基于CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠

趙亞，李紅武，師長宏，張彩勤，趙勇，劉佩娟，白冰，唐娟，白杰英，張海*

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，西安　710032；2.北京艾德摩生物技術(shù)有限公司，北京　101111；3.第四軍醫(yī)大學(xué)細胞工程中心，西安　710032； 4.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，北京　100071)

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基于CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠

趙亞1，李紅武2，師長宏1，張彩勤1，趙勇1，劉佩娟1，白冰1，唐娟3，白杰英4，張海1*

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，西安710032；2.北京艾德摩生物技術(shù)有限公司，北京101111；3.第四軍醫(yī)大學(xué)細胞工程中心，西安710032； 4.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，北京100071)

目的應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向敲除編碼小鼠T、B細胞的Rag2基因及編碼NK細胞的IL2rg基因，構(gòu)建T、B細胞及NK細胞聯(lián)合免疫缺陷小鼠。方法根據(jù)Genbank報道的Rag2及IL2rg基因序列，分別針對其外顯子設(shè)計25 bp左右的sgRNA并進行合成， sgRNA退火后克隆入pX330載體。Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA及Cas9重組質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄為mRNA后顯微注射入BALB/c小鼠受精卵細胞，受精卵細胞移植到受體動物獲得子代小鼠，首建鼠(F0)與野生型小鼠交配獲得F1代小鼠，突變的F1代小鼠互交后篩選F2代純合子小鼠。通過基因測序、流式細胞技術(shù)及接種人源性腫瘤細胞系方法檢測子代小鼠基因型和表型。結(jié)果成功構(gòu)建了Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA重組質(zhì)粒并對其進行了體外轉(zhuǎn)錄，mRNA顯微注射并移植后獲得57只F0小鼠。連續(xù)交配后，獲得F2代純合子小鼠。序列分析表明子代小鼠中IL2rg有兩個基因型，分別是10 bp和11 bp的缺失突變；而Rag2只有一個基因型，為8 bp的缺失突變。與野生型BALB/c小鼠相比，小鼠外周血中CD3、B220及NKp46陽性細胞數(shù)量明顯降低。接種人乳腺癌細胞系SKBR-2HL后，腫瘤生長良好，且隨著時間延長腫瘤組織逐漸增大。結(jié)論利用CRISPR/Cas9技術(shù)可有效實現(xiàn)BABL/c小鼠體內(nèi)Rag2、IL2rg基因突變，并導(dǎo)致小鼠T、B及NK細胞功能異常。

CRISPR/Cas9；基因敲除；免疫缺陷小鼠

1966年,研究者發(fā)現(xiàn)Foxn1基因突變后小鼠T細胞功能障礙，不能產(chǎn)生細胞特異性免疫反應(yīng)，由此開辟了自發(fā)性免疫缺陷動物研究的先河[1]。隨之B細胞缺陷的Beige小鼠、T細胞及B細胞聯(lián)合缺陷SCID小鼠也相繼被發(fā)現(xiàn)并在生物醫(yī)學(xué)研究多個領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[1]。盡管T細胞和/或B細胞功能障礙后形成的免疫缺陷小鼠在生物醫(yī)學(xué)研究中取得了很多重大研究成果，但其體內(nèi)殘存的NK細胞、巨噬細胞、中性粒細胞等介導(dǎo)的先天性免疫應(yīng)答反應(yīng)仍然會對移植物產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，從而影響腫瘤在其體內(nèi)存活。近年來，研究者進行了許多努力，試圖找到免疫缺陷程度更高、免疫包容性更強的實驗用小鼠以替代裸鼠或SCID小鼠。隨著體外同源重組技術(shù)和胚胎干細胞技術(shù)的不斷完善，尤其是隨著TALEN技術(shù)和CRISPR/Cas9技術(shù)的誕生使得這種可能成為現(xiàn)實[3]。

Rag2(recombination activating gene 2)基因缺失或突變后，阻滯T細胞和B細胞發(fā)育，從而影響T細胞和B細胞功能[4]。而IL2rg(interleukin 2 receptor gamma chain)基因與NK細胞功能有關(guān)，當(dāng)其缺失或突變后，NK細胞功能發(fā)生障礙[5]。本研究以CRISPR/Cas9技術(shù)為基礎(chǔ)，分別設(shè)計針對Rag2和IL2rg基因的sgRNA，體外轉(zhuǎn)錄后與Cas9 mRNA共同顯微注射BALB/c小鼠受精卵以期獲得T細胞、B細胞及NK細胞功能聯(lián)合缺陷的基因修飾動物。

1　材料與方法

1.1材料

120只SPF級BALB/c 小鼠和ICR小鼠，6～8周齡，雌雄各半，由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供[SCXK(陜)2014-002]，飼養(yǎng)于該單位屏障設(shè)施[SYXK(陜)2014-001]。RNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Ambion公司，DNA凝膠回收試劑盒購自天根生物科技有限公司。LongAmp Taq DNA聚合酶由NEB公司提供。小鼠FITC-CD3、PE-NKp46及APC-B220抗體由Biolegend公司提供。鼠尾基因組DNA提取試劑盒購自于成都福際生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1寡核苷酸合成及質(zhì)粒構(gòu)建

根據(jù)Genbank報道的Rag2(NM_009020)和IL2rg(NM_013563)基因序列，應(yīng)用http://crispr.mit.edu/網(wǎng)站工具進行分析，分別針對IL2rg基因第1外顯子和Rag2基因第2外顯子設(shè)計兩個各25 bp左右的sgRNA用于基因打靶(圖1，下劃線為靶序列，大寫為PAM區(qū))。sgRNA合成后退火，以T4連接酶克隆入經(jīng)BbsI酶切線性化的pX330載體，構(gòu)建含有sgRNA的pX330重組質(zhì)粒。測序正確后，擴大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒用于體外轉(zhuǎn)錄模板。

1.2.2體外轉(zhuǎn)錄

以pX330-Rag2-sgRNA和pX330-IL2rg-sgRNA重組質(zhì)粒為模板，PCR法克隆含T7啟動子的Rag2-sgRNA和IL2rg-sgRNA。相同方法克隆Cas9基因，純化后回收，DNA溶于DEPC水中保存。分別取200 ng的Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA及Cas9純化后產(chǎn)物進行體外轉(zhuǎn)錄，定量后-80℃保存。

1.2.3mRNA顯微注射及受精卵細胞移植

8周齡BALB/c小鼠雄性與雌性小鼠使用前一天合籠，24 h后取見栓的雌性小鼠解剖，在輸卵管部位獲取受精卵細胞。分別取已轉(zhuǎn)錄好的20 μg/μL Rag2-sgRNA及10 μg/μL IL2rg-sgRNA和5 μg/μL Cas9 mRNA混合，以Eppendorf NK2顯微注射儀注射到受精卵細胞胞質(zhì)中。受精卵細胞在37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2～3 h，取生長狀態(tài)良好，發(fā)育至2細胞期受精卵細胞移植到ICR假孕鼠輸卵管部位。

1.2.4基因敲除小鼠品系建立及基因型鑒定

取出生1周左右的F0代小鼠尾組織，裂解后以試劑盒提取小鼠基因組DNA，PCR方法克隆F0代小鼠Rag2和IL2rg基因。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，50℃退火40 s，65℃延伸40 s，共進行35個循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后以65℃延伸6 min。取10 μL PCR產(chǎn)物進行電泳，大小正確后進行測序。突變的F0代小鼠與野生型小鼠交配，獲得F1代雜合子小鼠，F(xiàn)1代雜合子小鼠互交即可獲得雙基因突變的純合子小鼠。

1.2.5流式細胞術(shù)鑒定小鼠表型

通過剪尾方法取50 μL F0代小鼠外周血，紅細胞裂解液裂解后以FACS緩沖液洗脫，加入1∶1000稀釋的FITC-CD3、PE-NKp46及APC-B220抗體室溫避光染色30 min。FACS緩沖液洗脫后上機檢測小鼠外周血白細胞中CD3、B220及NKp46的表達情況。

1.2.6腫瘤移植模型鑒定小鼠表型

SKBR-2HL人乳腺癌細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，消化后取1×107個細胞接種至4周齡 F0代小鼠腹外側(cè)皮下，接種腫瘤細胞的F0代小鼠繼續(xù)飼養(yǎng)3周，期間在不同時間觀察瘤體大小。

2　結(jié)果

2.1質(zhì)粒構(gòu)建及RNA轉(zhuǎn)錄

根據(jù)Genbank報道的Rag2和IL2rg基因序列，分別針對Rag2基因第2個外顯子及IL2rg基因第1個外顯子設(shè)計具有靶向作用的sgRNA，sgRNA序列見表1。sgRNA合成后經(jīng)退火，連入pX330載體，構(gòu)建含有sgRNA的pX330重組質(zhì)粒。質(zhì)粒小提并經(jīng)測序后表明質(zhì)粒構(gòu)建正確。sgRNA及Cas9克隆后，在T7啟動子作用下進行體外轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定后為單一條帶，且A260/280>1.9，A260/230>2.3。

表1　sgRNA靶點及寡核苷酸序列

2.2基因敲除小鼠品系的建立及基因型鑒定

共收集BALB/c小鼠胚胎數(shù)740枚，其中609枚為受精卵細胞，顯微注射后有249枚存活，移植到ICR受體鼠后制備F0代首建鼠。測序后取F0代突變小鼠與野生型BALB/c小鼠交配獲得F1代小鼠，突變的F1代小鼠互交后獲得Rag2和IL2rg雙基因突變的F2代純合子小鼠。F0、F1及F2代小鼠出生約1周后，剪取小鼠尾尖3～5 mm組織用于基因組DNA提取。取1 μL DNA為模板進行PCR反應(yīng)，1% 凝膠電泳鑒定后發(fā)現(xiàn)Rag2基因片段大小為821 bp，IL2rg片段大小為686 bp，與預(yù)期大小相符(圖2A)。測序結(jié)果表明F0、F1及F2代小鼠IL2rg基因有兩個突變型，分別是10 bp和11 bp的缺失突變；而Rag2基因只有一個突變型，為8 bp的缺失突變(圖2B)。

2.3基因敲除小鼠表型鑒定

突變小鼠尾尖處取血50 μL進行流式分析。與正常野生型小鼠比較，基因敲除小鼠CD3+T細胞、B220+B細胞及NKp46+NK細胞數(shù)量下降明顯(圖3A)，表明CRISPR/Cas9技術(shù)對Rag2和IL2rg基因進行編輯后影響到這兩個基因編碼的生物學(xué)功能，導(dǎo)致T細胞、B細胞及NK細胞數(shù)量降低。進一步通過復(fù)制人腫瘤模型驗證基因敲除小鼠生物學(xué)特性，人乳腺癌細胞SKBR-2HL分別接種3只基因敲除小鼠， 1周后可見腫瘤細胞在小鼠體內(nèi)生長，且隨著時間延長，腫瘤體積不斷增大(圖3B)。結(jié)合流式檢測結(jié)果，我們認為Rag2和IL2rg基因敲除小鼠不僅T細胞、B細胞及NK細胞數(shù)量下降，而且其免疫功能缺陷，移植物可在其體內(nèi)增殖。

注：A. 突變小鼠PCR鑒定；B. 靶基因測序結(jié)果。圖2　基因敲除小鼠基因型鑒定Note. A. PCR identification of the mutant mice. B. Sequence results of the target geneFig.2　Identification of the genotype of knockout mice

注：A.流式細胞檢測T細胞、B細胞及NK細胞數(shù)量； B.基因敲除小鼠接種SKBR-2HL細胞后腫瘤生長情況。圖3　基因敲除小鼠表型鑒定Note.A:Flow cytometry to detect the T,B and Nk cells.B:Tumor growth of the knokout mice after implantation of SKBR-2HL cells.Fig.3　Identification of the phenotype of the knockout mice

3　討論

BALB/c小鼠由于其生物學(xué)特性明確，是目前免疫學(xué)、微生物學(xué)等研究領(lǐng)域常用的近交系小鼠。nude基因?qū)隑ALB/c小鼠后可培育成傳統(tǒng)的免疫缺陷小鼠品系BALB/c-nu/nu，該類小鼠T細胞缺陷，因而T細胞介導(dǎo)的細胞免疫功能嚴重下降[6]。但該類小鼠B細胞及其他免疫細胞正常，這些細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)常會影響動物模型復(fù)制效果。如人類腫瘤模型復(fù)制時，一些人類腫瘤模型難以在BALB/c-nu/nu裸鼠中建立，除過腫瘤細胞致瘤性外，BALB/c-nu/nu裸鼠免疫細胞狀態(tài)也是影響腫瘤模型復(fù)制的關(guān)鍵因素之一。為了克服以上弊端，有必要研究出免疫缺陷程度更高、免疫包容性更強、且遺傳背景來源于BALB/c小鼠的動物用于免疫學(xué)、微生物學(xué)、腫瘤學(xué)等領(lǐng)域研究?；诖四康模狙芯恳訠ALB/c小鼠為對象，通過CRISPR/Cas9技術(shù)對其進行遺傳修飾，研究制備出免疫缺陷程度更高的BALB/c小鼠。

超數(shù)排卵是獲取受精卵細胞的常用技術(shù)方法，但BALB/c小鼠對PMSG和hCG不敏感，難以用這兩種激素對其進行超排[7]。本研究中我們采用8周齡 BALB/c雌性小鼠與7周齡雄性小鼠進行自然交配，盡管在交配前挑取雌性發(fā)情小鼠，但獲取小鼠受精卵細胞數(shù)量仍然很低，平均每只小鼠只能收獲2個細胞，因此在以后研究中需摸索出最佳交配條件以提高BALB/c小鼠卵細胞收集率。收集的卵細胞生長狀態(tài)良好，740枚卵細胞中有609枚為受精卵細胞，受精率82%，顯微注射后有249枚受精卵細胞存活，存活率為41%，移植到12只ICR受體鼠后出生57只F0代首建鼠，每只小鼠平均產(chǎn)仔4.8只。這些數(shù)據(jù)表明盡管通過自然交配方式獲取BALB/c小鼠卵細胞數(shù)量少，但這種方式獲取的受精卵細胞能完全滿足基因修飾動物的構(gòu)建。

傳統(tǒng)基因敲除主要是應(yīng)用同源重組原理通過插入突變和基因靶向技術(shù)使目的基因功能喪失，但這些方法對技術(shù)要求高，制作周期長，只能在一些專業(yè)實驗室才能完成。CRISPR/Cas9技術(shù)就是利用sgRNA與同源性的DNA能特異性結(jié)合的原理，sgRNA發(fā)揮靶向作用，引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶Cas9 在靶點處進行切割，從而達到基因修飾的目的[8]。因此與特定位點同源的sgRNA和核酸內(nèi)切酶Cas9是CRISPR/Cas9技術(shù)中不可或缺的兩個要素。Rag2和II2rg基因序列分析表明，這兩個基因緊鄰其上、下游分子，且有部分重疊，如對其進行大片段缺失突變將會影響到上、下游分子表達。針對這種情況，本研究以Rag2和II2rg基因外顯子為靶點進行小片段突變，這種突變不僅可導(dǎo)致Rag2和II2rg基因功能失活，而且也對其上、下游基因表達無明顯影響。與傳統(tǒng)基因敲除方法相比，CRISPR/Cas9技術(shù)具有快速、可靠及敲除效率高等特點，本研究采用CRISPR/Cas9技術(shù)一步敲除了兩個不同基因，敲除后T細胞、B細胞及NK細胞不僅數(shù)量下降明顯，而且細胞功能也發(fā)生障礙，接種人乳腺癌細胞系后腫瘤細胞生長良好，表現(xiàn)出與傳統(tǒng)免疫缺陷動物相似的生物學(xué)特性。

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Construction of severe combined immunodeficiency mice based on CRSIPR/Cas9 technology

ZHAO Ya1, LI Hong-wu2, SHI Chang-hong1, ZHANG Cai-qin1, ZHAO Yong1,LIU Pei-juan1, BAI Bing1, TANG Juan3, BAI Jie-ying4, ZHANG Hai1*

(1. Laboratory Animal Center, Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China;2. Beijing IDMO Co., Ltd, Beijing 101111; 3. Cell Engineering Research Center, Fourth Military Medical University, Xi’an 710032; 4. Laboratory Animal Center, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071 )

ObjectiveTo knockout Rag2 and IL2rg genes and construct severe combined immunodeficiency mice based on CRISPR/Cas9 technology. MethodDesign and synthesis of 25 bp sgRNA were made according to the Rag2 and IL2rg sequences in Genbank. After annealing, sgRNA was cloned into pX330 vector. Recombination plasmid Rag2-sgRNA, IL2rg-sgRN and Cas9 were then transcribed into RNA, these RNA were microinjected into zygotes and the zygotes were transplanted into recipient ICR mice. F0 founders were born and mutated F0 founders mated with wild type mice to obtain F1 generation heterozygous mice. Mutated F1 mice were crossed and got F2 generation homozygous mice. Genotype and phenotype of the knockout mice were identified by sequencing, flow cytometry and xenograft model. ResultsRag2-sgRNA and IL2rg-sgRNA recombination plasmids were constructed and transcribed into RNA. After microinjection and mating, F0 founders were born and F2 homozygous mice were obtained. The results of sequencing showed that there were two types of genotype in IL2rg gene, 10 bp or 11 bp deletion; however, there was only one genotype in Rag2 gene, which was 8 bp deletion. Compared with wild-type BALB/c mice, the number of CD3+, B220+and NKp46+cells in peripheral blood of the knockout mice was reduced significantly. After inoculation of human breast cancer cell line SKBR-2HL cells, tumor size in the xenograft mouse model was increased gradually along with time extension. Conclusion CRISPR/Cas9 is an efficient way to mutate Rag2 and IL2rg gene in miceinvivo, leading to aberrant T cells, B cells and NK cells.

CRISPR/Cas9; Knockout; Severe combined immunodeficiency mice

ZHANG Hai. E-mail: hzhang@fmmu.edu.cn

軍隊重點研究課題(NO：BWS14J058); 國家自然科學(xué)基金面上項目(NO:81272385)；陜西省科技資源統(tǒng)籌項目(NO:2014FWPT-11)。

趙亞(1988-)，女，技術(shù)員。研究方向：動物模型。E-mail: 1587041791@qq.com

張海(1971-)，副教授，研究方向：動物模型。E-mail: hzhang@fmmu.edu.cn

研究報告

Q95-33

A

1005-4847(2016)04-0339-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2016.04.002

2016-05-06