云南省62例發(fā)熱患者中蚊傳蟲媒病毒感染的病原學(xué)檢測

黃瑛　付士紅　史蕾　陳海云　曹玉璽　何花　李曉龍　羅云　崔世恒　徐俊　王力華　李文明　顧大勇　徐云龍　梁國棟

650041 昆明，云南省昆明市第三人民醫(yī)院(黃瑛、陳海云、何花、羅云、徐俊、李文明)；102206 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所(付士紅、曹玉璽、李曉龍、崔世恒、王力華、梁國棟)；518033 深圳國際旅行衛(wèi)生保健中心(史蕾、顧大勇、徐云慶)

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·論著·

云南省62例發(fā)熱患者中蚊傳蟲媒病毒感染的病原學(xué)檢測

黃瑛付士紅史蕾陳海云曹玉璽何花李曉龍羅云崔世恒徐俊王力華李文明顧大勇徐云龍梁國棟

650041 昆明，云南省昆明市第三人民醫(yī)院(黃瑛、陳海云、何花、羅云、徐俊、李文明)；102206 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所(付士紅、曹玉璽、李曉龍、崔世恒、王力華、梁國棟)；518033 深圳國際旅行衛(wèi)生保健中心(史蕾、顧大勇、徐云慶)

黃瑛，付士紅和史蕾同為第一作者

目的查明云南省疑似蚊傳蟲媒病毒感染的發(fā)熱患者中病原體的種類及生物學(xué)特性。方法針對2013年昆明市第三人民醫(yī)院傳染科收集的62例疑似蚊傳蟲媒病毒感染發(fā)熱患者急性期血清標(biāo)本，使用血清學(xué)和分子生物學(xué)方法對這些標(biāo)本開展3種蚊媒病毒(登革病毒、乙腦病毒和基孔肯雅病毒)感染的檢測。結(jié)果62例血清標(biāo)本中，27例呈現(xiàn)蚊媒病毒感染陽性，占全部病例44%(27/62)。檢測陽性患者中，82%(22/27)為登革病毒感染，18%(5/27)為乙腦病毒感染，未檢測到基孔肯雅病毒感染陽性。全部登革病毒感染患者均顯示登革病毒IgM抗體陽性，其中含12例患者呈登革病毒基因檢測陽性。登革病毒分型結(jié)果顯示，12例登革病毒基因檢測陽性標(biāo)本中含有3種血清型登革病毒，分別為，1型登革病毒(5例)，3型登革病毒(5例)，4型登革病毒感染(2例)。5例病例標(biāo)本為乙腦病毒IgM抗體陽性，未檢測到乙腦病毒基因陽性。流行病學(xué)分析結(jié)果顯示，登革和乙腦病例主要發(fā)生在6-10月。且22例登革病毒感染中19例患者為輸入性病例。結(jié)論云南省疑似蚊傳病毒感染發(fā)熱患者以登革病毒感染為主，且登革病毒感染陽性病例大部分為輸入性病例，感染的登革病毒來源于東南亞國家的流行株。

【主題詞】發(fā)熱患者；蚊媒病毒；登革熱

由于蚊蟲傳播病毒可隨貨物運輸或者人群流動等傳播到異地造成疾病在新的地區(qū)的流行，成為當(dāng)?shù)亍靶掳l(fā)傳染病”[1,2]，因此，蚊傳蟲媒病毒的檢測與監(jiān)測，特別是在邊境地區(qū)的蚊傳蟲媒病毒感染患者的檢測與監(jiān)測引起各個國家的關(guān)注[3]。近年來中國發(fā)生多起由輸入病例引起登革熱[4]和基孔肯雅熱在當(dāng)?shù)氐木植苛餍?，造成了巨大疾病?fù)擔(dān)，同時對當(dāng)?shù)毓残l(wèi)生帶來巨大威脅。

為了查明發(fā)熱患者中病原體感染的種類，本研究對2013年本院全年收集的疑似蚊傳蟲媒病毒感染患者急性期血清做病原學(xué)檢測，在患者急性期血清標(biāo)本中檢測到27例患者感染登革病毒或乙型腦炎病毒抗體或病毒核酸，其中大部分為老撾，緬甸國的輸入性病例。

1　材料與方法

1.1標(biāo)本采集2013年1-12月在昆明市第三人民醫(yī)院傳染科收集發(fā)熱病例患者，臨床醫(yī)生根據(jù)病例臨床癥狀和流行病學(xué)信息等篩選出疑似蚊蟲傳播病毒感染患者并分別采集患者急性期血清標(biāo)本。采集急性期血液，實驗室分離血清，分裝后保存于超低溫冰箱備檢。

1.2標(biāo)本檢測由于所有標(biāo)本均采集自臨床發(fā)熱患者急性期標(biāo)本，因此本研究僅選擇病原體感染早期的核酸檢測和病毒特異性IgM抗體檢測。每一份血清標(biāo)本分別平行檢測3種蚊媒傳播病毒(登革病毒、乙腦病毒、基孔肯雅病毒)的核酸與病毒IgM抗體。

1.2.1Real-time RT-PCR檢測蟲媒病毒基因:按照QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA) 試劑盒說明書使用提取血清中RNA。使用三種病毒(登革病毒，乙腦病毒，基孔肯雅病毒)基因擴增引物檢測。使用Applied BioSystems 7500 Real Time PCR Machine (Life Technologies Corporation, CA, USA).開展Real-time RT-PCR擴增。使用一步發(fā)擴增病毒基因(the AgPath-IDTM One-Step RT-PCR Kit (Life Technologies Corporation, CA, USA)。每一反應(yīng)體系為25 μl，其中12.5 μl緩沖液，3.5 μl無核酸酶液體, 1 μl 25×RT-PCR Enzyme Mix, 1 μl引物(10 μmol/L)，1 μl探針(3 μmol/L)和5 μl RNA提取液。反轉(zhuǎn)錄50℃30 min，包括95℃5 min，40個循環(huán)，95℃10 s，55℃45 s。判定標(biāo)準(zhǔn)：Ct值小于等于35為陽性。

1.2.2蚊媒病原體特異性IgM抗體及抗原檢測:乙腦病毒、登革病毒和基孔肯雅病毒IgM抗體試劑盒為澳大利亞產(chǎn)品：乙腦/登革檢測試劑為JE-DENGUE IgM COMBO ELISA (Ref：E-JEDOIC; Lot:13156, Panbio, Australia)；基孔肯雅病毒檢測試劑Chikungunya Virus IgM Capture ELISA (Ref:CHIM0590; Lot:CHIM-039; NOVATEC, Germany)。各種檢測嚴(yán)格按照試劑盒說明書要求操作。

1.2.3病毒分離：將患者急性期血清平行接種蚊蟲細(xì)胞系(C6/36)單層和哺乳動物細(xì)胞(BHK)單層，分別于28℃和37℃培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變(CPE)。

2　結(jié)果

2.1標(biāo)本采集昆明市第三人民醫(yī)院傳染科共收集到62例疑似蚊傳蟲媒病毒感染患者急性期血清標(biāo)本和相關(guān)流行病學(xué)信息。圖1可見各月采集標(biāo)本數(shù)量，62例病例除1月和11月份以外，在其他各月均有分布，其中6-10月病例占全年總病例數(shù)的79%(49/62)。

2.2蚊傳蟲媒病毒檢測通過對每一份標(biāo)本的病毒基因擴增和病毒特異性IgM抗體的平行檢測，發(fā)現(xiàn)22例病例為登革病毒IgM抗體陽性，12例登革病毒基因檢測陽性，5例乙腦IgM抗體陽性(表1)。

2.2.1蚊傳蟲媒病毒基因檢測：

2.2.1.1登革病毒基因檢測：對所有62例患者標(biāo)本首先進(jìn)行登革病毒基因通用引物的檢測，并對陽性標(biāo)本開展1-4血清型登革病毒基因檢測。結(jié)果顯示，62例患者標(biāo)本中12例為登革病毒通用引物基因檢測陽性。登革病毒分型檢測結(jié)果顯示：5例為登革1型病毒、5例為登革3型病毒、2例為登革4型病毒，未檢測到登革2型病毒陽性。

表1　昆明市第三人民醫(yī)院診治蚊傳蟲媒病毒感染患者信息

圖1　蚊傳蟲媒病毒感染病例時間分布Fig.1　Time distribution of mosquito borne virus infection cases)

2.2.1.2乙腦病毒和基孔肯雅病毒基因檢測： 對62例患者標(biāo)本平行檢測乙腦病毒和基孔肯雅病毒基因，檢測結(jié)果均為陰性。

2.2.2蚊傳蟲媒病毒IgM抗體檢測：2.2.2.1登革病毒和乙腦病毒IgM抗體檢測： 使用乙腦和登革病毒IgM抗體聯(lián)合檢測試劑盒對所有血清標(biāo)本進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，62例患者標(biāo)本中22例標(biāo)本為登革病毒IgM抗體陽性，5例為乙腦病毒IgM抗體陽性。使用乙腦病毒IgM抗體單項檢測試劑對標(biāo)本進(jìn)行再次檢測，檢測結(jié)果與乙腦和登革病毒IgM抗體聯(lián)合檢測試劑的檢測結(jié)果相同。2.2.2.2基孔肯雅病毒IgM抗體檢測：62例患者血清標(biāo)本的基孔肯雅病毒IgM抗體檢測均為陰性。2.3病毒分離所有62份臨床發(fā)熱患者急性期血清標(biāo)本分別接種于蚊蟲組織培養(yǎng)細(xì)胞(C6/36)和哺乳動物組織培養(yǎng)細(xì)胞(BHK)。接種后逐日觀察細(xì)胞病變，連續(xù)培養(yǎng)至第5天與對照組相比未見明顯異常。將細(xì)胞培養(yǎng)上清液平行檢測登革病毒，乙腦病毒和基孔肯雅病毒核酸，結(jié)果均為陰性。2.4蚊傳蟲媒病毒感染的時間分布登革病毒感染病例集中在6-10月，而乙腦病例則分布在7，9和10月。22例登革病例中19例患者在患病前曾有過緬甸，老撾和泰國等東南亞國家的旅行史，或為來自于這些國家的公民(表1)。

3　討論

登革熱被認(rèn)為是人類面臨的最重要的蚊媒傳染病[5,6]。本研究所檢測到的22例登革病毒感染陽性患者中，只有3例患者為西雙版納居民；其余19例患者中有17例具有到緬甸、老撾和泰國工作，經(jīng)商或者旅游的經(jīng)歷，另外2例分別為緬甸和泰國公民。這些患者中一部分為在國外居住期間患病而到昆明市第三人民醫(yī)院就診，一部分為從當(dāng)年登革熱流行地區(qū)的西雙版納和瑞麗醫(yī)院轉(zhuǎn)診到本醫(yī)院就診?？梢姳敬蔚歉锊《緳z測陽性患者中大部分為國外感染的輸入性病例和云南省登革流行區(qū)的登革熱病例，無昆明市本地病例。

根據(jù)登革病毒全基因組分子遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，在我國南方流行的登革病毒毒株為輸入性[6]。本研究中含12例登革病毒基因檢測陽性標(biāo)本，分子分型研究顯示12例陽性標(biāo)本中包含三種血清型登革病毒，分別來自泰國3例(2例1型，1例3型)，緬甸5例(3例1型，2例4型)，老撾2例(均為3型)，西雙版納2例(3型)。鑒于本研究中22例登革病毒感染陽性患者中19例具有東南亞國家旅行史，而這些患者感染的登革病毒與所在國流行的登革病毒相一致，可見以上病例感染的病毒主要來源于東南亞國家流行的病毒。

云南省西雙版納和瑞麗市出現(xiàn)登革熱暴發(fā)流行的疫情，登革病毒分子生物學(xué)研究結(jié)果顯示，西雙版納分離43株登革病毒均為登革3型病毒[7]。而瑞麗登革熱流行期間5株為登革病毒1型，而其他12株均為2型登革病毒[8]，病毒分子遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)這些毒株均與新加坡、泰國、柬埔寨等東南亞國際流行株親緣關(guān)系最近，提示當(dāng)?shù)亓餍卸局隇闁|南亞輸入性病毒。

數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)就登革熱患者而言，臨床診斷與實驗室檢測結(jié)果具有較高一致性。此外，本檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)5例患者標(biāo)本為乙腦病毒IgM抗體陽性，根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)指南可以診斷為乙腦病毒感染[9]，但是臨床診斷中無一例為乙腦患者。眾所周知，乙腦多發(fā)生于15歲以下兒童[10，11]，而此次檢測5例乙腦病毒感染患者年齡在27-49歲之間，為成人乙腦病例，無一例為兒童病例。5例乙腦患者標(biāo)本未檢測到病毒基因陽性，無法從病毒基因組角度分析其感染來源，也無法了解其原始感染是在境外或是在我國境內(nèi)感染，今后應(yīng)該加強云南省大年齡組乙腦病毒感染病例的流行病學(xué)和病毒基因組研究。

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Detection of mosquito-borne arbovirus infectious in sixty two feverish patients of Yunnan

HuangYing,FuShihong,ShiLei,ChenHaiyun,CaoYuxi,HeHua,LiXiaolong,LuoYun,CuiShiheng,XuJun,WangLihua,LiWenming,GuDayong,XuYunlong,LiangGuodong

3rdpeople′shospitalinkunmingofYunnanprovince,Kunming650041,China(HuangY,ChenHY,HeH,LuoY,XuJ,LiWM);NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China(FuSH,CaoYX,LiXL,CuiSH,WangLH,LiangGD);ShenZhenInternationalTravelHealthcareCenter,,Shenzhen518000,China(ShiL,GuDY,XuYL)

HuangYing,FuShihongandShiLeiarethefirstauthorswhocontributedequallytothearticle

HuanYing,Email:hyxanni6@sina.com;LiangGuodong,Email:gdliang@hotmail.com

ObjectiveTo find out the pathogens that caused the feverish patients suspected with mosquito-borne arboviral infection in Yunnan. MethodsTotally 62 acute phase serum samples were collected from the feverish patients suspected with mosquito-borne arboviral infection in the third people′s hospital of Kunming city. The detection of three kinds of mosquito-borne virus, including Dengue virus (DENV), Japanese encephalitis virus (JEV) and Chikungunya virus (CHKV), were carried out using molecular biological methods and serological methods. ResultsThe results show that 27 serum samples are tested positive to mosquito-borne viral infection, accounting for 44% of all cases (27/62). Among these positive cases, 82% (22/27) of them are DENV infection, 18% (5/27) JEV infection, and no CHKV infection cases. All the DENV cases are shown DENV IgM antibody positive, which include 12 cases nucleotide test positive to DENV. DENV genotyping results indicate that three different genotypes are identified among these 12 nucleotide-positive cases, namely genotype 1 (5 cases), genotype 3 (5 cases) and genotype 4 (2 cases). In addition, there are also 5 JEV IgM antibody-positive cases and JEV nucleotide-positive cases are not identified. The epidemiological analysis reveals that cases of DENV and JEV are mainly distributed in June to October. And 19 cases among the DENV infection cases (n=22) are imported cases. ConclusionsDENV infection cases have a large proportion of suspected cases with mosquito-borne arboviral infection in Yunnan, and these DENV-positive cases are mainly imported cases. The strains of DENV identified in this study are primarily derived from Southeast Asian countries.

Patients with fever; Mosquito-borne viruses; Dengue fever

黃瑛，Email:hgxami6@sina.com;梁國棟，gdliang@hotmail.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.04.004

2016-04-07)