微波輔助提取紅菇多糖及抗氧化性研究

龐庭才，胡上英，陸媛媛，廖燕星

（欽州學(xué)院食品工程學(xué)院，廣西欽州535099）

微波輔助提取紅菇多糖及抗氧化性研究

龐庭才，胡上英，陸媛媛，廖燕星

（欽州學(xué)院食品工程學(xué)院，廣西欽州535099）

以紅菇多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用微波輔助提取法，通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)紅菇多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并研究紅菇多糖對(duì)羥基自由基、超氧陰離子自由基和對(duì)DPPH自由基的清除作用。結(jié)果表明，微波輔助提取紅菇多糖的最佳工藝條件為提取時(shí)間6 m in，微波功率240 W，料液比1：25（g：mL），pH 9.0，在此條件下，多糖得率為5.39%。紅菇多糖對(duì)羥基自由基、超氧陰離子自由基和對(duì)DPPH自由基均有明顯的清除作用，且清除率隨多糖質(zhì)量濃度增加而增大。

紅菇；微波；多糖；抗氧化

紅菇（Russula vinosa）又名美麗紅菇、大紅菇、真紅菇，屬于擔(dān)子菌綱，傘菌目、紅菇科、紅菇屬，是一種野生名貴稀有的藥食兼用菌［1］。紅菇的子實(shí)體各個(gè)部位特別是菌褶很脆，菌柄短而粗，菌蓋常有顏色［2-3］。已有研究發(fā)現(xiàn)，紅菇中含有豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素、氨基酸以及人體必需的各種微量元素［4-5］，其中紅菇多糖、麥角甾醇、酸類(lèi)和雜環(huán)衍生物等功能成分，具有降膽固醇、治療失血性貧血、提高機(jī)體免疫力、抗癌、抗炎、增強(qiáng)血管收縮等功效［6-8］。多糖提取工藝主要有酸堿提取法、超聲輔助提取、微波輔助提取、復(fù)合酶輔助提取以及多種方法的聯(lián)用。其中微波輔助提取法是利用微波能的加熱效應(yīng)來(lái)加速溶劑對(duì)固體樣品中目標(biāo)化合物的提取的新技術(shù)。史碧波［9］利用微波輔助提取通過(guò)正交試驗(yàn)法從雞油菌中提取多糖，多糖得率為13.55%。李志洲［10］利用微波輔助提取杏鮑菇中多糖，得率可達(dá)11.80%。目前，利用微波輔助提取多糖的技術(shù)比較成熟，但在用于提取紅菇多糖方面的研究還比較少，因此本研究以紅菇為原料，采用微波輔助提取法對(duì)紅菇多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用紅菇資源提供相應(yīng)的技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

紅菇：市售；葡萄糖、硫酸、乙醇、苯酚、三氯化鐵等（均為分析純）：上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市科析儀器有限公司；EL204型電子天平：梅特勒-托利多（上海）有限公司；ERZA5110A型鼓風(fēng)干燥箱：上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；UV-3200型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；H1850型臺(tái)式離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3方法

1.3.1工藝流程

紅菇烘干→粉碎→原料預(yù)處理→回流提取→過(guò)濾→澄清液→濃縮液→醇析→洗滌→真空干燥→粗多糖

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

分別吸取0、0.2 m L、0.4 m L、0.6 m L、0.8 m L、1.0 m L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 mg/L）置20 m L具塞玻璃試管中，用蒸餾水補(bǔ)至1.0 m L。加入1.0 m L 5%苯酚溶液后，快速加入5.0 m L 98%硫酸，靜置10 min后振蕩10 min，然后將試管放置于30℃水浴20 min，取出冷卻至室溫，以空白作對(duì)照，在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定其吸光度值，制定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3多糖提取單因素試驗(yàn)

按一定的料液比加入紅菇粉末和設(shè)定pH的水，在設(shè)定微波功率條件下浸提一定提取時(shí)間后，4 000 r/min離心10 min，過(guò)濾，濾液加入3倍體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇進(jìn)行沉淀，然后再過(guò)濾，將沉淀依次用無(wú)水乙醇、丙酮及乙醚多次清洗，沉淀為紅菇多糖。將紅菇多糖溶于蒸餾水中并定容至1 000 m L后，于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)吸光度值，計(jì)算紅菇多糖得率。

提取時(shí)間的確定：在微波功率320 W，料液比1∶20（g∶m L），pH 7.0的條件下，考察不同提取時(shí)間（5 m in、6 min、7 min、8 min、9 min）對(duì)紅菇多糖提取效果的影響。

微波功率的確定：在提取時(shí)間7 min，料液比1∶20（g∶m L），pH 7.0的條件下，考察不同微波功率（80W、160W、240 W、320 W、400 W）對(duì)紅菇多糖提取效果的影響。

料液比的確定：在微波功率320 W，提取時(shí)間6 m in，pH 7.0的條件下，考察不同料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶m L））對(duì)紅菇多糖提取效果的影響。

pH的確定：在微波功率320 W，提取時(shí)間6 min，料液比1∶20（g∶m L）的條件下，考察不同pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）對(duì)紅菇多糖提取效果的影響。

1.3.4多糖提取正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，考察提取時(shí)間、微波功率、料液比和pH對(duì)紅菇多糖得率的影響，以確定最佳提取工藝參數(shù)。正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1　紅菇多糖提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experim ents for Russula vinosa polysaccharides extraction conditions optim ization

1.3.5測(cè)定方法

（1）多糖得率的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法［11］測(cè)定單糖含量，再計(jì)算紅菇樣品中多糖得率，其計(jì)算公式如下：

式中：W為樣品中多糖得率，%；m1為用回歸方程計(jì)算出的樣品測(cè)定液的含糖量，μg；V1為樣品液的定容體積，m L；V2為測(cè)定時(shí)移取的樣品測(cè)定液的體積，m L；m2為樣品的質(zhì)量，g；0.9為校正系數(shù)，將葡萄糖含量換算成葡聚糖含量。

（2）羥自由基（·OH）清除率測(cè)定

分別加入FeSO4溶液、水楊酸-乙醇溶液，再分別加入不同濃度樣品溶液，最后加入H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，水浴離心取上清液，在波長(zhǎng)510nm處測(cè)定吸光度值，以蒸餾水代替H2O2作為對(duì)照組，以蒸餾水代替樣品作為空白，計(jì)算樣品對(duì)·OH的清除率［12］。其計(jì)算公式如下：

式中：Ai為樣品組吸光度值；Ai0為以蒸餾水代替H2O2的對(duì)照組吸光度值；A0為以蒸餾代替樣品的空白吸光度值。

（3）超氧陰離子自由基（O2-·）清除率的測(cè)定

取Tris-HCl緩沖溶液（pH 8.2），加入不同質(zhì)量濃度（1 mg/m L、2 mg/m L、3 mg/m L、4 mg/m L、5 mg/m L）的多糖溶液，混勻后保溫，然后加入鄰苯三酚反應(yīng)后，在25℃水浴中反應(yīng)4min，加入HCl終止反應(yīng)，在波長(zhǎng)325nm處測(cè)吸光度值，以蒸餾水作為對(duì)照，計(jì)算樣品對(duì)O2-·的清除率［13］。其計(jì)算公式如下：

式中：V1為加入樣品后鄰苯三酚自氧化速率（以斜率表示）；

V0為加入蒸餾水后鄰苯三酚自氧化速率（以斜率表示）。

（4）1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率的測(cè)定

取不同濃度的樣品溶液，加入DPPH溶液，避光反應(yīng)后，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度值，以樣品溶液加入無(wú)水乙醇作對(duì)比，以DPPH溶液加入蒸餾水中作為空白，計(jì)算樣品對(duì)DPPH自由基的清除率［14］。其計(jì)算公式如下：

式中：Ai為DPPH+樣品的吸光度值；Ai0為樣品+無(wú)水乙醇的吸光度值；A0為DPPH+蒸餾水的吸光度值。

2　結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

以葡萄糖質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.006 6x+0.008 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1，表明吸光度值在葡萄糖量為0～100 μg/m L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.2單因素試驗(yàn)

2.2.1提取時(shí)間對(duì)紅菇多糖得率的影響

圖2　提取時(shí)間對(duì)紅菇多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the extrac tion rate of polysaccha rides

由圖2可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，紅菇多糖得率也隨之升高，在提取時(shí)間為7 min時(shí)得率達(dá)到最大值，之后隨著提取時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，多糖得率反而呈下降趨勢(shì)?？赡苁且?yàn)榻?jīng)過(guò)一定時(shí)間的微波處理之后，樣品顆粒內(nèi)部的溫度和壓力逐漸提高，導(dǎo)致細(xì)胞壁破碎，加快了細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)流出速度。但微波時(shí)間也易使多糖分子水解，而致使多糖提取率下降［15］。因此，微波輔助最適時(shí)間為7 m in。

2.2.2微波功率對(duì)紅菇多糖得率的影響

圖3　微波功率對(duì)紅菇多糖得率的影響Fig.3 Effec t of m icrowave power on the extraction rate of polysaccharides

由圖3可知，隨著微波功率的增大，紅菇多糖得率呈先遞增后下降的趨勢(shì)，其中在微波功率240 W時(shí)，多糖得率達(dá)到最大值。這因?yàn)樵谖⒉üβ剩?40 W時(shí)，隨著溫度的逐漸升高，對(duì)紅菇細(xì)胞壁的破壞作用增大，有利于多糖物質(zhì)的溶出；當(dāng)微波功率＞240 W之后，由于微波的瞬間加熱作用使得紅菇細(xì)胞中的被處理成分發(fā)生了變性，從而阻礙了提取溶劑的滲入，導(dǎo)致多糖物質(zhì)的得率有效下降［16］。因此，微波最適功率為240 W。

2.2.3料液比對(duì)紅菇多糖得率的影響

圖4　料液比對(duì)紅菇多糖得率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of polysaccharides

由圖4可知，料液比為1∶10～1∶25（g∶m L）時(shí)，紅菇多糖得率的上升趨勢(shì)明顯，當(dāng)料液比＞1∶25（g∶m L）之后，多糖得率趨于下降?？赡艿脑蚴沁m當(dāng)?shù)娜軇┯昧浚梢栽黾訕悠放c提取溶劑接觸面積和質(zhì)量濃度差，有利于提取物質(zhì)的擴(kuò)散。而隨著料液比繼續(xù)增大，過(guò)多的提取溶劑也可能將其他物質(zhì)溶出，導(dǎo)致多糖得率的下降，同時(shí)也會(huì)增加后續(xù)處理的難度和生產(chǎn)成本［17］。因此，最適料液比為1∶25（g∶m L）。

2.2.4pH對(duì)紅菇多糖得率的影響

圖5　pH對(duì)紅菇多糖得率的影響Fig.5 Effect of pH on the extraction rate of polysaccharides

由圖5可知，隨著pH的升高，紅菇多糖得率也隨之增加，當(dāng)pH為8.0時(shí)，多糖得率達(dá)到最大值，之后隨著pH的繼續(xù)增大反而出現(xiàn)減小的趨勢(shì)?？赡艿脑蚴窃谶^(guò)酸或過(guò)堿性條件下引起多糖糖苷鍵的斷裂，而使多糖發(fā)生降解，從而導(dǎo)致多糖得率較低。因此，pH最優(yōu)選擇為8.0。

2.3正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，考察提取時(shí)間、微波功率、料液比和pH對(duì)紅菇多糖得率的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，影響紅菇多糖得率的各因素順序?yàn)槲⒉üβ剩咎崛r(shí)間＞pH＞料液比。由每個(gè)因素中K值的大小確定最優(yōu)方案為A1B2C2D3，即提取時(shí)間6min、微波功率240W、料液比1∶25（g∶m L）、pH 9.0。在此條件下進(jìn)行最優(yōu)方案的驗(yàn)證試驗(yàn)，紅菇多糖得率為5.39%。

表2　紅菇多糖提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test fo r Russula vinosa polysaccharides extraction conditions optim ization

2.4多糖抗氧化性研究結(jié)果

2.4.1超氧陰離子自由基（O2-·）的清除

圖6　紅菇多糖對(duì)超氧陰離子自由基清除作用Fig.6 Scaveng ing effects of Russula vinosa polysaccharides on superoxide anion radical

由圖6可知，紅菇多糖對(duì)鄰苯三酚自氧化具有較強(qiáng)的抑制作用，超氧陰離子自由基清除率隨多糖質(zhì)量濃度的增加而升高，但當(dāng)質(zhì)量濃度增大到一定值時(shí)，清除率的變化幅度會(huì)變小。紅菇多糖在此體系表現(xiàn)出很好的清除超氧陰離子自由基的作用，當(dāng)其質(zhì)量濃度為5 mg/m L時(shí)，對(duì)超氧陰離子自由基的清除率達(dá)82.3%。

2.4.2羥自由基（·OH）清除能力的測(cè)定

由圖7可知，紅菇多糖對(duì)羥自由基有較強(qiáng)的清除作用，清除率隨著多糖質(zhì)量濃度的提高而增大。當(dāng)紅菇多糖溶液質(zhì)量濃度達(dá)到1 mg/m L時(shí)其清除率僅為5.7%，而當(dāng)其質(zhì)量濃度為5 mg/m L時(shí)，其清除率達(dá)49.3%，表明了紅菇多糖表現(xiàn)出一定的清除羥自由基的效果。

圖7　紅菇多糖對(duì)羥自由基清除作用Fig.7 Scavenging effects of Russu la vinosa polysaccharides on hydroxyl radical

2.4.3DPPH清除能力的測(cè)定

圖8　紅菇多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.8 Scavenging effects of Russula vinosa polysaccharides on DPPH radical

由圖8可知，紅菇多糖溶液具有一定的清除DPPH自由基的能力，清除率隨質(zhì)量濃度的增大而增大，當(dāng)紅菇多糖質(zhì)量濃度為1 mg/m L時(shí)，清除率就達(dá)41.1%，而當(dāng)紅菇多糖質(zhì)量濃度達(dá)到5 mg/m L時(shí)，清除率就達(dá)80.4%，說(shuō)明紅菇多糖能有效的清除DPPH自由基。

3　結(jié)論

紅菇多糖的提取工藝優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果表明，影響紅菇多糖得率的各因素主次順序?yàn)槲⒉üβ剩咎崛r(shí)間＞pH＞料液比，最佳提取工藝條件為提取時(shí)間6 min，微波功率240 W，料液比1∶25（g∶m L），pH 9.0，在此條件下紅菇多糖得率達(dá)5.39%。

抗氧化性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紅菇多糖對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基具有良好的清除能力，最高清除率分別為49.17%、80.35%、82.17%。

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M icrowave-assisted extraction of Russula vinosa polysaccharides and its antioxidant ativity

PANG Tingcai，HU Shangying，LU Yuanyuan，LIAO Yanxing
（College of Food Eningeering，Qinzhou University，Qinzhou 535099，China）

Using Russula vinosa polysaccharides yield as evaluation index，m icrowave-assisted extraction was used to optim ize the extraction process of polysaccharides from R.vinosa by orthogonal experiments.Meanwhile，the scavenging effect of R.vinosa polysaccharides on hydroxyl radical，superoxide radical and DPPH radical were tested.The results showed that the optimal extracting conditions were as follows：extraction time 6 m in，m icrowave power 240 W，solid-liquid ratio 1∶25（g∶m l），pH 9.0.Under such conditions，polysaccharides yield was up to 5.39%.Scavenging effect of R.vinosa polysaccharides on hydroxyl radical，superoxide radical and DPPH radical was obvious，and the scavenging rate increased with the increasing polysaccharides concentration.

Russula vinosa；m icrowave；polysaccharides；antioxidant

O 658

0254-5071（2016）05-0157-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．033

2016-01-10

廣西高校科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（2013YB260）；欽州學(xué)院校級(jí)科研項(xiàng)目（2014XJKY-58C）；欽州學(xué)院校級(jí)科研項(xiàng)目（2013XJKY-09B）

龐庭才（1985-），男，實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事天然產(chǎn)物研究工作。