鹽誘導乙醇水體系萃取分離葡萄皮中原花青素

張喜峰，何　倩，張　斌，王明卉，羅光宏*

（1.河西學院農(nóng)業(yè)與生物技術學院；甘肅張掖734000；2.甘肅省河西走廊特色資源利用重點實驗室，甘肅張掖734000；3.河西學院凱源生物技術開發(fā)中心，甘肅省微藻工程技術研究中心，甘肅張掖734000）

鹽誘導乙醇水體系萃取分離葡萄皮中原花青素

張喜峰1，2，何倩1，張斌1，王明卉1，羅光宏3*

（1.河西學院農(nóng)業(yè)與生物技術學院；甘肅張掖734000；2.甘肅省河西走廊特色資源利用重點實驗室，甘肅張掖734000；3.河西學院凱源生物技術開發(fā)中心，甘肅省微藻工程技術研究中心，甘肅張掖734000）

采用鹽誘導乙醇水體系萃取分離葡萄皮中原花青素，利用單因素試驗和正交試驗研究了鹽的種類和加入量、乙醇體積分數(shù)、樣品加入量、溫度對原花青素萃取效果的影響。并且以1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除能力、還原Fe3+能力、羥自由基清除能力分析葡萄皮中原花青素的抗氧化活性。結果表明，乙醇體積分數(shù)為50%，料液比為1∶15（g∶m L）制備原花青素粗提液；然后向15 m L粗提液中加入3.6 g Na2HPO4，在30℃條件下充分混勻分相后，葡萄皮中原花青素萃取率和分配系數(shù)分別為85.51%和2.48。抗氧化實驗結果表明，葡萄皮中原花青素有一定抗氧化活性，萃取后原花青素比粗提液中原花青素的抗氧化能力強。

葡萄皮；乙醇水提取液；鹽誘導；原花青素；抗氧化

河西走廊地處北緯36～40°，具有生產(chǎn)葡萄尤其是釀造葡萄的最佳光、熱、水、土資源組合狀態(tài)，屬我國釀造葡萄發(fā)展的最佳產(chǎn)區(qū)，是綠色食品理想的種植地區(qū)。在葡萄酒釀造過程中，會產(chǎn)生大量葡萄皮渣廢棄物，其被作為飼料和肥料，附加值較低。葡萄皮渣中可提取多種有效成分，如蛋白質(zhì)、多酚類化合物等［1］，這些成分具有良好的生物學功能。原花青素是葡萄皮中多酚類化合物之一，具有抑制癌細胞［2］、護肝［3］、抗氧化［4-5］、提高免疫力［6］等作用，其營養(yǎng)價值和醫(yī)療作用已得到國內(nèi)外研究人員充分肯定［7-8］。因此，對葡萄皮中原花青素分離方法進行分析，可延長葡萄酒產(chǎn)業(yè)鏈，對提高葡萄皮附加值具有重要意義。

誘導雙水相技術利用目標產(chǎn)物在兩相中分配系數(shù)的差異而進行分離的一項技術，具有傳質(zhì)速度快、能耗低、分相時間短等優(yōu)點。盛碧等［9］研究了梔子苷在乙腈水體系中誘導相分離分配行為，獲得了較好的萃取效果，并對無機鹽誘導乙腈/水分相機制進行了分析。但是，乙腈水體系對萃取極性較大化合物相對較難，限制了該技術在活性物質(zhì)萃取中應用。因此，采用乙醇水誘導相分離體系純化天然產(chǎn)物中活性成分，可為分離科學應用提供新的思路。

本實驗采用無機鹽誘導乙醇水體系萃取分離葡萄皮中原花青素，分別研究了無機鹽種類及其加入量、乙醇體積分數(shù)、樣品加入量、萃取溫度對原花青素萃取效果的影響，并采用單因素及正交試驗優(yōu)化鹽誘導萃取葡萄皮原花青素條件，并對其抗氧化性進行了比較研究，以期為葡萄皮中原花青素廣泛應用于醫(yī)藥和開發(fā)新型保健品提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

葡萄皮由甘肅濱河食品工業(yè)集團葡萄酒下腳料，經(jīng)挑選、清洗、曬干、粉碎。

兒茶素標準品（純度≥99%）：上海國藥集團化學試劑有限公司；硫酸銨、磷酸氫二鈉、氯化鈉、硫酸鈉、乙醇；香草醛、濃鹽酸、甲醇、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2儀器與設備

DL-820E超聲智能系統(tǒng)：上海之信儀器有限公司；722型分光光度計：上海光譜儀器有限公司；PL-203型電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1原花青素乙醇超聲提取法

準確稱取1 g葡萄皮粉末，按照料液比1∶15（g∶m L）加入體積分數(shù)為50%乙醇，在超聲功率100W、超聲時間20m in條件下進行提取，提取后進行過濾，用體積分數(shù)為50%乙醇將濾液補足至15 m L，得葡萄皮原花青素粗提液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2誘導乙醇水體系萃取過程

各取15 m L粗取液分別加入不同種類2.2 g無機鹽，充分混勻至無機鹽溶解，靜置10 min分層，讀取上相、下相體積，測定上、下相原花青素質(zhì)量濃度。其相比R、分配系數(shù)K及萃取率Y的計算公式如下：

式中：R為相比；Vt、Vb分別為上、下相體積，m L。

式中：K為分配系數(shù)；Ct、Cb分別為上、下相原花青素質(zhì)量濃度，

式中：Y為萃取率，%；R為相比；K為分配系數(shù)。

1.3.3原花青素質(zhì)量濃度的測定

原花青素質(zhì)量濃度的測定采用香草醛-濃鹽酸法［10］。

兒茶素標準曲線的制備：準確稱取10 mg兒茶素標準品，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為1mg/m L的標準溶液。分別取1.00 m L、2.00 m L、3.00 m L、4.00 m L、5.00 m L用甲醇定容至10 m L。從中各取0.5 m L分別加入3 m L 40 g/L的香草醛-甲醇溶液，1.5 m L濃鹽酸，混勻，在室溫下避光反應15 min，以不加兒茶素標準品溶液為空白對照于波長500 nm處測定吸光度，繪制標準曲線。得到吸光度值（Y）與原花青素質(zhì)量濃度（X）的標準曲線回歸方程：Y=0.396 8X-0.016，相關系數(shù)R2=0.991 0。

1.3.4葡萄皮中原花青素清除DPPH自由基能力

參照高行恩等［11］方法，略作改動。分別取粗提液、萃取液和蒸餾水溶解后VC，再稀釋至5組不同質(zhì)量濃度的溶液，分別取2 m L稀釋液，加入2 m L上述濃度為0.2 mmol/m L的DPPH溶液，以2 m L無水乙醇和2 m L蒸餾水為空白，避光反應30 m in，于波長517 nm處測定吸光度值，根據(jù)以下公式計算DPPH自由基清除率。

式中：Ao為2 mL無水乙醇和2 mL蒸餾水的吸光度值；Ai為2 mL樣液和2 m LDPPH溶液的吸光度值；A j為2 m L樣液和2 mL無水乙醇溶液的吸光度值。

1.3.5葡萄皮中原花青素還原Fe3+能力的測定［12-14］

取10 m L試管，分別加入不同質(zhì)量濃度的粗提液、萃取液和維生素C（Vitam in C）VC各2.0 m L、與2 m L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）緩沖液和質(zhì)量分數(shù)為1%的鐵氰化鉀2 m L充分混勻后在50℃水浴20 min，分別加入質(zhì)量分數(shù)為10%三氯乙酸2.0 m L，混勻后2 000 r/min離心10 min，取上清液2.0 m L，加入2.0 m L蒸餾水和1%的三氯化鐵1.0 m L，以相應試劑為參比，在波長700 nm處測定吸光度值，以此反映原花青素的還原能力，吸光度值越大，還原能力越強。

1.3.6葡萄皮中原花青素清除羥自由基能力

參照陳虎等［15］方法，略作改動。取10 m L試管，分別加入不同質(zhì)量濃度的粗提液、萃取液和VC各1.0 m L，加入2 mmol/L H2O22m L、2 mmol/L FeSO42 m L、9 mol/L水楊酸乙醇溶液2 m L，以蒸餾水為參比，于波長510 nm處測定吸光度值，按照以下公式計算羥自由基清除率：

式中：Ao為空白對照溶液吸光度值；Ai為樣品液吸光度值；A j為不加H2O2樣品液的本底吸光度值。

1.3.7數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2003和DPS 6.55軟件對單因素和正交試驗數(shù)據(jù)進行處理，每個試驗均重復3次，取平均值。

2　結果與分析

2.1鹽誘導乙醇水體系萃取分離葡萄皮中原花青素單因素試驗

2.1.1無機鹽的選擇

取體積分數(shù)為50%乙醇原花青素粗取液各15 m L，分別加入NaCl、Na2SO4、（NH4）2SO4、Na2HPO4各2.2 g，充分混勻至無機鹽溶解，計算原花青素萃取效果，結果見表l。

表1　無機鹽種類對原花青素萃取效果的影響Table 1 Effect of inorganic salts types on the extraction efficiency of proanthocyanidins

由表1可知，NaCl、Na2SO4、（NH4）2SO4、Na2HPO4四種鹽對乙醇水分相萃取原花青素效果不同，主要是因為乙醇水之間主要存在氫鍵作用，加入無機鹽后，本質(zhì)上是乙醇與無機鹽離子爭奪水分子過程。從萃取效果看，Na2HPO4對乙醇水誘導分相萃取原花青素效果最好，因此選擇無機鹽種類為Na2HPO4。

2.1.2Na2HPO4加入量對原花青素萃取效果的影響

取體積分數(shù)50%乙醇原花青素粗提取液各15 m L，分別加入0.8 g、2.2 g、3.6 g、5.0 g、6.4 g Na2HPO4，充分混勻至鹽溶解，待上下分層后，測定上下相中原花青素質(zhì)量濃度，計算原花青素萃取效果，結果見圖l。

圖1　Na2HPO4加入量對原花青素萃取效果的影響Fig.1 Effect of Na2HPO4addition on the extraction efficiency of proanthocyanidins

由圖1可知，當Na2HPO4加入量為0.8 g時，與體積分數(shù)為50%乙醇原花青素粗取液無法分相，因為鹽與乙醇分相過程屬于鹽與乙醇爭奪水分子過程，鹽量較少，對乙醇水之間氫鍵破壞較小，整個體系混亂度變化不大，導致無法分相。當Na2HPO4加入量逐漸增加時，原花青素萃取率和分配系數(shù)先增大后減小，Na2HPO4加入量為3.6 g時，分配系數(shù)和萃取率均達到最大值。原因可能是大量鹽的加入嚴重破壞了乙醇水之間的氫鍵結構，整個體系混亂度增大，從而促使分層現(xiàn)象；當Na2HPO4加入量為5.0 g時，下層中出現(xiàn)鹽析現(xiàn)象。因此，該體系選擇Na2HPO4加入量為3.6 g。

2.1.3乙醇體積分數(shù)對原花青素萃取效果的影響

圖2　乙醇體積分數(shù)對原花青素萃取效果的影響Fig.2 Effect of the ethanol content of on the extraction efficiency of proanthocyanidins

取不同乙醇體積分數(shù)的原花青素粗取液各15 m L，分別加入3.6 g Na2HPO4，充分混勻至鹽溶解，待上下分層后，測定上下相中原花青素質(zhì)量濃度，計算原花青素萃取效果，結果見圖2。

由圖2可知，隨著乙醇體積分數(shù)逐漸增加，葡萄皮原花青素萃取率和分配系數(shù)先增大后減小，當乙醇體積分數(shù)為50%時，萃取率可達83.56%，主要原因是乙醇體積分數(shù)增加時，上相極性變小，原花青素由上相轉移至下相，導致萃取率逐漸下降，因此，選擇乙醇體積分數(shù)為50%。

2.1.4樣品加入量對原花青素萃取效果的影響

分別稱取0.50 g、0.75 g、1.00 g、1.25 g、1.50 g葡萄皮粉末，加入15 m L體積分數(shù)為50%乙醇，按照1.3.1方法制備原花青素粗提液，向粗提液中分別加入3.6 g Na2HPO4，充分混勻至鹽溶解，待上下分層后，測定上下相中原花青素質(zhì)量濃度，計算原花青素萃取效果，結果見圖3。

圖3　樣品加入量對原花青素萃取效果的影響Fig.3 Effect of samp les addition on the extraction efficiency of proanthocyanidins

由圖3可知，隨著樣品加入量逐漸增加，原花青素分配系數(shù)和萃取率逐漸增加，當樣品加入量為1.25 g時，原花青素萃取效果最佳；這主要與原花青素在上相中趨于飽和有關，因此，選擇樣品加入量為1.25 g。

2.1.5萃取溫度對原花青素萃取效果的影響

圖4　萃取溫度對原花青素萃取效果的影響Fig.4 Effect of extraction tem perature on the extraction efficiency of proanthocyanidins

稱取1.25 g葡萄皮粉末，加入15 m L體積分數(shù)為50%乙醇，按照1.3.1方法制備原花青素粗提液，分別加入3.6 g Na2HPO4，在不同溫度下水浴10 m in后，測定上下相中原花青素質(zhì)量濃度，計算原花青素萃取效果，結果見圖4。

由圖4可知，原花青素萃取率和分配系數(shù)隨著溫度逐漸升高先增大，當萃取溫度為30℃時，萃取率和分配系數(shù)達到最大值。隨著溫度逐漸升高，原花青素萃取率和分配系數(shù)趨于下降。原因可能是，溫度過高，會破壞原花青素酚型結構，加速其分解。因此，確定萃取溫度為30℃。

2.2正交試驗設計

在單因素試驗基礎上，選擇Na2HPO4質(zhì)量、乙醇體積分數(shù)、樣品加入量和萃取溫度4個因素，按照正交試驗4因素3水平設計，對原花青素萃取率和分配系數(shù)兩個指標進行加權處理，以綜合評分方式分析原花青素萃取效果，原花青素萃取率和分配系數(shù)評分比例分別為60%和40%。結果與分析如表2所示，方差分析結果見表3。

表2　萃取條件優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 2 Resu lts and analysis of orthogonal experiments for extraction conditions optim ization

表3　正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，各因素對原花青素萃取率和分配系數(shù)結果影響由大到小順序為：乙醇體積分數(shù)＞Na2HPO4質(zhì)量＞樣品加入量＞萃取溫度，最佳萃取條件組合為A1B2C1D3，即稱取1 g葡萄皮粉末，加入15 m L體積分數(shù)為50%乙醇，按照1.3.1方法制備原花青素粗提液，向15 m L粗提液中加入3.6 g Na2HPO4，充分混勻至鹽溶解，在30℃水浴10min，待上下分層后，測得原花青素萃取率和分配系數(shù)分別為85.51%和2.48。

由表3可知，乙醇體積分數(shù)對原花青素萃取率和分配系數(shù)影響顯著（P＜0.05），樣品加入量、Na2HPO4質(zhì)量和萃取溫度對結果影響均不顯著（P＞0.05）。

2.3抗氧化性測定結果與分析

取1 g葡萄皮粉末，加入15 m L體積分數(shù)為50%乙醇，按照1.3.1方法條進行提取后進行過濾，得葡萄皮原花青素粗提液；向15 m L粗提液中加入3.6 g Na2HPO4，充分混勻至鹽溶解，在30℃水浴10 min，待上下分層后，上相為原花青素萃取液。

2.3.1原花青素清除DPPH自由基能力

由圖5可知，隨著質(zhì)量濃度逐漸增加，原花青素粗提液和萃取液及VC對DPPH自由基清除率也逐漸升高，對DPPH自由基清除能力大小為原花青素萃取液、原花青素粗提液、VC。原花青素萃取液、原花青素粗提液、VC對DPPH自由基的半抑制濃度（50%inhibitory concentration，IC50）分別為0.449mg/m L、0.485mg/m L、0.569mg/m L。結果表明，采用鹽誘導后原花青素萃取液比粗提液具有較好的DPPH自由基清除能力，可能是由于萃取后已除去部分雜質(zhì)，在相同的反應條件下，使得萃取后原花青素利于與DPPH溶液接觸。并且二者DPPH自由基清除率均＞VC。

圖5　葡萄皮中原花青對DPPH自由基的清除能力Fig.5 Scavenging ac tivity of proan thocyanidins from grape skins on DPPH free radical

2.3.2原花青素還原Fe3+能力

采用在波長700 nm條件下測定的吸光度值反映VC和葡萄皮中原花青素還原Fe3+能力。由圖6可知，原花青素粗提液和萃取液及VC隨質(zhì)量濃度增加，還原Fe3+能力越強；對還原Fe3+能力大小為原花青素萃取液＞原花青素粗提液＞VC。結果表明，原花青素萃取液具有較好的還原力。

圖6　葡萄皮中原花青素還原力Fig.6 Reducing power of proanthocyanidins from grape skins

2.3.3原花青素清除羥自由基能力

由圖7可知，原花青素萃取液、原花青素粗提液和VC對羥自由基具有較好清除能力，原花青素萃取液、原花青素粗提液、VC對羥自由基的半抑制濃度（IC50）分別為0.458 mg/m L、0.585 mg/m L、0.759 m g/m L。對清除羥自由基能力大小為原花青素萃取液＞原花青素粗提液＞VC。結果表明，采用鹽誘導相分離后原花青素萃取液比粗提液具有較好的清除自由基的能力。

圖7　葡萄皮中原花青素清除羥自由基能力Fig.7 Scavenging activity o f proanthocyanidins from grape skins on hydroxyl free radical

3　結論

采用鹽誘導乙醇水體系萃取分離葡萄皮中原花青素，通過實驗首先確定鹽的種類為Na2HPO4，利用單因素和正交設計試驗對鹽誘導乙醇水體系萃取分離葡萄皮中原花青素條件進行優(yōu)化，得到最佳萃取條件為：1 g葡萄皮粉末，加入15 m L體積分數(shù)為50%乙醇，制備原花青素粗提液，其中加入3.6 g Na2HPO4，充分混勻至鹽溶解，30℃水浴10 min，待上下分層后，測得原花青素萃取率和分配系數(shù)分別為85.51%和2.48。

通過還原力、DPPH及羥自由基清除能力實驗，表明萃取后原花青素還原力、DPPH及羥自由基清除能力強于粗提液中原花青素，可能是萃取后已除去粗提液中部分雜質(zhì)，從而提高了原花青素抗氧化能力，有關除去的雜質(zhì)是如何影響抗氧化活力，有待于進一步研究。因此，說明該技術可為萃取純化天然產(chǎn)物中活性成分提供新的思考依據(jù)。

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Extractionandseparationofproanthocyanidinsfrom grapeskinsbysaltinducedethanol-watersolutionsystem

ZHANG Xifeng1，2，HE Qian1，ZHANG Bin1，WANG Minghui1，LUO Guanghong3*
（1.College of Agriculture and Biotechnology，Hexi University，Zhangye 734000，China；2.Key Laboratory of Hexi Corridor Resources Utilization of Gansu，Zhangye 734000，China；3.Kaiyuan Bio-Tech Development Center，Hexi University，Zhangye 734000，China）

The proanthocyanidins from grape skins were extracted by salts induce ethanol aqueous solution system.Using the single factor and orthogonal experiments，the effects of the type and addition of salt，ethanol content，samples addition and temperature on extraction efficiency of proanthocyanidins were researched.With the scavenging activity of DPPH free radical，reducing power on Fe3+and the scavenging activity of hydroxyl free radical as evaluation indexes，the antioxidant activity of proanthocyanidins from grape skins was analyzed.The results show that crude extracts of proanthocyanidins were prepared in the conditions of ethanol content 50%and solid-liquid ratio 1∶15（g∶m l）.Na2HPO43.6 g was added into 15 m l crude extracts，and incorporated thoroughly at 30℃.The extraction rate and partition coefficient of proanthocyanidins from grape skins were 85.51% and 2.48，respectively.The results of antioxidant experiments indicated that the proanthocyanidins from grape skins had a certain antioxidant activity，and the antioxidant ability of the procyanidins obtained by salt induced ethanol-water solution system was higher than that in crude extracts by single ethanol extraction.

grape skins；ethanol aqueous solution；salts induce；proanthocyanidins；antioxidant activity

R284．2

0254-5071（2016）05-0139-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．029

2016-03-01

甘肅省中小企業(yè)創(chuàng)新基金項目（1047GCCG001）；國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201510740005）

張喜峰（1982-），男，講師，碩士，主要從事植物組織中活性成分提取與分析研究工作。

羅光宏（1965-），男，教授，碩士，主要從事食品化學方面的研究工作。