克里米亞-剛果出血熱病毒可視化逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)法的建立

韓一芳　鐘璟皓　張晨　張琪　呂恒　胡丹　張錦海　王長(zhǎng)軍

210002 南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所 疾病預(yù)防控制所

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·論著·

克里米亞-剛果出血熱病毒可視化逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)法的建立

韓一芳鐘璟皓張晨張琪呂恒胡丹張錦海王長(zhǎng)軍

210002 南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所 疾病預(yù)防控制所

目的建立克里米亞剛果出血熱病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus，CCHFV)的可視化逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP)快速檢測(cè)法。方法體外合成CCHFV的S基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒，體外轉(zhuǎn)錄為模板RNA，在線設(shè)計(jì)3組LAMP引物，使用實(shí)時(shí)濁度儀篩選出最佳引物，以羥基萘酚藍(lán)(Hydroxynaphthol blue，HNB)作為指示劑，建立可視化RT-LAMP反應(yīng)體系。結(jié)果實(shí)時(shí)濁度檢測(cè)結(jié)果顯示合成的3組LAMP引物中第1組引物的擴(kuò)增效率最高， 峰值出現(xiàn)于20 min。添加環(huán)引物后，擴(kuò)增效率進(jìn)一步提高，13 min即可達(dá)到峰值。利用最佳引物建立的CCHFV可視化RT-LAMP檢測(cè)法最低檢測(cè)限濃度為10拷貝/μl，檢出時(shí)間為30 min，較巢式RT-PCR法和實(shí)時(shí)定量RT-PCR法分別高1-3個(gè)數(shù)量級(jí)。該方法穩(wěn)定性好，不會(huì)與癥狀相近的病原體如腎綜合征出血熱漢坦病毒(漢灘型和漢城型)、馬爾堡病毒、新型布尼亞病毒、埃博拉病毒(GP蛋白和VP蛋白)產(chǎn)生交叉反應(yīng)。結(jié)論建立的CCHFV可視化RT-LAMP檢測(cè)法，靈敏度好、特異度高、快速廉價(jià)、操作簡(jiǎn)單，無需開蓋即可直接觀察結(jié)果，適用于條件有限的基層單位和偏遠(yuǎn)地區(qū)。但仍需臨床樣本進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

【主題詞】克里米亞-剛果出血熱；逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；可視化檢測(cè)

Fund programs: National Special Project of Prevention and Treatment of Major Communicable Diseases(2013ZX10004103，2013ZX1004218); Jiangsu Provincial Supporting Technology (social development) Project(BE2013603)；Military Key Project(BWS14J025)

克里米亞-剛果出血熱(Crimean-Congo hemorr-hagic fever, CCHF)由克里米亞-剛果出血熱病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus, CCHFV)引起，1944年在克里米亞地區(qū)首次出現(xiàn)，隨后在剛果暴發(fā)而得名[1]。目前廣泛分布在非洲、亞洲和歐洲東南部的多個(gè)國(guó)家[2]。該病為自然疫源性疾病，宿主為牛、羊等牲畜，主要通過蜱咬傳播至人。主要臨床癥狀為高熱、頭暈、頭痛、嘔吐、出血等，病死率超過30%[1,3]。目前尚缺乏有效的CCHF疫苗[4]，而WHO推薦的主要治療藥物利巴韋林在臨床應(yīng)用中存在較大爭(zhēng)議，僅在發(fā)病早期使用能夠取得較好的療效[5]。我國(guó)CCHF疫源地局限于新疆巴楚地區(qū)，而該地區(qū)醫(yī)療和科研水平相對(duì)落后。因此，建立一套簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)、快速有效的CCHFV檢測(cè)方法能夠?yàn)榛颊郀?zhēng)取最佳治療時(shí)間，同時(shí)對(duì)于偏遠(yuǎn)地區(qū)疫情的防控具有重要的意義。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是由日本學(xué)者Notomi在2000年發(fā)明[6]。該技術(shù)操作簡(jiǎn)便快捷，具有高度的敏感性和特異性，結(jié)合顯色劑可肉眼判斷結(jié)果，非常適合疫情現(xiàn)場(chǎng)或條件有限的實(shí)驗(yàn)室對(duì)病原實(shí)現(xiàn)快速診斷。

本課題通過序列分析比對(duì)選擇出同源性較高的病毒株的S基因(GenBank: KJ682823.1)進(jìn)行全基因合成，構(gòu)建重組質(zhì)粒后體外轉(zhuǎn)錄為模板RNA，同時(shí)設(shè)計(jì)RT-LAMP引物，以羥基萘酚藍(lán)(Hydroxyna-phthol blue，HNB)作為指示劑，建立對(duì)CCHFV 的可視化快速檢測(cè)方法。

1　材料與方法

1.1主要儀器試劑Loopamp實(shí)時(shí)濁度儀(LA-320C，北京藍(lán)譜公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI 7500 Fast,美國(guó)Applied biosystems公司)，PCR儀(TC-512，英國(guó)Techne公司)，微量分光光度計(jì)(OD-1000+，One Drop)，線性化質(zhì)粒載體pGEM-T easy、Riboprobe System-T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Promega公司)，膠回收試劑盒、SanPrep柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒(上海生工生物工程有限公司)，RT-LAMP擴(kuò)增試劑盒(北京藍(lán)譜生物科技有限公司)，羥基萘酚藍(lán)(美國(guó)Sigma公司)，限制性內(nèi)切酶(SpeI)、One Step PrimeScriptTMRT-PCR、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit、TaKaRa TaqTM、dNTP mixture、250 bp DNA Ladder Marker(大連寶生物工程有限公司)

1.2標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的構(gòu)建在NCBI公共數(shù)據(jù)庫中，以“Crimean-Congo hemorrhagic、complete、S”為關(guān)鍵詞搜索CCHFVS基因全長(zhǎng)片段共80條，利用MEGA4.0軟件進(jìn)行比對(duì)分析，選擇同源性較高的S基因片段(GenBank: KJ682823.1；1660 bp)，委托上海生工公司進(jìn)行基因合成。將合成的S基因全長(zhǎng)片段連接至pGEM-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒，酶切鑒定后測(cè)序確證。轉(zhuǎn)化擴(kuò)增小提質(zhì)粒后，測(cè)定其濃度和純度備用。

1.3重組質(zhì)粒的線性化及濃度測(cè)定為了獲得S基因全長(zhǎng)序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，須將所構(gòu)建重組質(zhì)粒線性化。選定S基因上不存在，而在pGEM-T載體上僅有一個(gè)的SpeI酶切位點(diǎn)，將重組質(zhì)粒用SpeI內(nèi)切酶于37℃消化2 h，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，觀察線性化結(jié)果，回收純化，測(cè)定濃度及純度后備用。

1.4體外轉(zhuǎn)錄和模板RNA標(biāo)準(zhǔn)品的制備按照Riboprobe System-T7試劑盒說明進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。室溫配制反應(yīng)體系(20 μl)：5×磷酸鹽緩沖液4 μl，二硫蘇糖醇(100 mmol/L)2 μl，核酸酶抑制劑(40 U)1 μl，核糖核苷三磷酸(rNTP，終濃度各為0.5 mmol/L)4 μl，T7 RNA聚合酶(18U)1 μl，線性化質(zhì)粒6 μl，RNase Free water 2 μl，37℃水浴1 h轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，加1.5 μl脫氧核糖核酸酶(RQ 1 RNase Free DNase，1 U/μl)，37℃繼續(xù)反應(yīng)20 min以去除DNA模板；然后用RNA純化試劑盒純化轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，測(cè)定體外轉(zhuǎn)錄RNA產(chǎn)物的濃度和純度，計(jì)算拷貝數(shù)，計(jì)算公式為：拷貝數(shù)=RNA，濃度(g/μl)×加樣體積×阿氏常數(shù)/(質(zhì)?？傞L(zhǎng)度×1個(gè)bp的平均分子量)。

1.5環(huán)引物恒溫?cái)U(kuò)增法的建立

1.5.1LAMP引物的篩選:利用LAMP在線引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer software 4.0(http://primerexplorer.jp/elamp 4.0.0/index.html)設(shè)計(jì)基于CCHFVS基因全長(zhǎng)片段(GenBank: KJ682823.1)的3套引物，每套引物包括兩條外引物(F3、B3)、兩條內(nèi)引物(FIP、BIP)及兩條環(huán)引物(LF、LB)，由上海生工公司進(jìn)行合成和純化。引物序列見表1；反應(yīng)體系如下：2×反應(yīng)液(RM)12.5 μl，F(xiàn)IP、BIP各16 μmol/L，F(xiàn)3、B3各2 μmol/L，酶混合液(EM)1 μl，模板5 μl，加超純水至25 μl；反應(yīng)條件為63℃ 60 min，80℃ 5 min；每次反應(yīng)均設(shè)陰性對(duì)照，以超純水作為反應(yīng)模板。通過濁度儀實(shí)時(shí)觀察擴(kuò)增曲線，選擇濁度最高、擴(kuò)增速率最快的一組引物為最佳引物進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)。

表1　克里米亞剛果出血熱病毒RT-LAMP擴(kuò)增引物

1.5.2快速檢測(cè)法和常規(guī)檢測(cè)法的比較:由于環(huán)引物并非恒溫?cái)U(kuò)增法所必需，為評(píng)估反應(yīng)體系中環(huán)引物(LF和LB)存在與否，是否具有增加反應(yīng)速率的作用，以108拷貝/μl的體外轉(zhuǎn)錄RNA作為模板，2管平行擴(kuò)增，其中1管在上述反應(yīng)體系中加入環(huán)引物(LF、LB各8 μmol/L)，比較添加環(huán)引物的快速檢測(cè)法與不添加環(huán)引物的常規(guī)法在擴(kuò)增效率上的差別。

1.5.3靈敏度的測(cè)定:將濃度為107拷貝/μl的體外轉(zhuǎn)錄RNA用無酶水10倍比梯度稀釋至10 拷貝/μl，以梯度稀釋液作為模板進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，反應(yīng)體系為2×反應(yīng)液(RM)(pH8.8) 12.5 μl，引物混合液(FIP、BIP各16 μmol/L，F(xiàn)3、B3各2 μmol/L，LF、LB各8 μmol/L)2.5 μl，酶混合液(EM)1 μl，模板5 μl，HNB指示劑(終濃度150 μmol/L)，加超純水至25 μl；反應(yīng)條件為63℃ 60 min，80℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后肉眼觀察反應(yīng)管顏色變化，藍(lán)紫色為陰性反應(yīng)，淺藍(lán)色為陽性反應(yīng)。為了明確檢測(cè)最低限，將RNA模板進(jìn)一步稀釋至更低濃度，取10 拷貝/μl、5 拷貝/μl、2 拷貝/μl和1 拷貝/μl 4個(gè)濃度梯度的模板按上述反應(yīng)體系和條件分別進(jìn)行3次RT-LAMP檢測(cè)。

1.5.4穩(wěn)定性測(cè)定:選取與CCHF癥狀相似，在實(shí)際疫情過程中需與之鑒別診斷的腎綜合征出血熱漢坦病毒漢灘型、漢城型、馬爾堡病毒、新型布尼亞病毒、埃博拉病毒(GP蛋白和VP蛋白)作為模板檢測(cè)所建立方法的穩(wěn)定性，檢測(cè)體系同上。

1.6實(shí)時(shí)定量PCR法的檢測(cè)選用已報(bào)道的針對(duì)S基因的實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(real-time reverse transcription PCR, qRT-PCR)引物[7]，由上海生工生物工程有限公司合成純化。以CCHFV體外轉(zhuǎn)錄RNA產(chǎn)物的10倍比梯度稀釋液作為模板，使用ABI7500 Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：2×One Step RT-PCR Buffer III 10 μl， TaKaRa Ex Taq HS 0.4 μl，PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.4 μl，上游引物和下游引物(10 μmol/L)各 0.4 μl，熒光探針(10 μmol/L)0.8 μl，ROX Dye II 0.4 μl，模板2 μl，加超純水至20 μl。反應(yīng)條件：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)42℃ 5 min、95℃10 s；擴(kuò)增反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，95℃ 5 s、60℃ 34 s。

圖1　不同LAMP實(shí)驗(yàn)條件下的實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線Fig.1　Real-time turbidity curves of different condition for LAMP amplification

1.7巢式PCR法的檢測(cè)選用文獻(xiàn)[8]中的巢式PCR引物，將CCHFV體外轉(zhuǎn)錄RNA產(chǎn)物的10倍梯度倍比稀釋液作為第1輪模板進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1 μl，2×Buffer 12.5 μl，上游引物和下游引物(10 μmol/L)各1 μl，模板2 μl，加無酶水至25 μl。反應(yīng)條件：50℃ 30 min、94℃ 2 min；擴(kuò)增反應(yīng)30個(gè)循環(huán)(94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 45 s)；72℃ 10 min延伸。以第1輪擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋500倍作為第2輪擴(kuò)增的模板，反應(yīng)體系：第2輪上游引物和下游引物(10 μmol/L)各1 μl，10×Buffer 2.5 μl，dNTP Mixture(10 μmol/L)0.5 μl，TaKaRa Taq酶0.5 μl，模板2 μl，加超純水至25 μl。反應(yīng)條件：95℃ 2 min；40個(gè)循環(huán)(94℃ 1 min、56℃ 30 s、72℃ 45 s)；72℃ 10 min，4℃保存。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳成像，確定巢式PCR檢測(cè)的敏感性。

2　結(jié)果

2.1LAMP檢測(cè)方法的確立

2.1.1引物的篩選:使用所設(shè)計(jì)的3組引物擴(kuò)增后發(fā)現(xiàn)，第1組引物擴(kuò)增效率較高，約16 min開始擴(kuò)增，峰值出現(xiàn)于20 min；而第2組和第3組引物均在25 min以后開始擴(kuò)增，峰值出現(xiàn)在30 min前后(圖1A)，故選擇第1組引物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。比較第1組引物常規(guī)擴(kuò)增及快速擴(kuò)增的差異，添加環(huán)引物后，擴(kuò)增效率明顯提高，開始擴(kuò)增時(shí)間由第16 min提前至10 min，峰值由20 min提前至13 min(圖1B)。

2.1.2LAMP靈敏度:將107拷貝/μl 的CCHFV體外轉(zhuǎn)錄RNA產(chǎn)物進(jìn)行10倍比稀釋至10 拷貝/μl，以梯度稀釋液作為模板擴(kuò)增。經(jīng)檢測(cè)，實(shí)時(shí)濁度儀顯示107拷貝/μl到10 拷貝/μl均有擴(kuò)增，而以去離子水作為陰性對(duì)照的反應(yīng)孔無擴(kuò)增(圖2A)；同時(shí)，HNB指示劑顯色結(jié)果與實(shí)時(shí)濁度儀結(jié)果一致，陰性對(duì)照孔仍為初始未反應(yīng)的藍(lán)紫色，而107拷貝/μl到10 拷貝/μl反應(yīng)孔變?yōu)殛栃缘臏\藍(lán)色(圖2B)。為進(jìn)一步明確LAMP反應(yīng)的最低檢測(cè)限，將10 拷貝/μl、5 拷貝/μl、2 拷貝/μl和1 拷貝/μl濃度的模板分別進(jìn)行3次重復(fù)反應(yīng)，結(jié)果10 拷貝/μl濃度的模板3次反應(yīng)均為陽性，而其余3個(gè)濃度的模板3次反應(yīng)均為陰性，因此，所建立的CCHFV可視化LAMP檢測(cè)方法檢測(cè)限濃度為10 拷貝/μl。

2.1.3LAMP穩(wěn)定性以所引起疾病癥狀接近的病原體作為模板，檢測(cè)所建立方法的穩(wěn)定性。實(shí)時(shí)濁度儀顯示僅CCHFV反應(yīng)孔進(jìn)行了擴(kuò)增反應(yīng)，其余反應(yīng)管均未發(fā)生擴(kuò)增，且HNB指示劑顯色結(jié)果與實(shí)時(shí)濁度儀結(jié)果一致，僅CCHFV孔變?yōu)榱岁栃詼\藍(lán)色，陰性對(duì)照孔和其余病原體反應(yīng)孔均為陰性藍(lán)紫色。所建立的CCHFV可視化LAMP檢測(cè)方法穩(wěn)定性良好。

圖2　可視化LAMP檢測(cè)法敏感度的測(cè)定Fig.2　Sensitivity test of the visual LAMP assay

注：1　CCHFV； 2　腎綜合征出血熱漢坦病毒漢灘型； 3　腎綜合征出血熱漢坦病毒漢城型； 4　馬爾堡病毒； 5　新型布尼亞病毒； 6　埃博拉病毒GP蛋白；7　埃博拉病毒VP蛋白圖3　可視化LAMP檢測(cè)法穩(wěn)定性測(cè)定Note: 1　CCHFV; 2　Hantaan virus; 3　Seoul virus; 4　Marburg virus; 5　severe fever with thrombocytopenia syndrome bunya virus; 6　Ebola virus GP; 7　Ebola virus VPFig.3　Stability test of the visual LAMP assay

2.2實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)

2.2.1靈敏度的檢測(cè):此次實(shí)驗(yàn)同時(shí)選用之前報(bào)道的qRT-PCR方法對(duì)CCHFV進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)，將CCHFV體外轉(zhuǎn)錄RNA產(chǎn)物的1010拷貝/μl倍比梯度稀釋至10 拷貝/μl，以梯度稀釋液作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)拷貝數(shù)設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，1010至104拷貝/μl有良好的擴(kuò)增曲線，103和102拷貝/μl擴(kuò)增曲線重復(fù)，且Ct值均大于35，不能判斷為陽性，而10 拷貝/μl與陰性擴(kuò)增線重合，所報(bào)道的qRT-PCR方法對(duì)本方法CCHFV標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)限為104拷貝/μl。

2.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:由于文獻(xiàn)報(bào)道的qRT-PCR方法對(duì)不同CCHFV標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)限不同，為方便對(duì)比及定量，選擇中間5個(gè)點(diǎn)，105、106、107、108、109拷貝/μl擬合繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=58.199-4.754×lgX，R2=0.993。

2.3巢式RT-PCR檢測(cè)將107拷貝/μl 的CCHFV體外轉(zhuǎn)錄RNA產(chǎn)物進(jìn)行10倍比稀釋至10 拷貝/μl，以梯度稀釋液作為巢式PCR第1輪擴(kuò)增的模板。以第1輪擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋500倍作為模板進(jìn)行第2輪擴(kuò)增， 107拷貝/μl-102拷貝/μl模板在200 bp處有擴(kuò)增，10 拷貝/μl和陰性對(duì)照無擴(kuò)增。

3　討論

我國(guó)首次出現(xiàn)關(guān)于CCHF的報(bào)道是1965年在新疆巴楚縣發(fā)生11例出血熱，其中10人死亡，由于當(dāng)時(shí)認(rèn)為病原體是一種新的蟲媒病毒，故定名為新疆出血熱病毒(Xinjiang hemorrhagic fever virus, XHFV)，后經(jīng)電鏡觀察和血清學(xué)交叉反應(yīng)等一系列研究證實(shí)，XHFV與CCHFV為同一種病毒。CCHFV屬于布尼亞病毒科內(nèi)羅病毒屬，為分節(jié)段單股負(fù)鏈RNA病毒，其基因組的3個(gè)節(jié)段L、M、S分別編碼病毒的RNA多聚酶、膜蛋白G1和G2、核衣殼蛋白NP，其中S基因編碼的NP為結(jié)構(gòu)蛋白，較為保守。因此，本研究選用國(guó)際上通用[9,10]的編碼CCHFV保守NP蛋白的S基因作為目的片段建立LAMP反應(yīng)，保證了對(duì)不同CCHFV毒株的檢出能力，其他大多數(shù)針對(duì)CCHFV的核酸檢測(cè)研究也選擇S基因作為檢測(cè)靶標(biāo)[7,8,11,12]。構(gòu)建的重組質(zhì)粒及體外轉(zhuǎn)錄RNA標(biāo)準(zhǔn)品可用于CCHF疫情暴發(fā)時(shí)的陽性對(duì)照。

本研究建立的CCHFV可視化RT-LAMP檢測(cè)方法具有很好的穩(wěn)定性，和引起癥狀相近的病原體如腎綜合征出血熱漢坦病毒(漢灘型和漢城型)、馬爾堡病毒、新型布尼亞病毒、埃博拉病毒(GP蛋白和VP蛋白)無交叉反應(yīng)，可用于不明原因出血熱的鑒別診斷。同時(shí)，本方法的最低檢測(cè)限濃度為10 拷貝/μl，優(yōu)于Kamboj等[11]報(bào)道的TaqMan rRT-PCR的檢測(cè)限76 拷貝。盡管Atkinson等[7]所建立的qRT-PCR方法的最低檢測(cè)限可達(dá)到5 拷貝，但檢出率僅為75%左右，且并不是在所有儀器條件下都可實(shí)現(xiàn)，在我們的實(shí)驗(yàn)條件下使用其引物探針進(jìn)行重復(fù)，檢測(cè)限濃度僅達(dá)到104拷貝/μl。同樣，采用文獻(xiàn)報(bào)道的巢式RT-PCR引物探針序列[8]進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，發(fā)現(xiàn)該方法的檢測(cè)限為102拷貝/μl，較LAMP法的敏感性低一個(gè)數(shù)量級(jí)。此外，本研究建立的RT-LAMP方法檢出10 拷貝/μl的模板只需30 min，相對(duì)于巢式RT-PCR法和qRT-PCR法來說大大縮短了反應(yīng)時(shí)間，且脫離了對(duì)精密溫控儀器的依賴。

本研究采用HNB顯色的方法來判斷是否發(fā)生了LAMP擴(kuò)增，其原理為：HNB顏色的變化取決于溶液的pH值，在鎂離子濃度為8 mmol/L、不存在dNTPs的情況下，pH值為8.6-9.0時(shí)，溶液呈洋紅色，當(dāng)pH值為8.4時(shí)，溶液呈藍(lán)紫色；而在溶液中存在dNTPs的情況下，無論溶液的pH值是多少，HNB均呈藍(lán)紫色。由于LAMP反應(yīng)緩沖液中包含dNTPs，且pH值為8.8，在此條件下，HNB可以用來指示溶液中鎂離子濃度的變化。反應(yīng)開始前，體系中鎂離子濃度為8 mmol/L，HNB呈藍(lán)紫色，隨著LAMP擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行，鎂離子濃度逐漸降低，HNB逐漸變?yōu)闇\藍(lán)色。因此，通過反應(yīng)前后HNB顏色的變化即可間接判斷是否發(fā)生了LAMP擴(kuò)增[13]。雖然Osman等[8]已經(jīng)利用電泳法和SYBR Green染料法建立了CCHFV的LAMP檢測(cè)方法，但采用電泳法檢測(cè)LAMP終點(diǎn)產(chǎn)物不僅耗時(shí)、繁瑣，且開蓋后極易造成氣溶膠污染，而使用SYBR Green染料不僅特異性低，還會(huì)抑制LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，降低檢測(cè)靈敏度[14]。相比之下，本研究采用反應(yīng)前加入HNB顯色劑來肉眼判斷LAMP擴(kuò)增結(jié)果的方法不僅可避免開蓋污染問題，而且具有高度的敏感性和特異性，相對(duì)于其他LAMP產(chǎn)物鑒定方法來說具有明顯的優(yōu)勢(shì)。

本課題組使用HNB所建立的CCHFV可視化LAMP檢測(cè)法，僅需一個(gè)恒溫水浴鍋即可在20-40 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)CCHFV的快速檢測(cè)，在高靈敏度，高特異度的基礎(chǔ)上，具備了快速廉價(jià)，所需實(shí)驗(yàn)條件簡(jiǎn)單，無需開蓋觀察結(jié)果等諸多優(yōu)點(diǎn)，然而目前由于疫情地的局限性，尚缺少臨床樣本進(jìn)行驗(yàn)證。但本方法的建立適用于條件有限的基層單位和偏遠(yuǎn)地區(qū)，對(duì)幫助指導(dǎo)臨床及早用藥救治患者，降低病死率具有現(xiàn)實(shí)意義。

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A reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for rapid visual detection of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus

HanYifang,ZhongJinghao,ZhangChen,ZhangQi,LyuHeng,HuDan,ZhangJinhai,WangChangjun

DepartmentofDiseaseControlandPrevention,ResearchInstituteforMedicineofNanjingCommand,Nanjing210002,China

Correspondingautor:WangChangjun,Email:science2008@hotmail.com;ZhangJinhai,Email:ahoi@163.com

ObjectiveTo develop a reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid and visual detection of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus. MethodsThe recombinant plasmid containing theSgene of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus was constructed usinginvitrogene synthesis. The most effective primers of the three sets of RT-LAMP primers, designed by Primer Explorer software 4.0, was selected using real-time turbidimetry. Hydroxynaphthol blue (HNB) as the indicator was used to judge the result. ResultsThe result of real-time turbidimetry showed that the first set of primers had the highest amplification efficiency with a peak time of 20 min. The amplification efficiency was accelerated after adding loop primers, of which the peak time was 13min. The detection limit concentration of this method was 10copies/μl with a detection time of 30 min, which was 10-fold and 1000-fold higher than that of nests RT-PCR and quantitative real-time RT-PCR, respectively. This method has great stability. No cross-reactions were observed between Hantavirus, Marburg virus, severe fever with thrombocytopenia syndrome bunya virus, or Ebola virus. ConclusionsThe visual RT-LAMP assay could detect Crimean-Congo hemorrhagic fever virus with less labor and time consuming sensitively and specifically. This lower-cost method could effectively avoid aerosol pollution. It might be applicable for the routine surveillance of Crimean-Congo hemorrhagic fever in unequipped organizations or remote area. Clinical samples are warranted to evaluate the value of this method.

Crimean-Congo hemorrhagic fever; RT-LAMP; Visual detection

王長(zhǎng)軍，Email: science2008@hotmail.com; 張錦海，Email: ahoi@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.04.005

國(guó)家重大傳染病防治專項(xiàng)(2013ZX10004103，2013ZX1004218)；江蘇省科技支撐計(jì)劃(社會(huì)發(fā)展)項(xiàng)目(BE2013603)；軍隊(duì)重點(diǎn)項(xiàng)目(BWS14J025)

2016-02-18)