他克莫司局部緩釋用藥對(duì)大鼠脛神經(jīng)損傷的療效

馮思航，馮登殿，趙煒疆

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·論著·

他克莫司局部緩釋用藥對(duì)大鼠脛神經(jīng)損傷的療效

馮思航1，馮登殿2，趙煒疆1

目的：觀察大鼠脛神經(jīng)損傷后局部短暫應(yīng)用他克莫司（FK506）納米微球緩釋顆粒對(duì)神經(jīng)再生的影響。方法：Wistar大鼠36只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（n=24）和對(duì)照組（n=12），實(shí)驗(yàn)組根據(jù)釋放用藥時(shí)間不同分為10 d亞組和15 d亞組各12只，建立左側(cè)脛神經(jīng)切斷的端端縫合模型。于術(shù)后2周、3周分別取縫合口遠(yuǎn)側(cè)端神經(jīng)干進(jìn)行變性軸索、變性髓鞘染色，觀察其變性軸索、變性髓鞘、再生髓鞘纖維數(shù)。結(jié)果：術(shù)后2、3周，實(shí)驗(yàn)組縫合口遠(yuǎn)側(cè)端神經(jīng)干內(nèi)變性軸索數(shù)少于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；變性髓鞘數(shù)少于對(duì)照組，有顯著性差異（P<0.01）。術(shù)后3周，10 d亞組髓鞘數(shù)多于 15 d亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：局部短暫少量應(yīng)用FK506納米微球緩釋顆粒，能縮短損傷遠(yuǎn)側(cè)端神經(jīng)潰變時(shí)間，利于藥物充分吸收，減少用藥部位結(jié)締組織對(duì)局部藥物緩釋時(shí)的影響。

他克莫司；納米微球；變性神經(jīng)纖維；神經(jīng)再生；大鼠

周圍神經(jīng)損傷后其遠(yuǎn)端的軸索、髓鞘會(huì)發(fā)生Wallerian變性[1,2]，如何較客觀地反映神經(jīng)損傷和評(píng)價(jià)損傷后神經(jīng)再生，尋找促進(jìn)神經(jīng)再生的藥物，優(yōu)化損傷神經(jīng)修復(fù)時(shí)間是相關(guān)藥物研發(fā)的重點(diǎn)。目前已發(fā)現(xiàn)許多能促進(jìn)神經(jīng)再生、增加肌重量和促進(jìn)肌張力恢復(fù)的物質(zhì)，如神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF）、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain derived neurophic factor，BDNF）、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF）、單胺抑制劑等[3-5]。他克莫司（Tacrolimus，F(xiàn)K506）作為一種新型大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，具有高效免疫抑制作用[6]，被用于異體神經(jīng)移植后促神經(jīng)再生，其療效已得到肯定。但自體神經(jīng)損傷后局部應(yīng)用FK506促進(jìn)神經(jīng)再生的恢復(fù)效果仍存在爭(zhēng)議[7,8]，有待進(jìn)一步研究。本研究在大鼠脛神經(jīng)切斷的端端縫合模型中應(yīng)用FK506納米微球，采用已證明可加速大鼠神經(jīng)再生的釋放率的給藥劑量[1mg/(kg·d)][9]，并選擇不同的釋放時(shí)間，用變性神經(jīng)髓鞘和變性軸索特異性染色，結(jié)合髓鞘和HE染色，對(duì)照觀察神經(jīng)端端縫合術(shù)后Wallerian變性改變，分析該藥物對(duì)神經(jīng)再生的作用，為神經(jīng)再生創(chuàng)造良好微環(huán)境提供合理的依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性Wistar大鼠36只，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（n=24）和對(duì)照組（n=12），實(shí)驗(yàn)組根據(jù)不同釋放用藥時(shí)間分為10 d亞組和15 d亞組各12只。1.1.2主要試劑與儀器FK506納米微球（由中山大學(xué)高分子材料實(shí)驗(yàn)室提供）；髓鞘染色劑（Luxol快藍(lán)MBS）、硝酸銀（購(gòu)于上?；瘜W(xué)試劑公司）；HMIAS-2000型圖像分析儀（購(gòu)于武漢千屏影像公司）；SXP-LB手術(shù)顯微鏡（購(gòu)于上海醫(yī)用光學(xué)儀器廠）；CM1900恒冷箱切片機(jī)（購(gòu)于德國(guó)Leica公司）。

1.2方法

1.2.1模型制備及給藥 腹腔注射0.4%戊巴比妥鈉1 mL/kg麻醉大鼠，取左肢后外側(cè)中部縱形切口，在手術(shù)顯微鏡下暴露出坐骨神經(jīng)，在梨狀肌下緣10 mm處，在放大10倍的手術(shù)顯微鏡下分離出脛神經(jīng)，并切斷脛神經(jīng)，再用11-0無創(chuàng)尼龍針線行神經(jīng)外膜縫合術(shù)，縫合4針。實(shí)驗(yàn)組在縫合口周圍放置FK506納米微球，10 d亞組和15 d亞組的用藥量按釋放率 1mg/ (kg·d)釋放10 d和15 d，對(duì)照組不給藥，依次縫合。

1.2.2標(biāo)本取材與檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)組10 d亞組、15 d亞組和對(duì)照組各于術(shù)后2、3周時(shí)處死6只大鼠。0.4%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，生理鹽水經(jīng)心臟主動(dòng)脈灌注沖洗后，4%多聚甲醛0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）灌注后固定2 h。在縫合口遠(yuǎn)側(cè)取5 mm長(zhǎng)的神經(jīng)段置于20%蔗糖內(nèi)4℃冰箱內(nèi)過夜，然后置于恒冷箱切片機(jī)行橫斷切片，片厚15 μm，貼于鉻釩明膠玻片上，行Nauta和Gygax氏變性神經(jīng)纖維銀浸法染色、Marcji變性髓鞘鋨酸染色（冰凍切片）。相鄰切片按Kluver和Barrera氏Luxol快藍(lán)MBS髓鞘染色法染色和HE染色。

1.2.3神經(jīng)纖維圖像分析 使用光學(xué)顯微鏡和HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)，分別計(jì)算變性神經(jīng)髓鞘、變性軸突、再生髓鞘數(shù)目。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量結(jié)果以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1軸索變性纖維染色

變性神經(jīng)纖維軸索呈黑色，底淺黃色，正常纖維無色，相差顯微鏡下神經(jīng)纖維輪廓可辯認(rèn)。2組均有散在的變性神經(jīng)纖維，術(shù)后2周時(shí)，2組均有較多的點(diǎn)狀、條索狀變性纖維，排列不整齊（圖1A、B）；術(shù)后3周時(shí)2組變性軸索明顯減少，呈點(diǎn)狀散在分布，近神經(jīng)干邊緣明顯（圖1C、D）。術(shù)后2、3周，實(shí)驗(yàn)組10 d亞組和15 d亞組中，變性神經(jīng)纖維軸索數(shù)均少于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；10 d亞組與15 d亞組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表1）。

圖1　2組術(shù)后2、3周軸索變性觀察（Nauta和Gygax氏變性神經(jīng)纖維銀浸染色，×200）

表1　2組脛神經(jīng)遠(yuǎn)側(cè)端變性軸索計(jì)數(shù)（根，）

表1　2組脛神經(jīng)遠(yuǎn)側(cè)端變性軸索計(jì)數(shù)（根，）

注：與對(duì)照組比較，①P<0.05

組別 只數(shù) 術(shù)后2周 術(shù)后3周對(duì)照組　6　1 098.00±31.91　495.16±57.32實(shí)驗(yàn)組10 d亞組　6　1 038.67±45.83①　409.50±49.65①15 d亞組　6　1 026.67±61.21①　418.83±63.27①

2.2髓鞘變性纖維染色

術(shù)后2周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組10 d亞組和15 d亞組及對(duì)照組有散在的變性髓鞘（圖2A、B）；15 d亞組靠近縫合口處神經(jīng)內(nèi)髓鞘崩解嚴(yán)重，出現(xiàn)許多髓鞘碎片，底呈淡黃色，正常髓鞘無色（圖2C）；術(shù)后3周時(shí)，15 d亞組的變性髓鞘仍然存在，但明顯減少，且見遠(yuǎn)側(cè)端神經(jīng)內(nèi)有大量外形完整的變性髓鞘（圖2D）。術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組10 d亞組和15 d亞組變性髓鞘數(shù)均少于對(duì)照組，有顯著性差異（P<0.01）；10 d亞組與15 d亞組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表2）。

2.3快藍(lán)染色

相鄰片不著色區(qū)為均勻有序的有髓神經(jīng)纖維，其內(nèi)夾雜有排列欠整齊的有髓神經(jīng)纖維，并且出現(xiàn)著色程度不同，深染和淡染髓鞘同時(shí)存在（圖3A、B）。術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組10 d亞組和15 d亞組髓鞘數(shù)均多于對(duì)照組，有顯著性差異（P<0.01）；術(shù)后2周，10 d亞組與15 d亞組相比，髓鞘數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；術(shù)后3周，10 d亞組髓鞘數(shù)多于15 d亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表3）。

圖2　實(shí)驗(yàn)組髓鞘變性纖維染色（Marcji變性髓鞘鋨酸染色）

表2　2組脛神經(jīng)遠(yuǎn)側(cè)端變性髓鞘計(jì)數(shù)（根，）

表2　2組脛神經(jīng)遠(yuǎn)側(cè)端變性髓鞘計(jì)數(shù)（根，）

注：與對(duì)照組比較，①P<0.01

組別 只數(shù) 術(shù)后2周 術(shù)后3周對(duì)照組　6　558.83±50.04　391.16±32.21實(shí)驗(yàn)組10 d亞組　6　440.67±29.61①　290.33±34.06①15 d亞組　6　470.67±49.45①　307.33±42.36①

圖3　術(shù)后10 d亞組髓鞘觀察（Kluver和Barrera氏Luxol快藍(lán)MBS髓鞘染色，×400）

表3　2組脛神經(jīng)遠(yuǎn)側(cè)端髓鞘計(jì)數(shù)（根，）

表3　2組脛神經(jīng)遠(yuǎn)側(cè)端髓鞘計(jì)數(shù)（根，）

注：與對(duì)照組比較，①P<0.01；與15 d亞組比較，②P<0.05

組別 樣本數(shù) 術(shù)后2周 術(shù)后3周對(duì)照組　6　1 901.17±33.85　2 021.83±46.76實(shí)驗(yàn)組10 d亞組　6　2 000.83±54.04①　2 209.17±35.50①②15 d亞組　6　2 024.66±58.86①　2 144.50±60.80①

2.4HE染色

實(shí)驗(yàn)組10 d亞組神經(jīng)周圍未見明顯未溶解吸收藥物的結(jié)節(jié)狀病灶，結(jié)締組織形成少（圖4A）；15 d亞組有明顯未溶解吸收藥物的結(jié)節(jié)狀病灶，結(jié)締組織形成較多（圖4B）。

圖4　術(shù)后3周實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)觀察（HE染色，×100）

3　討論

3.1神經(jīng)潰變與促神經(jīng)再生藥效的細(xì)胞化學(xué)觀察

英國(guó)生理學(xué)家Waller早在1850年就發(fā)現(xiàn)周圍神經(jīng)切斷后，其神經(jīng)遠(yuǎn)端就會(huì)由近及遠(yuǎn)直至神經(jīng)末端會(huì)出現(xiàn)順行性潰變。遠(yuǎn)段神經(jīng)發(fā)生潰變以后，近端神經(jīng)又能由近及遠(yuǎn)的向潰變遠(yuǎn)端神經(jīng)內(nèi)生長(zhǎng)，以1 mm/d的速度爬行到達(dá)終末器官，稱Wallerian潰變或Wallerian變性[1,2]。已知外周神經(jīng)元分化成熟后不具備分裂增殖能力，只有在神經(jīng)損傷時(shí)才出現(xiàn)分裂增殖，由靜態(tài)相進(jìn)入增殖相，且已證實(shí)周圍神經(jīng)損傷后具備再生能力。神經(jīng)潰變纖維檢測(cè)被視為反映神經(jīng)再生的病理形態(tài)學(xué)重要指標(biāo)，故本研究采用變性神經(jīng)纖維染色的方法，結(jié)合快藍(lán)染色法作為陽(yáng)性對(duì)照，能較直觀地識(shí)別潰變神經(jīng)和正常神經(jīng)組織，檢測(cè)神經(jīng)再生的質(zhì)量。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組在縫合口遠(yuǎn)側(cè)段端的神經(jīng)干內(nèi)，均有數(shù)量不等的潰變神經(jīng)纖維，對(duì)照組中神經(jīng)干內(nèi)潰變軸索呈點(diǎn)狀、條索狀分布，尤其在神經(jīng)干邊緣和靠近縫合口附近纖維排列不整齊，可能與神經(jīng)縫合時(shí)與神經(jīng)扭曲成角有關(guān)。術(shù)后2、3周實(shí)驗(yàn)組的縫合口遠(yuǎn)側(cè)端神經(jīng)干內(nèi)潰變軸索數(shù)和潰變髓鞘纖維數(shù)少于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。術(shù)后3周10 d亞組和15 d亞組內(nèi)都出現(xiàn)許多新生髓鞘，提示局部早期短時(shí)間應(yīng)用FK506納米微球?qū)ι窠?jīng)軸索生長(zhǎng)有一定促進(jìn)作用。在實(shí)驗(yàn)中除見到神經(jīng)縫合口遠(yuǎn)側(cè)端有較多的散在或不均勻分布的潰變纖維外，其內(nèi)仍存在大量不著色的神經(jīng)纖維，相鄰片髓鞘染色證實(shí)該不著色區(qū)域?yàn)樯钊镜挠兴枭窠?jīng)纖維成分，是正常的髓鞘纖維，提示它們是神經(jīng)損傷斷端朗飛結(jié)處出現(xiàn)的許多神經(jīng)枝芽快速生長(zhǎng)，跨過縫合口長(zhǎng)到或要抵達(dá)靶肌肉內(nèi)的再生的神經(jīng)髓鞘和軸索[10,11]。

3.2局部緩釋用藥與神經(jīng)再生微環(huán)境之間組織理化分析

變性神經(jīng)染色結(jié)果提示，10 d亞組的FK506納米材料能加速神經(jīng)損傷后變性、崩解神經(jīng)纖維被巨噬細(xì)胞等吞噬過程，促進(jìn)近端軸索向遠(yuǎn)端段再生，局部用藥區(qū)域進(jìn)行HE染色可觀察到縫合口神經(jīng)周圍局部炎性反應(yīng)較輕，纖維組織較少，利于組織對(duì)藥物在有限的時(shí)間內(nèi)降解，既能保證局部藥物的濃度，又可實(shí)現(xiàn)類似緩釋作用，然而，15 d亞組出現(xiàn)局部尚未溶解吸收緩釋藥物引起的新生毛細(xì)血管和纖維母細(xì)胞組成的肉芽組織，長(zhǎng)入藥物內(nèi)并進(jìn)行“異物性”包裹的病理現(xiàn)象。較早研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，短暫應(yīng)用FK506，能促進(jìn)神經(jīng)在解剖及生理功能的恢復(fù)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)FK506劑量1 mg/(kg·d)可加速大鼠神經(jīng)再生[8]，且早期給藥效果明顯[12]，這與本研究結(jié)果基本一致。這提示在能充分滿足神經(jīng)生長(zhǎng)所需要的時(shí)間前提下，要考慮短時(shí)間內(nèi)藥物能否充分吸收，以及機(jī)體自身免疫防御、免疫監(jiān)視的反應(yīng)，防止局部較多結(jié)締組織形成，使降解停止，起不到緩釋給藥作用，達(dá)不到緩釋目的。其體內(nèi)降解值變成局部緩釋虛擬值，會(huì)直接或間接地改變局部促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)理化微環(huán)境，影響和干擾神經(jīng)再生。藥物在體內(nèi)的緩釋量和緩釋時(shí)間受到體內(nèi)防御體系的影響，降解產(chǎn)物除具有良好的生物安全性、組織相容性以外，局部用藥時(shí)要高度重視體外降解質(zhì)量和影響體內(nèi)降解率的這些匯合因素，否則在同一釋放率不同時(shí)間段出現(xiàn)隨神經(jīng)變性時(shí)間延長(zhǎng)而使神經(jīng)再生效果變差。同時(shí)，本研究還表明，采用變性神經(jīng)染色方法反映神經(jīng)再生病理形態(tài)指標(biāo)，也是評(píng)價(jià)神經(jīng)再生的一個(gè)重要參考。

總之，周圍神經(jīng)再生與修復(fù)的研究甚多，得出了很多有提示意義的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。已知FK506對(duì)自體神經(jīng)再生和修復(fù)有促進(jìn)作用，但其具體機(jī)制仍有待明確。如何預(yù)防遠(yuǎn)端神經(jīng)失神經(jīng)變性，仍然是促進(jìn)神經(jīng)再生、功能恢復(fù)的主要突破點(diǎn)[13]。

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（本文編輯：王晶）

Effects of FK506 Microspheres on the Tibial Nerve Injury in Rats

FENG Si-hang1,FENG Deng-dian2,ZHAO Wei-jiang1.1.Neuroscicence Center,Shantou University Medical College,Guangdong 515041,China;2. Central Lab,Shajin Renmin Hospital,Guangzhou Medical University,Guangdong 518104,China

Objective:To observe the effects of the brief local application of FK506 by P(DLLA-co-TMC)microspheres on nerve regeneration in rats with tibial nerve injury.Methods:An end-to-end neurorrhaphy model for the left tibial nerve repair was established in 36 Wistar rats that were randomly divided into the experimental group (n=24)and control group(n=12).The experimental group was further divided into subgroups 10 and 15 d based on the duration of drug delivery.At postoperative weeks 2 and 3,axonal staining,myelin staining,and HE staining were performed on the degenerated nerve stems in the distal stumps to observe the degeneration of the axons and sheaths,and the number of the regenerated axonal nerve fibers.Factors that affect the local drug delivery were also evaluated.Results:At weeks 2 and 3,the numbers of the degenerated axons in the distal stumps were fewer in the experimental group than those in the control groups(P<0.05),and the numbers of degenerated sheaths were also significantly fewer in the experimental group than those in the control group(P<0.01).At week 3,the 10 d subgroup showed significantly more sheaths than those in 15 d subgroup(P<0.05).Conclusion:Brief local application of FK506 by P(DLLA-co-TMC)microspheres can slow down the degeneration of nerve axons,by promoting the complete absorption of the drug,and reducing the interference of the connective tissues during drug delivery.

FK506;microspheres;degenerated nerve fiber;nerve regeneration;rat

R741;R741.05

A

10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.01.010

1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)中心

廣東汕頭515041 2.廣州醫(yī)科大學(xué)深圳沙井人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室

廣東深圳518104基金項(xiàng)目

國(guó)家自然科學(xué)基金（No.81171138,814 71279）

2015-08-19

趙煒疆

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