微小染色體維持蛋白2在鼻咽癌中的免疫組織化學(xué)表達(dá)及臨床意義

潘素明杜日昌彭淑平*李桂源*

（1中南大學(xué)腫瘤研究所，長沙 410078；2廣東粵北人民醫(yī)院病理科，韶關(guān) 512025）

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技術(shù)方法

微小染色體維持蛋白2在鼻咽癌中的免疫組織化學(xué)表達(dá)及臨床意義

潘素明1杜日昌2彭淑平1*李桂源1*

（1中南大學(xué)腫瘤研究所，長沙 410078；2廣東粵北人民醫(yī)院病理科，韶關(guān) 512025）

目的 研究微小染色體維持蛋白2（MCM2）在鼻咽癌中表達(dá)以及同鼻咽癌臨床分期、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理類型、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等的關(guān)系。方法 對62例鼻咽癌標(biāo)本應(yīng)用免疫組化法研究、分析MCM2基因的表達(dá)情況。結(jié)果 ①有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組的MCM2表達(dá)水平明顯高于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組；②MCM2的表達(dá)水平與臨床分期呈正相關(guān)；③MCM2表達(dá)在未分化癌組中高于角化性鱗癌組；④MCM2的表達(dá)在有無頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、年齡、性別組間無明顯差異。結(jié)論 MCM2表達(dá)的程度與鼻咽癌的臨床分期相關(guān)；MCM2的高表達(dá)可能是鼻咽癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的因素之一；MCM2表達(dá)的水平可能是鼻咽癌預(yù)后評估的重要參考指標(biāo)。

微小染色體維持蛋白2；鼻咽癌；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移

鼻咽癌起病隱匿，容易發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［1］，隨著綜合治療技術(shù)的進(jìn)步、設(shè)備的更新和臨床診療的水平提高，鼻咽癌的臨床療效大大提高，強調(diào)放療的應(yīng)用，讓鼻咽癌3年局部控制率提高至90%以上，但遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍然是鼻咽癌治療失敗的主要原因［2-5］。所以，提前預(yù)判鼻咽癌患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，并有針對地按患者個體情況來選擇合適的治療方案，這對提高患者的臨床療效有著重要意義。腫瘤的轉(zhuǎn)移是由多因素、多步驟和多基因共同作用而成的一個復(fù)雜過程，有很多方面的原因。腫瘤最基本的生物學(xué)特征為失控性生長，即過度增殖。近年來，微小染色體維持蛋白家族因其在DNA復(fù)制的起始、延伸和細(xì)胞的異常增殖及腫瘤的發(fā)生過程相關(guān)連，所以目前已被認(rèn)為是反映細(xì)胞增殖的一項重要指標(biāo)。微小染色體維持蛋白2（mini chromosome maintenance protein 2，MCM2）是該家族中的一員，在人類多種腫瘤組織中表達(dá)，應(yīng)用MCM2檢測可反應(yīng)MCM蛋白的水平［6，7］。本研究旨在通過研究MCM2在鼻咽癌組織中的表達(dá)，分析MCM2與腫瘤臨床特征之間的關(guān)系，探究MCM2在鼻咽癌中的臨床價值。

材料和方法

1 研究對象

回顧性收集2012年1月至2014年12月在廣東省粵北人民醫(yī)院確診的431例鼻咽癌患者的資料。符合以下標(biāo)準(zhǔn)的患者入組：①首程治療經(jīng)鼻咽部活檢病理學(xué)明確診斷為鼻咽癌，并經(jīng)胸片、腹部B超、骨ECT、PET-CT等輔助檢查排除骨、肺、肝等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；②首程治療按計劃完成根治性放療；③在根治性放療后發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時，根據(jù)鼻咽纖維鏡檢查、鼻咽+頸部MRI掃描排除鼻咽及頸部淋巴結(jié)復(fù)發(fā)。共31例符合入組標(biāo)準(zhǔn)的患者納入本研究，卡氏評分均≥80。其中男19例，女12例；年齡17～78歲，中位年齡45歲。另隨機選出31例未遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病例作對照。按中國鼻咽癌2008臨床分期：I期1例，II期16例，III期30例，IV期15例；病理分型：非角化癌58例，角化型鱗癌4例。

2 免疫組織化學(xué)染色

選取患者鼻咽活檢后存檔的石蠟標(biāo)本進(jìn)行切片，采用EnVision二步法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色檢測組織中MCM2的表達(dá)情況?？筂CM2單克隆抗體購自美國abcam公司，工作濃度1：100，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封固，用PBS替代一抗作為陰性對照。

3 結(jié)果判定與統(tǒng)計學(xué)方法

低倍鏡下選擇5個陽性細(xì)胞最密集、背景最清晰區(qū)域，每個區(qū)域在高倍鏡下計數(shù)100個細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)，取5個區(qū)域陽性細(xì)胞數(shù)的平均值作為結(jié)果計數(shù)，并進(jìn)行半定量分級：陽性細(xì)胞0%～5%為（-），陽性細(xì)胞6%～25%為（+），陽性細(xì)胞 26%～50%為（++），陽性細(xì)胞51%～75%為（+++），陽性細(xì)胞76%～100%為（++++）。根據(jù)文獻(xiàn)［8］報道進(jìn)一步將其分為高表達(dá)組，即陽性細(xì)胞＞25%（++～++ ++），低表達(dá)組，即陽性細(xì)胞≤25%（-～+）。

采用SPSS17.0軟件對有轉(zhuǎn)移和無轉(zhuǎn)移鼻咽癌中MCM2免疫組織化學(xué)表達(dá)水平進(jìn)行Mann-Whitney檢驗，對MCM2的表達(dá)與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系進(jìn)行χ2檢驗。

結(jié) 果

1 MCM2在有轉(zhuǎn)移的鼻咽癌中高表達(dá)

免疫組織化學(xué)檢測顯示，在有轉(zhuǎn)移組中，MCM2免疫反應(yīng)陰性（圖1A）及低水平（+）（圖1B）表達(dá)病例少于無轉(zhuǎn)移組，而高水平（++～++++）表達(dá)（圖1C、圖1D、圖1E）病例明顯多于無轉(zhuǎn)移組（表1）。31例有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組患者中26例MCM2呈陽性表達(dá)，陽性率83.9%，無轉(zhuǎn)移組中MCM2表達(dá)陽性率71.0%，Mann-Whitney檢驗顯示，有轉(zhuǎn)移組MCM2表達(dá)（秩均值為36.18）高于無轉(zhuǎn)移對照組（秩均值為26.82）（表1）。

表1　有轉(zhuǎn)移與無轉(zhuǎn)移鼻咽癌中MCM2表達(dá)比較Table 1 Comparsion of MCM2 expression in nasopharyngeal carcinoma with or without metas

2 鼻咽癌中MCM2表達(dá)與臨床參數(shù)的關(guān)系

MCM2表達(dá)在不同年齡、性別及在有、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在III+IV期中MCM2表達(dá)高于I+II期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=7.351，P=0.007）。在未分化癌中MCM2表達(dá)高于角化性鱗癌，差異也存在統(tǒng)計學(xué)意義（χ2= 3.955，P=0.047）（表2）。

表2　鼻咽癌中MCM2免疫組織化學(xué)表達(dá)與各臨床參數(shù)的關(guān)系Table 2 The relationships of MCM2 immunohistochemical expression and clinical parameters in nasopharyngeal

圖1　有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移鼻咽癌MCM2表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色。A，MCM2免疫反應(yīng)陰性；B，MCM2低表達(dá)（+）；C，MCM2高表達(dá)（++）；D，MCM2高表達(dá)（+++）；E，MCM2高表達(dá)（++++）；比例尺：A1、B1、C1、D1和E1，1500μm；A2、B2、C2、D2和E2，400μm。Fig.1 Immunohistochemical staining of MCM2 expression in patients with distant metastasis of nasopharyngeal carcinoma.A，MCM2 immunoreactivity was negative；B，MCM2 expression（+）；C，MCM2 expression（++）；D，MCM2 expression（+++）；E，MCM2 expression（++++）；scale bar：A1，B1，C1，D1 and E1，1500μm；A2，B2，C2，D2 and E2，400μm

討 論

細(xì)胞異常增殖是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的核心環(huán)節(jié)，而細(xì)胞增殖決定細(xì)胞周期，細(xì)胞周期受DNA復(fù)制的調(diào)控，因此檢測DNA復(fù)制起始的相關(guān)蛋白可預(yù)測腫瘤發(fā)生。臨床中發(fā)現(xiàn)許多與細(xì)胞增殖有關(guān)的生物標(biāo)志物可以指導(dǎo)患者的預(yù)后［9-11］。Ki-67是目前臨床最常用的細(xì)胞增殖標(biāo)志物，其高表達(dá)是多種惡性腫瘤的預(yù)后不良因素［10，12］。但Ki-67能否成為鼻咽癌的特異性預(yù)后指標(biāo)，目前仍存爭議。Ki-67參與核糖體的生物合成，并不直接參與細(xì)胞增殖［13］，因此我們認(rèn)為，直接參與DNA復(fù)制和細(xì)胞周期調(diào)控的分子，可能較Ki-67更特異性地指導(dǎo)預(yù)后。細(xì)胞周期的調(diào)控機制復(fù)雜，有多種基因和蛋白參與，其中微小染色體維持蛋白（MCMs）是重要的DNA復(fù)制啟動因子。MCM2是其家族的一員，MCM2在細(xì)胞處于靜止期及分化成熟期含量較少，在轉(zhuǎn)化、增殖的細(xì)胞中，MCM2含量不斷改變，從G0期開始增加，到G1末期和S早期達(dá)到高峰，并與染色質(zhì)結(jié)合，在S期至M期成為游離的MCM2，G2期與M期降低。這種與細(xì)胞增殖過程一致的周期性變化，目前已將它作為S細(xì)胞的標(biāo)記物［14］，并被看成是特異性增殖相關(guān)因子癌前標(biāo)記［15］。

大量文獻(xiàn)報道，MCM2在各種腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)高表達(dá)［16-18］。MCM2在食管鱗癌中的表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移、組織分級、病理分期等有關(guān)［19］；MCM2在胃癌陽性表達(dá)與患者的T分期和區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)［20］。本研究發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組患者中MCM2呈陽性表達(dá)陽性率83.9%，無轉(zhuǎn)移組中MCM2表達(dá)陽性率71.0%，差異具有統(tǒng)計意義（Z=2.086，P=0.037）提示鼻咽癌中MCM2高表達(dá)可能是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的危險因素。且發(fā)現(xiàn)未分化癌中MCM2表達(dá)高于角化性鱗癌，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。表明MCM2的表達(dá)能夠較好地反映細(xì)胞的過度增生和異常分化。此外，III+IV期鼻咽癌中MCM2表達(dá)陽性率高于I、II期，提示MCM2表達(dá)的程度與鼻咽癌的臨床分期有關(guān)，MCM2高表達(dá)與鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

關(guān)于鼻咽癌頸淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移與增殖標(biāo)志物之間的關(guān)系，大部分學(xué)者認(rèn)為目前臨床最常用的增殖標(biāo)志物Ki67表達(dá)與鼻咽癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，鼻咽癌有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者Ki67的表達(dá)率高［21］。目前未見有MCM2表達(dá)在這方面的研究報導(dǎo)。有研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、胃癌中局部淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移者M(jìn)CM2表達(dá)率高［22，23］。但本組資料顯示MCM2的表達(dá)與有無頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移在統(tǒng)計學(xué)上無明顯差異?？赡苡邢铝性颍孩俨杉牟±龜?shù)不足夠多；②有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者在研究總病例中占有一半的比例；③其他未知原因。MCM2的表達(dá)與有無頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，但與臨床分期有關(guān)，是因為總分期更能反應(yīng)腫瘤的特性。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組患者中MCM2陽性表達(dá)陽性率增高，提示MCM2的高表達(dá)時其癌組織的生物學(xué)行為較為兇險，轉(zhuǎn)移風(fēng)險高。MCM2的高表達(dá)可能是鼻咽癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的因素之一；MCM2表達(dá)的程度可能是鼻咽癌預(yù)后評估的重要參考指標(biāo)。我們還需加大樣本量，進(jìn)行相關(guān)研究，保證結(jié)果的可靠。

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Immunohistochemical expression of mini chromosome maintenance protein 2 in nasopharyngeal carcinoma and its clinical implications

Pan Suming1，Du Richang2，Peng Shuping1*，Li Guiyuan1*
（1Cancer Research Institute，Central South University，Changsha 410078；2Department of Pathology，Yue Bei People's hospital of Guangdong province，Shaoguan 512025，China）

Objective To study the correlations of the immunohistochemical expression of mini chromosome maintenance protein 2（MCM2）in nasopharyngeal carcinoma with clinical stage，cervical lymph node metastasis，pathological type and distant metastasis.Methods The expression of MCM2 gene was studied in 62 cases of nasopharyngeal carcinoma by immunohistochemistry.Results①The expression level of MCM2 in primary nasopharyngeal carcinoma with distant metastasis was higher than in that without distant metastasis.②MCM2 expression was positively correlated with clinical stage.③MCM2 expression in anaplastic carcinoma was higher than in keratinizing squamous cell carcinoma.④MCM2 expression showed no significant differences regarding age，gender，and cervical lymph node metastasis.Conclusion MCM2 expression is associated with the clinical stage of nasopharyngeal carcinoma.The increased expression of MCM2 may be one of the factors for distant metastasis of nasopharyngeal carcinoma.The degree of MCM2 expression may be an important reference index for the prognosis evaluation of nasopharyngeal carcinoma.

Mini Chromosome Maintenance Protein 2；nasopharyngeal carcinoma；distant metastasis

R33

A

10.16705/j.cnki.1004-1850.

2016-01-18 〔修回日期〕2016-04-11

潘素明，男（1973年），漢族，主任醫(yī)師

（To whom correspondence should be addressed）：shuping@csu.edu.cn；lgy@csu.edu.cn