激活多巴胺I類受體對氧化性低密度脂蛋白誘導(dǎo)的人單核細胞THP-1分泌NO/NOS的影響*

柳 磊，時 颯，李鴻珠，李 弘，徐長慶

激活多巴胺I類受體對氧化性低密度脂蛋白誘導(dǎo)的人單核細胞THP-1分泌NO/NOS的影響*

柳 磊，時 颯，李鴻珠，李 弘△，徐長慶△

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室 ，黑龍江哈爾濱150086）

目的:探討激活多巴胺Ⅰ類受體（DR1）對氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導(dǎo)的人單核細胞（THP-1）分泌一氧化氮/一氧化氮合酶（NO/NOS）的影響及可能機制。方法:THP-1細胞經(jīng)佛波酯PMA誘導(dǎo)分化，分為正常對照組（control），氧化型低密度脂蛋白處理組（ox-LDL），DR1激動劑干預(yù)組（SKF），DR1阻斷劑干預(yù)組（SCH），ERK阻斷劑干預(yù)組（PD98059）；應(yīng)用油紅O染色法鑒定泡沫細胞；硝酸還原法檢測NO、NOS的變化情況；免疫熒光和Western blot檢測各組細胞蛋白表達情況。結(jié)果:ox-LDL刺激48 h可形成泡沫細胞；DR1在THP1細胞上表達，ox-LDL刺激后，DR1蛋白表達降低（P＜0.01）；激活DR1受體能夠明顯抑制由ox-LDL引起的NO、iNOS增多（P＜0.01）；在MAPK阻斷劑PD98059存在的情況下，SKF的作用部分喪失。結(jié)論:激活DR1受體可抑制ox-LDL引起的THP-1細胞NO的大量產(chǎn)生，此過程可能由ERK信號通路所介導(dǎo)。

多巴胺受體；巨噬細胞；一氧化氮；單核細胞；低密度脂蛋白

【DOI】10.13459/j.cnki.cjap.2016.03.022

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心臟及腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，而冠狀動脈硬化性心臟病是人類死亡的首位原因［1］。其病因和發(fā)病機制十分復(fù)雜，目前認為AS是由脂質(zhì)代謝紊亂引起的慢性炎癥反應(yīng)過程，包括內(nèi)皮細胞功能不全、單核巨噬細胞、平滑肌細胞及其源性的泡沫細胞的遷移、活化、增生及炎癥因子的釋放等病理過程［2，3］。AS過程中所涉及的內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞皆有多巴胺受體的表達，激活多巴胺I類受體具有明顯的抗氧化作用［3-6］。本研究擬在前期工作的基礎(chǔ)上 ，以人單核細胞作為研究對象，利用ox-LDL刺激復(fù)制泡沫細胞模型，觀察DR1激動劑對人單核細胞功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

人單核細胞系THP-1（American Type Culture collection）；RPMI 1640培養(yǎng)液、優(yōu)級胎牛血清（Hyclone）；DR1阻斷劑 SCH-23390、DR1激動劑SKF83959、ERK阻斷劑PD98059和佛波酯PMA（Sigma）；ox-LDL（北京協(xié)生生物）；油紅O試劑（北京索萊寶）；Western及 IP細胞裂解液（Beyotime）；Western Blue（Promega）；NO和NOS檢測試劑盒（南京建成）；p-ERK、ERK、DR1抗體（Santa Cruz）；堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗和熒光二抗（博士德）；其他試劑均為分析純。

1.2 泡沫細胞模型的建立及油紅O染色

THP-1細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、100 mg/ml鏈霉素、300mg/L谷氨酰胺的RPMI1640培養(yǎng)液中，加入PMA（終濃度為100μg/L）誘導(dǎo)貼壁48 h后，更換培養(yǎng)液，加入ox-LDL（終濃度為50 mg/L）繼續(xù)孵育48 h。棄培養(yǎng)液，PBS清洗3次，加入4%的多聚甲醛常溫固定20min，油紅O常溫染色10min，再加入60%的異丙醇分化至間質(zhì)清晰，PBS清洗3遍，蘇木素復(fù)染，于顯微鏡下觀察。

1.3 實驗分組

正常對照組（control）:僅用PMA誘導(dǎo)單核細胞貼壁；氧化性低密度脂蛋白干預(yù)組（ox-LDL）:PMA誘導(dǎo)48 h后，加入ox-LDL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h；DR1激動劑干預(yù)組（SKF）:PMA誘導(dǎo)48 h后，加入DR1激動劑SKF83959（10 mmol/L），作用30 min，然后加入ox-LDL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h；DR1阻斷劑干預(yù)組（SCH）:PMA誘導(dǎo)48 h后，先加入DR1阻斷劑SCH-23390（10 mmol/L）作用30 min，再加入DR1激動劑，作用30 min，最后加入ox-LDL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h；ERK阻斷劑干預(yù)組（PD98059）:PMA誘導(dǎo)48 h后，加入PD98059（10 mmol/L），作用30 min，再加入DR1激動劑作用30 min，最后加入ox-LDL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4 免疫熒光檢測DR1的表達情況

取培養(yǎng)的細胞，棄培養(yǎng)液，PBS清洗，4%的多聚甲醛常溫固定30min；PBS清洗，0.5%Triton-100常溫孵育30min，PBS清洗，羊血清37℃濕盒封閉1 h，DR1兔IgG一抗（1∶50）4℃孵育過夜，PBS清洗，熒光二抗（1∶100）避光常溫孵育1 h，PBS清洗，DAPI染核，PBS清洗，熒光顯微鏡下觀察并攝片。

1.5 NO和NOS含量檢測

取各組經(jīng)ox-LDL刺激48 h的細胞培養(yǎng)液，每組8個孔（每孔5×105cells），按照試劑盒說明書，運用紫外分光光度計測定吸光度（OD）值，通過相應(yīng)的計算公式，計算培養(yǎng)液中一氧化氮（nitric oxide，NO）和一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）的含量；培養(yǎng)細胞經(jīng)胰酶消化后細胞計數(shù)；計算細胞分泌NO 和NOS的含量。

1.6 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測相關(guān)蛋白的表達

取各組培養(yǎng)細胞，PBS洗滌，加入全細胞裂解液，冰上處理10min，4℃，12 000 r/min離心20min，取上清進行蛋白質(zhì)定量。取40μg總蛋白樣品于10%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用10%無脂肪牛奶封閉后，用兔IgG一抗（1∶500）4℃孵育過夜，堿性磷酸酶標(biāo)記二抗（1∶500）室溫孵育1 h，最后用western blue stabilized substrate for AP（Promega）顯色，光密度掃描半定量分析顯影條帶。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ox-LDL刺激THP-1細胞泡沫化

單純PMA誘導(dǎo)的THP-1細胞，胞漿內(nèi)未見紅色顆粒；而ox-LDL刺激48 h的THP-1細胞，大部分胞漿內(nèi)出現(xiàn)紅色的脂質(zhì)顆粒（圖1）。

Fig.1 Lipid aggregation in THP-1 cells induced by ox-LDL（Oil Red O staining×400）

2.2 ox-LDL刺激THP-1細胞DR1蛋白表達降低

免疫熒光結(jié)果顯示，THP-1細胞存在DR1的表達，主要存在于細胞膜和細胞質(zhì)中（圖2A）；Westernblot檢測也顯示DR1的蛋白表達（圖2B）；經(jīng)過ox-LDL誘導(dǎo)48 h后，與對照組相比，DR1表達降低（P ＜0.01，圖2B）。

2.3 DR1激活可以抑制ox-LDL誘導(dǎo)的THP-1細胞NO和NOS的產(chǎn)生

與正常對照組相比，經(jīng)ox-LDL刺激后，THP-1細胞分泌到培養(yǎng)液中的NO、tNOS和iNOS均增多（P ＜0.01）；DR1激動劑預(yù)處理后，能明顯抑制NO（P ＜0.05）、tNOS和iNOS的增多（P＜0.01）；DR1阻斷劑預(yù)處理后，與ox-LDL組相比，NO、tNOS和iNOS分泌沒有明顯變化；ERK阻斷劑預(yù)處理后，與單純DR1激動劑處理組相比，NO，tNOS和iNOS有所增多（P ＜0.05，表1）。

Fig.2 Expression of dopamine receptor（DR1）in THP-1 cellsA:Protein expression of DR1 in differentiated THP-1 cellswas detected by immnunofluorescence staining（×400）；B:Protein expression of DR1 in differentiated THP-1 cells

Tab.1 Contentof NO/NOS in the supernatantof THP-1 cell（±s，n=8）

Tab.1 Contentof NO/NOS in the supernatantof THP-1 cell（±s，n=8）

ox-LDL:Oxidized low density lipoprotein；SKF:DR1 agonist SKF83959+ox-LDL；SCH:DR1 antagonitSCH23390+DR1 agonist SKF83959+ox-LDL；PD98059:ERK antagonit PD98059+ DR1 agonist SKF83959+ox-LDL**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs ox-LDL group；△P＜0.05 vs SKF group

Group　NO（μmol/L）　tNOS（U/ml）　iNOS（U/ml）Control　12.642±2.073　5.486±0.757　3.455±0.172 ox-LDL　21.014±4.270**7.345±1.311**5.143±1.047**SKF　15.133±2.229#　5.663±0.793##4.001±0.145##SCH　19.219±3.521　7.076±1.362　5.279±0.145 PD98058　18.841±3.521△　6.677±1.362△4.742±0.634△

2.4 p-ERK和ERK蛋白的表達

Western blot結(jié)果顯示，與正常對照組相比，低密度脂蛋白處理后，p-ERK表達明顯減少（P＜0.01，圖3）；經(jīng)過DR1激動劑預(yù)處理后，與ox-LDL組相比，p-ERK表達增多（P＜0.05）；DR1阻斷劑預(yù)處理后，p-ERK表達降低；使用ERK阻斷劑并沒有影響p-ERK的表達水平。

Fig.3 The expression of p-ERK/ERK in THP-1 cells（n=8）ox-LDL:Oxidized low density lipoprotein；SKF:DR1 agonist SKF83959+ox-LDL；SCH:DR1 antagonit SCH23390+ DR1 agonist SKF83959+ox-LDL；PD98059:ERK antagonit PD98059+DR1 agonist SKF83959+ox-LDL

3 討論

動脈粥樣硬化是多種因素共同參與的慢性炎癥過程，病變的各個階段都伴有大量炎細胞的浸潤，而單核巨噬細胞的異常是引發(fā)和促進動脈粥樣硬化的關(guān)鍵因素，因此針對其黏附、聚集、膽固醇代謝，炎癥活動的研究已成為近年來AS的研究熱點［2］。脂類代謝異常尤其是低密度脂蛋白增多是AS的首位危險因素。巨噬細胞通過吞噬大量氧化修飾的低密度脂蛋白（ox-LDL），轉(zhuǎn)化成細胞內(nèi)脂質(zhì)堆積的泡沫細胞，進而形成脂質(zhì)條紋乃至脂質(zhì)斑塊［7］。本實驗通過ox-LDL刺激THP-1細胞，復(fù)制AS的細胞模型，結(jié)果顯示，經(jīng)過48 h的ox-LDL孵育，大部分細胞內(nèi)可見染成紅色的脂滴，提示使用該模型研究AS是可行的。

ox-LDL刺激的巨噬細胞會產(chǎn)生大量炎性介質(zhì)和活性氧，而氧化應(yīng)激可引起內(nèi)皮細胞損傷，促進平滑肌細胞增殖遷移，加速AS的進程［8，9］。適量的NO具有重要的生理功能，過量則具有毒性作用，引起細胞損傷，加重炎性反應(yīng)［6］。本實驗證實ox-LDL刺激的巨噬細胞誘導(dǎo)性一氧化氮合酶（（iNOS）增多，產(chǎn)生和分泌大量NO，引起氧化應(yīng)激，因此降低NO的水平將會抑制AS的進程。

多巴胺受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員，根據(jù)生化和藥理學(xué)特性的不同，將其分為D1樣和D2樣受體，其中D1與G蛋白中Gs結(jié)合，激活腺苷酸環(huán)化酶（AC），使cAMP增高，刺激磷脂酶C，導(dǎo)致細胞內(nèi)鈣增高。D2樣受體與Gi/Gq作用，抑制AC，降低cAMP，抑制鈣通道，調(diào)節(jié)鉀通道［10］。研究顯示，在血管平滑肌細胞中，多巴胺發(fā)揮抗氧化作用主要通過DR1［3-4］。巨噬細胞上存在多巴胺受體，激活DR1可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細胞增生［11］，但DR1在此過程中是如何發(fā)揮作用并不清楚。

本課題組前期實驗已證實，小劑量的多巴胺通過DR1能夠抑制過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細胞的損傷，具有抗氧化作用［6］。本實驗結(jié)果顯示，THP-1細胞的胞漿和細胞膜上存在DR1表達，但經(jīng)ox-LDL刺激后表達降低，提示其可能參與了泡沫細胞的形成。使用DR1激動劑預(yù)處理后，細胞生成的NO明顯減少，說明DR1激動劑能夠抑制由ox-LDL誘導(dǎo)的NO增多。為了進一步探討其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［12］，選擇ERK阻斷劑PD98059，可見多巴胺受體激動劑的作用受到抑制，說明DR1激活介導(dǎo)的抗氧化作用與ERK通路有關(guān)，具體機制還有待進一步探討。

綜上所述，氧化性低密度脂蛋白對細胞有損傷作用，激活DR1受體可抑制ox-LDL引起的THP-1細胞NO的大量產(chǎn)生，此過程可能通過ERK信號通路所介導(dǎo)。

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Effects of activation of dopam ine type I receptor on the production of NO/NOS in ox-LDL activated THP-1 cells

LIU Lei，SHISa，LIHong-zhu，LIHong△，XU Chang-qing△
（Department of Pathophysiology，Harbin Medical University，Harbin 150086，China）

【ABSTRACT】Objective:To study the effectof excited dopamine type Ireceptoron the production ofnitric oxide/nitric oxide synthase（NO/ NOS）in ox-LDL activated THP-1 cells and the possiblemechanism.Methods:Cultured THP-1 cellsactivated by PMAwere random ly assigned in the following groups:control group（control），oxidized low density lipoprotein group（ox-LDL），dopamine receptor 1（DR1）agonistgroup （SKF），DR1 antagonistgroup（SCH），ERK blocker group（PD98059）.Oil Red O stainingwas used to identify the accumulation of cellular lipid.The levels of NO and NOS in the supernatantof THP-1 were assayed by nitrate reductasemethod.The protein expression of DR1，p-ERK and ERK were obtained byWestern blotand immunity fluorescence.Results:After48 h of incubation ofox-LDL，accumulation of lipid in the cytoplasm was found inmost THP-1 cells.Compared with control group，DR1 protein expressionwas reduced in ox-LDL-induced cells （P＜0.01）.Activation of DR1 agonist decrease the production of NO and iNOS（P＜0.01），and PD98059 partly reversed the above effect. Conclusion:Activation of DR1 can inhibit the production of NO/NOS in ox-LDL-induced THP-1 cells，whichmay be relatedwith ERK pathway.

dopamine receptor（DR）； foam cells； nitric oxide（NO）； THP-1 cells； LDL

R363.2

A

1000-6834（2016）03-274-04

黑龍江省自然科學(xué)基金項目資助（D200880）；黑龍江省教育廳課題（12521181）

2015-03-09

2015-10-20

Tel:0451-86674548；E-mail:drlihong1971@163.com