總局項目(2013IK154，2014IK092)

王學生，碩士，教授，研究方向：衛(wèi)生化學，Tel:0315-2592086，E-mail:xswang64@163.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.08.009

O657.72；O623.732

A

1004-4957(2016)08-0981-06