GGTA1-/-五指山小型豬SLAI類基因分子特征及與HLA相似性分析

蔣應(yīng)弟，曾國(guó)敏，石寧寧，李西睿，紀(jì)慧麗，潘登科*，滾雙寶

(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州　730070；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部畜禽遺傳資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京　100193；3. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州　730070)

?

GGTA1-/-五指山小型豬SLAI類基因分子特征及與HLA相似性分析

蔣應(yīng)弟1,2，曾國(guó)敏2，3，石寧寧2，李西睿2，紀(jì)慧麗2，潘登科2*，滾雙寶1*

(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州730070；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部畜禽遺傳資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；3. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州730070)

目的明晰α-1,3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因敲除(GGTA1-/-)的五指山小型豬SLA經(jīng)典I類基因分子結(jié)構(gòu)特征及其與人HLA的相似性，對(duì)研究異種器官移植細(xì)胞性排斥反應(yīng)具有重要意義。 方法 采集6頭祖代GGTA1-/-五指山小型豬耳組織，利用RT-PCR對(duì)SLAI類基因(SLA-1、SLA-3、SLA-2)擴(kuò)增、克隆及測(cè)序，對(duì)序列進(jìn)行BLAST分析，并采用生物信息學(xué)方法對(duì)SLAI類基因分子結(jié)構(gòu)特征及其與人HLA的同源性進(jìn)行分析。 結(jié)果測(cè)序分析表明，共獲得6條等位基因序列，其中4條為已公布的等位基因(SLA-1*0703、SLA-2*1102、SLA-3*0401、SLA-3*0403)，另2條為新等位基因(SLA-1*0401wz01、SLA-2*11wz01)。五指山小型豬與人HLA同源性為70.5%～72.1%。SLA-1*0401wz01、SLA-1*0703、SLA-2*11wz01、SLA-2*1102和SLA-3*0401的CD8+分子識(shí)別的關(guān)鍵結(jié)合域與人HLA氨基酸序列比對(duì)，均僅在位點(diǎn)225、228處發(fā)生了突變(T→S、T→M)，其他位點(diǎn)高度保守。SLA-2*11wz01和SLA-2*1102與人HLAI類基因NK細(xì)胞抑制性受體(killerinhibitoryreceptor，KIR)結(jié)合區(qū)氨基酸同源性較高，在NKTA-1亞型結(jié)合域內(nèi)僅有1個(gè)氨基酸差異，而在NKTA-2 和NKTA-3亞型結(jié)合域內(nèi)有2個(gè)氨基酸差異。 結(jié)論從免疫細(xì)胞介導(dǎo)的異種排斥反應(yīng)角度出發(fā)，GGTA1-/-五指山小型豬SLAI類基因氨基酸序列與人HLA高度相似，可作為未來(lái)豬-人異種器官移植的良好供體之一。

GGTA1-/-；五指山小型豬；SLA；異種移植；免疫排斥

α-1,3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因敲除(GGTA1-/-)豬的誕生有效克服了異種移植時(shí)超急性排斥反應(yīng)的發(fā)生，隨后細(xì)胞性排斥成為目前亟待解決的問(wèn)題[1-4]。免疫細(xì)胞介導(dǎo)的異種排斥反應(yīng)可分為適應(yīng)性細(xì)胞反應(yīng)和固有細(xì)胞免疫反應(yīng)。其中適應(yīng)性免疫細(xì)胞主要指T淋巴細(xì)胞，而固有免疫細(xì)胞包括自然殺傷(naturalkiller,NK)細(xì)胞、單核吞噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)等。研究報(bào)道豬白細(xì)胞抗原(swineleukocyteantigen，SLA)是引起異種移植細(xì)胞性免疫排斥的遺傳因素之一[5-7]。異種移植引起的CD8+T細(xì)胞免疫排斥反應(yīng)的大小主要取決于供體細(xì)胞表面SLAⅠ類分子與被CD8+分子識(shí)別的HLA分子的同源性[8-9]。人NK細(xì)胞的活性受表面抑制性受體的調(diào)控。當(dāng)抑制受體識(shí)別自身MHCI分子后，對(duì)NK細(xì)胞毒作用產(chǎn)生抑制性信號(hào)，避免NK細(xì)胞對(duì)自體細(xì)胞的攻擊[10]。但異種移植時(shí)，人NK細(xì)胞抑制性受體不能識(shí)別SLAI分子，因而不能向NK細(xì)胞受體提供抑制性信號(hào)，從而產(chǎn)生抗豬的NK細(xì)胞毒作用[11]。

五指山小型豬是目前我國(guó)異種器官移植研究常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一。國(guó)內(nèi)關(guān)于五指山小型豬SLAI類基因的研究大多集中在多態(tài)性較高的外顯子或單個(gè)基因的克隆分析[12-14]，對(duì)SLAI類基因全長(zhǎng)cDNA序列結(jié)構(gòu)特征分析及與人HLA相似性報(bào)道較少。利用體細(xì)胞核移植技術(shù)獲得的GGTA1-/-五指山小型豬已被多次應(yīng)用于異種器官移植臨床前研究[15-16]，鑒于此，本研究以GGTA1-/-五指山小型豬為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)其SLA經(jīng)典I類基因(SLA-1、SLA-2、SLA-3)分子結(jié)構(gòu)特征研究及與人HLA相似性分析，為篩選更適合異種移植研究的GGTA1-/-五指山小型豬提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1 材料

采集6頭祖代7～8月齡、體重在10～40kg普通級(jí)的GGTA1-/-五指山小型豬耳組織樣本，液氮中保存。

動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pEASY-T1SimpleCloningKit購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；TaKaRaLATaq 聚合酶、2×GCBufferII購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；DNA純化回收試劑盒、DH10b感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司。

1.2方法

1.2.1RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

提取樣本的總RNA；用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA質(zhì)量；采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2SLA-1、SLA-3和SLA-2基因的擴(kuò)增

參考GenBank中SLAI類基因序列，用Lasergene7.1軟件包中的PrimerSelect軟件分別設(shè)計(jì)SLA-1和SLA-3擴(kuò)增引物，SLA-2擴(kuò)增引物引用Gao等[19]的研究，引物由中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司合成。引物序列及退火溫度見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系:10.0μL2×GCbufferII，上下游引物(10μmol/L)各1.0μL，0.4μLdNTPs(10mmol/L), 0.1μLLaTaq酶，1.0μLcDNA模板，6.5μLddH2O，總反應(yīng)體系為20μL。PCR擴(kuò)增程序: 95℃預(yù)變性 5min；95℃變性 30s，表1中各退火溫度 30s，72℃延伸80s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，16℃保存。

表1　SLAⅠ類基因的擴(kuò)增引物

1.2.3基因的克隆及序列分析

PCR產(chǎn)物用純化試劑盒切膠回收，克隆并經(jīng)陽(yáng)性鑒定后送中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，每個(gè)基因座篩選至少8個(gè)以上陽(yáng)性單克隆菌液進(jìn)行測(cè)序，利用Lasergene7.1軟件包中的SeqMan程序?qū)Λ@得的序列進(jìn)行剪切拼接，拼接序列通過(guò)BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)比對(duì)分析，新等位基因的序列提交至GenBank并獲取相應(yīng)序列號(hào)。

1.2.4同源性分析

使用MegAlign軟件在氨基酸水平上對(duì)五指山小型豬與NIH小型豬、人和鼠SLAI類等位基因同源性分析,且與被CD8+分子識(shí)別的HLA關(guān)鍵結(jié)合域氨基酸相似性、與HLAⅠ類基因KIR結(jié)合區(qū)氨基酸相似性進(jìn)行比較。

2　 結(jié)果與分析

2.1SLAⅠ類基因的擴(kuò)增

圖1　總RNA(A)及SLA-1(B.1)、SLA-2(B.2)、SLA-3(B.3)基因Fig.1　A: Agarose gel assay of the total RNA; B: Agarose gel assay of RT-PCR amplification of SLA-1, SLA-2 and SLA-3 genes

GGTA1-/-五指山小型豬耳組織總RNA電泳結(jié)果(圖1A)，顯示：RNA質(zhì)量較好；SLA-1、SLA-2和SLA-3均有特異性擴(kuò)增條帶，大小分別為1200bp、1231bp和1300bp,與預(yù)期擴(kuò)增結(jié)果一致(圖1B)。2.2SLAI類基因序列分析

在GGTA1-/-五指山小型豬SLA-1、SLA-2、SLA-3基因座上均獲得2條序列，經(jīng)BLAST分析，SLA-1基因中的1條為新等位基因，將序列提交于GenBank，獲得其序列號(hào)：SLA-1*0401wz01 (AccessionNo:KT715501)，另1條SLA-1*0703已報(bào)道；SLA-3基因中2條等位基因序列均已被報(bào)道，分別為SLA-3*0401 (AccessionNo:AF464011 )、SLA-3*0403 (AccessionNo:KT715502)；SLA-2基因中的SLA-2*1102 (AccessionNo:JQ361654 )為已發(fā)現(xiàn)的等位基因，另外1條為新的等位基因，將其提交于GenBank，獲得序列號(hào)：SLA-2*11wz01 (AccessionNo:KT194213)。將SLA-1和SLA-2基因座上的新等位基因分別與NCBI中相應(yīng)等位基因核苷酸比對(duì)發(fā)現(xiàn)新等位基因的高變異位點(diǎn)主要集中在第2、3外顯子上，其他位點(diǎn)相對(duì)保守。

2.3SLAⅠ類基因在個(gè)體中的分布

6頭GGTA1-/-五指山小型豬個(gè)體中SLA經(jīng)典Ⅰ類基因座上共獲得6條等位基因序列，6個(gè)等位基因在個(gè)體中的分布情況見(jiàn)表2。

2.4SLAI類等位基因的同源性分析

將本研究獲得等位基因序列與美國(guó)NIH小型豬、人及鼠相應(yīng)等位基因在氨基酸水平進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)五指山小型豬SLAI類等位基因序列與NIH小型豬在氨基酸水平上同源性在83.2% ～100%之間，與人HLA同源性為70.5% ～72.1%。SLA-1*0401wz01與NIH豬SLA-1*0401相比，核苷酸序列僅在位點(diǎn)564處發(fā)生同義突變(G→C)，與人HLA同源性高達(dá)70.8%；SLA-2基因座上等位基因SLA-2*11wz01、SLA-2*1102與NIH小型豬相應(yīng)等位基因同源性高達(dá)92.1%，與人HLA同源性高達(dá)71.3%，與鼠的同源性僅為62.2%；SLA-3基因座上等位基因SLA-3*0401、SLA-3*0403與NIH小型豬相應(yīng)等位基因同源性高達(dá)94.5%，與人的同源性高達(dá)72.1%。各等位基因的同源性比對(duì)情況見(jiàn)表3。

表2　SLA I類基因座上等位基因的分布

表3　SLA-1、SLA-2、SLA-3等位基因氨基酸同源性比較

注：A*0201表示人群中出現(xiàn)頻率較高的HLA-A*0201基因；斜體表示NIH小型豬SLA-1、SLA-2、SLA-3基因座上出現(xiàn)頻率較高的等位基因，依次為：SLA-1*0701(AF464036)、SLA-1*0401(AF464002)、SLA-2*0401(AF014006)、SLA-2*0301(AF014004)、SLA-3*0301(AF014003)、SLA-3*0602(DQ303227)。H-2Db表示鼠的相應(yīng)等位基因。

Note.A*0201standsforHLA-A*0201,aclassIallelewiththehighestfrequencyinhumanpopulations.Italicstandsforalleles,aclassIallelewiththehighestfrequencyintheNIHpopulationsminipigs,asfollows:SLA-1*0701 (AF464036),SLA-1*0401 (AF464002),SLA-2*0401 (AF014006),SLA-2*0301 (AF014004),SLA-3*0301 (AF014003),andSLA-3*0602 (DQ303227).H-2Dbstandsforcorrespondingmousealleles.

2.5SLAI類分子與被CD8+分子識(shí)別的HLA分子序列的同源性比較

將五指山小型豬SLAI類SLA-1、SLA-2、SLA-3座位上的等位基因推測(cè)得到氨基酸序列與被CD8+分子識(shí)別結(jié)合的HLA-A*0201關(guān)鍵氨基酸序列區(qū)域進(jìn)行比對(duì)(表4)。結(jié)果顯示，SLA-1*0401wz01、SLA-1*0703、SLA-3*0401、SLA-2*1102和SLA-2*11wz01等位基因都僅在位點(diǎn)225和228處發(fā)生突變，由蘇氨酸(Thr)→絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)→蛋氨酸(Met)，說(shuō)明SLA-1*0401wz01、SLA-1*0703、SLA-3*0401SLA-2*1102和SLA-2*11wz01與人CD8+受體結(jié)合所必需的關(guān)鍵氨基酸殘基高度相似。但SLA-3*0403等位基因在位點(diǎn)225處由蘇氨酸(Thr)→甘氨酸(Gly),在位點(diǎn)228處由蘇氨酸(Thr)→蛋氨酸(Met)，并在位點(diǎn)227～228之間插入4個(gè)氨基酸，依次為：谷氨酰胺(GIn)、絲氨酸(Ser)、谷氨酰胺(GIn)、酪氨酸(Tyr)。鼠的H-2Db等位基因氨基酸序列分別與被CD8+分子識(shí)別并結(jié)合的HLA-A*0201關(guān)鍵氨基酸序列區(qū)域比對(duì)發(fā)現(xiàn)，H-2Db有4個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了突變。

表4　五指山小型豬SLA I類分子與被CD8+分子識(shí)別的HLA氨基酸序列的同源性比較

注：斜體字母表示插入的氨基酸；“+”表示與人的HLA-A*0201氨基酸相同；“-”表示缺失的氨基酸；HLA-A*0201人群中出現(xiàn)頻率較高的等位基因。

Note.Theitalicstandsforinsertedaminoacids. “+”indicatesthattheaminoacidsareidenticaltohumanHLA-A*0201. “-”indicatesthatthedeletedaminoacid.A*0201standsforHLA-A*0201,aclassIallelewiththehighestfrequencyinhumanpopulations.

2.6SLAI類基因與HLAI類基因KIR結(jié)合區(qū)重要氨基酸的比較分析

表5為SLAI類基因與HLAI類基因KIR結(jié)合區(qū)關(guān)鍵氨基酸的比較分析。從表中可以看出，SLA-2*11wz01和SLA-2*1102與人HLAI類基因KIR結(jié)合區(qū)氨基酸同源性較高，在NKTA-1亞型結(jié)合域內(nèi)僅有1個(gè)氨基酸差異，而在NKTA-2 和NKTA-3亞型結(jié)合域內(nèi)存在2個(gè)氨基酸差異。SLA-1*0401wz01基因與人HLAI類基因KIR結(jié)合區(qū)氨基酸差異較大，在3種亞型結(jié)合域內(nèi)均只有一個(gè)氨基酸相同。SLA-1*0703、SLA-3*0401和SLA-3*0403基因與人HLAI類基因KIR結(jié)合區(qū)氨基酸同源性介于SLA-2*11wz01和SLA-1*0401wz01之間。

表5　 SLA I類分子與HLA I類分子中KIR的配體氨基酸序列比較

注：NKTA-1/2/3表示3種與KIR結(jié)合的HLA氨基酸殘基序列；“-”表示與人的HLA氨基酸序列相同。

Note.NKTA-1,NKTA-2andNKTA-3standforthreekindsofHLAaminoacidresidueswhichbindingtoKIRs. “-”indicatesthattheaminoacidresiduesareidenticaltothatinhumanHLAclassI.

3　討論

SLAI類分子是引起細(xì)胞性排斥反應(yīng)的核心因素和器官移植配型的重要位點(diǎn)[17]，因此，明確豬SLA基因分子結(jié)構(gòu)特征及與HLA同源性對(duì)異種器官移植配型具有重要的意義。SLA基因已知的NIH小型豬是目前國(guó)際異種器官移植研究常用的實(shí)驗(yàn)小型豬模型，且已被多次應(yīng)用于豬-人血管性器官移植。本研究以NIH小型豬SLAI類基因分子序列為參考，比較GGTA1-/-五指山小型豬SLAI類基因與人HLA同源性高低。GGTA1-/-五指山小型豬SLA-1、SLA-3、SLA-2基因座上各等位基因與人HLA-A*0201同源性在70.5%～72.1%之間，與NIH小型豬相似性為83.2%～100%。五指山小型豬SLAI類分子與人HLA同源性范圍和Chen等[18]對(duì)巴馬、云南版納豬和貴州香豬SLA-1、SLA-2基因分子與人HLA同源性相近。可見(jiàn)豬-人異種移植時(shí)，供受體之間SLA編碼的膜蛋白不可能完全相同，只能選擇SLA同源性較高的供受體進(jìn)行異種移植。

已有研究表明HLA第223～228個(gè)氨基酸是與CD8+分子受體相互作用的關(guān)鍵結(jié)合域[18]。本研究SLA-1*0401wz01、SLA-1*0703、SLA-2*11wz01、SLA-2*1102和SLA-3*0401與人HLA-A*0201氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn)，由蘇氨酸(Thr)→絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)→蛋氨酸(Met)，其他位點(diǎn)高度保守，這與Gao等[19]在巴馬豬上研究報(bào)道一致。除此之外SLA-3*0403等位基因在位點(diǎn)225處由蘇氨酸(Thr)→甘氨酸(Gly),在位點(diǎn)228處由蘇氨酸(Thr)→蛋氨酸(Met)，并在位點(diǎn)227～ 228之間插入4個(gè)氨基酸，這種多個(gè)氨基酸插入關(guān)鍵結(jié)合域有可能引起強(qiáng)烈的免疫排斥反應(yīng)，即SLAI類分子本身作為外來(lái)抗原被人T細(xì)胞間接識(shí)別，這有待于對(duì)五指山豬SLA經(jīng)典I類基因功能及與人的CD8+T細(xì)胞免疫位點(diǎn)進(jìn)一步研究。

為解決因豬血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的SLAI類分子與HLAI類分子中KIR的配體序列不匹配，而引起的豬血管損傷問(wèn)題，等Sasaki[20]將多態(tài)性較小且能和3種人KIR相匹配的HLA-G基因轉(zhuǎn)入豬內(nèi)皮細(xì)胞，體外功能實(shí)驗(yàn)表明，人NK細(xì)胞對(duì)豬內(nèi)皮細(xì)胞的攻擊明顯減弱。本研究中SLA-2*11wz01和SLA-2*1102與人HLAI類基因KIR結(jié)合區(qū)僅有1(NKTA-1)或2(NKTA-2、NKTA-3)個(gè)氨基酸差異，SLA-2*11wz01和SLA-2*1102這種高度的同源性是否說(shuō)明人NK細(xì)胞能明顯降低對(duì)GGTA1-/-五指山小型豬血管內(nèi)皮細(xì)胞的攻擊，有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，從免疫細(xì)胞介導(dǎo)的異種排斥反應(yīng)角度出發(fā)，GGTA1-/-五指山小型豬SLAI類基因氨基酸序列與人HLA高度相似，與人免疫細(xì)胞受體的配體關(guān)鍵結(jié)合域相似性較高，可作為未來(lái)豬-人異種器官移植的良好供體之一。

[1]CooperDK,EkserB,TectorAJ.Immunobiologicalbarrierstoxenotransplantation[J].IntJSurg, 2015, 23: 211-216.

[2]SchmockelM,NollertG,ShahmohammadiM,etal.Transgenichumandecayacceleratingfactormakesnormalpigfunctionasaconcordantspecies[J].JHeartLungTranspl, 1997, 169(7): 758-764.

[3]PhelpsCJ,KoikeC,VauqhtTD,etal.ProductionofAlpha1,3galactosyltransferase-deficientpigs[J].Science2003, 299(5605): 411- 414.

[4]鄭道山, 馮沖, 朱彥賓, 等.利用啟動(dòng)子缺陷型打靶載體敲除五指山小型豬GGTA1基因 [J].生物技術(shù)通訊, 2011, 22: 458-462.

[5]DonnellyCE,YatkoC,JohnsonEW,etal.HumannaturalkillercellsaccountforMHCclassIrestrictedcytolysisofporcinecells[J].CellImmunol, 1997, 175:171-178.

[6]YamadaK,SachsDH,DerSimonianH.Humananti-porcinexenogeneicTcellresponse.Evidenceforallelicspecificityofmixedleukocytereactionandforbothdirectandindirectpathwayofrecognition[J].JImmunol, 1995,155: 5249-5256.

[7]BraveryCA,BattenP,YacoubMH,etal.DirectrecognitionofSLA-andHLA-likeclassIIantigensonporcineendotheliumbyhumanTcellsresultsinTcellactivationandreleaseofinterleukin-2 [J].Transplatation,1995, 60: 1024-1032.

[8]XieJ,ChenFX,LiNL,etal.NovelSLAclassIallelesofChinesepigstrainsandtheirsignificanceinxenotransplantation[J].JImmunol,2000,20: 136-139.

[9]VaimanM,RenardC,LafageP,etal.Evidenceforahistocompatibilitysysteminswine(SLA-A) [J].Transplatation,1970,10: 155-164.

[10]LeBas-BernardetS,BlanchoG.Currentcellularimmunologicalhurdlesinpig-to-primatexenotransplantation[J].TransplImmunol, 2009, 21(2): 60-66.

[11]KitchensWH,UeharaS,ChaseCM,etal.Thechangingroleofnaturalkillercellsinsolidorganrejectionandtolerance[J].Transplantation, 2006,81(6): 811-817.

[12]孫俊麗,牟玉蓮,劉小林,等. 五指山小型豬近郊系白細(xì)胞抗原I類3基因的研究 [J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007,40(9): 2053-2061.

[13]顧茂松,趙書紅.五指山小型豬SLA-DQA基因的SNPs及豬人MHCI類區(qū)自然殺傷細(xì)胞KIRs結(jié)合區(qū)氨基酸變異的比較分析 [D].碩士學(xué)位論，華中農(nóng)業(yè)大學(xué),pp. 24-31.

[14]吳群,熊平,陳實(shí),等.近交系海南五指山豬SLA經(jīng)典I類和II類分子序列分析 [J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)免疫, 2004,24: 23-26.

[15]竇科峰,李霄,陶開(kāi)山,等.異種肝移植現(xiàn)狀與未來(lái) [J].中國(guó)實(shí)用外科雜志, 2014, 34: 14-18.

[16]JiHC,LiX,YueSQ,etal.PigBMSCstransfectedwithhumanTFPIcombatspeciesincompatibilityandregulatethehumanTFpathwayinvitroandinarodentmodel[J].CellPhysiolBiochem,2015,36: 233-249.

[17]ChadonP,RenardC,VaimanM.Themajorhistocompatibilitycomplexinswine[J].ImmunolRev, 1999, 167: 179-192.

[18]ChenFX,TangJ,LiNL,etal.NovelSLAclassIallelesofChinesepigstrainsandtheirsignificanceinxenotransplantation[J].CellRes,2003,13: 285-294.

[19]GaoCX,JiangQ,GuoD,etal.Characterizationofswineleukocyteantigen(SLA)polymorphismbysequence-basedandPCR-SSPmethodsinChineseBamaminiaturepigs[J].DevCompImmunol, 2014,45: 87-96.

[20]SasakiH,XuXC,SmithDM,etal.HLA-Gexpressionprotectsporcineendothelialcellsagainstnaturalkillercellmediatedxenogeneiccytotoxicity[J].Transplantation,1999, 67:31-37.

Characterization of swine leukocyte antigen class I genes and homologyanalysisofthesimilaritytoHLAinGGTA1-/-Wuzhishanminipigs

JIANGYing-di1，2,ZENGGuo-min2,3,SHINing-ning2,LIXi-rui2,JIHui-li2,PANDeng-ke2*,GUNShuang-bao1*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China;2.KeyLaboratoryofFarmAnimalGeneticResourceandGermplasmInnovationofMinistryofAgriculture,InstituteofAnimalScience,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193;3.CollegeoflifeScienceandTechnology,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070)

ObjectiveThisstudywasaimedtocharacterizetheswineleukocyteantigen(SLA)classIgenesofGGTA1-/-Wuzhishanminipigsandcomparetheirsimilaritytohumanleukocyteantigen(HLA).Ithasimportantimplicationsforunderstandingthecellularrejectioninxenotransplantation.MethodsSpecimensofeartissuefromsixfoundingGGTA1-/-Wuzhishanminipigswerecollected,andtheSLAclassIgenes(SLA-1,SLA-3,SLA-2)wereamplifiedbyRT-PCR.PurifiedproductswereclonedintopEASY-T1vectorsandsequenced,followedbyBLASTalignmentandusingbioinformatcanalysistocharacterizetheSLAclassIgenesandcomparewiththesimilaritytoHLA.ResultsAtotalofsixallelesweredetected,amongthemalleleswerepreviouslyreported(SLA-1*0703,SLA-2*1102,SLA-3*0401,SLA-3*0403),andtheotherwerenovel(SLA-1*0401wz01,SLA-2*11wz01).ThehomologybetweenallelesofSLAclassIgenesinWuzhishanminipigsandHLAwasfrom70.5%to72.1%.ThehomologyanalysisofcriticalaminoacidresiduesonHLAbindingwithhumanCD8+moleculesshowedthatSLA-1*0401wz01,SLA-1*0703,SLA-2*11wz01,SLA-2*1102andSLA-3*0401occurredmutantataminoacidpositions225and228 (T→S,T→M),whereastheotherlociwerehighlyconserved.TherewasahighhomologyataminoacidlevelbetweenSLA-2*11wz01,SLA-2*1102andHLAclassIgeneswhichareNKcellKIRsbindingsites.ConclusionsTheaminoacidsequencesofSLAclassIgenesofGGTA1-/-WuzhishanminipigshaveahighhomologytoHLA.Fromthepointofviewofcell-mediatedxenograftrejection,theaminoacidsequencesofSLAclassIgenesofGGTA1-/-WuzhishanminipigshaveahighhomologytoHLA,therefore,Wzhishanminipigsmaybecomeagoodpotentialdonorforpig-humanxenotransplantation.

GGTA1-/-;Wuzhishanminipigs;Swineleukocyteantigen,SLA;Xenotransplantation;Immunerejection

GUNShuang-bao,E-mail:gunsb@gsau.edu.cn;PANDeng-ke,Email:pandengke2002@163.com

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(編號(hào):2015CB554103)。

蔣應(yīng)弟(1986-)，女，碩士研究生，研究方向：動(dòng)物遺傳育種與繁殖。E-mail: 529149896@qq.com

滾雙寶(1967-)，男，博士，教授，主要從事動(dòng)物遺傳育種。E-mail:gunsb@gsau.edu.cn

潘登科(1972-)，男，博士，副研究員，主要從事轉(zhuǎn)基因豬模型。E-mail:pandengke2002@163.com

研究報(bào)告

Q95-33

A

1005-4847(2016)04-0375-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2016.04.008

2016-01-18