短時高壓二氧化碳對雙孢蘑菇褐變和活性氧代謝的影響

李　靜,李順峰,田廣瑞,王安建,劉麗娜,魏書信

(河南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心,河南鄭州 450002)

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短時高壓二氧化碳對雙孢蘑菇褐變和活性氧代謝的影響

李靜,李順峰,田廣瑞,王安建,劉麗娜,魏書信

(河南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心,河南鄭州 450002)

雙孢蘑菇,短時高壓二氧化碳處理,褐變,活性氧

高壓二氧化碳在低溫條件下能有效殺菌和鈍化酶的活性[9-10],從而抑制果蔬及其產(chǎn)品的品質(zhì)劣變,目前已有高壓二氧化碳處理應用到果汁、鮮切果蔬褐變控制和保鮮的相關報道[9-14]。前期研究發(fā)現(xiàn)短時高壓二氧化碳處理能較好的保持雙孢蘑菇貯藏品質(zhì),但是該處理對雙孢蘑菇脂質(zhì)過氧化和活性氧代謝的影響還不清楚。本研究旨在確定短時高壓二氧化碳對雙孢蘑菇褐變、細胞膜透性、丙二醛(MDA)、抗氧化物質(zhì)、活性氧積累、活性氧清除系統(tǒng)酶活性的影響,進一步探討該處理對雙孢蘑菇的作用機理,為短時高壓二氧化碳在雙孢蘑菇保鮮中的應用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

雙孢蘑菇購自洛陽奧達特食用菌技術開發(fā)有限公司,采收后分層放入貯運保鮮箱預冷后立即運回實驗室進行處理,選取大小、成熟度一致、顏色潔白、無開傘、無病蟲害和機械損傷的蘑菇進行實驗;硫代巴比妥酸、三氯乙酸、氫氧化鈉、沒食子酸、2,6-二氯靛酚、抗壞血酸、偏磷酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、乙二胺四乙酸(EDTA)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、聚乙烯比咯烷酮(PVP)、鹽酸羥胺、對氨基苯磺酸、α-萘胺、過氧化氫(H2O2)、福林酚、牛血清蛋白分析純;H2O2、SOD測試盒南京建成生物工程研究所。

FA2004C分析天平上海越平科學儀器有限公司;SHZ-B水浴恒溫振蕩器上海博遠實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;H2050R高速冷凍離心機湘儀離心機儀器有限公司;UV1800紫外分光光度計日本島津公司;FE30電導率儀梅特勒-托利多(上海)有限公司;Color Flex EZ色差儀美國Hunterlab公司;TMS-Pro質(zhì)構(gòu)儀美國Food Technology Corporation(FTC)公司;本實驗室定制的高壓二氧化碳裝置。

1.2實驗方法

實驗室環(huán)境檢測領域包括行業(yè)獨立的環(huán)境檢測公司（或監(jiān)測站）和相近行業(yè)的監(jiān)測站，全國與本項目有關的檢測公司（或監(jiān)測站）有7 430余家[1]．檢測行業(yè)的需求源于“認知”，是社會發(fā)展催生的新興服務業(yè)．2014年，國家提出在環(huán)境保護領域開展第三方監(jiān)測后，全國各地檢測、監(jiān)測公司迅速發(fā)展，之后的2年內(nèi)全國成立了約1 500家第三方檢測公司．

1.2.2褐變度測定Hunterlab ColorFlex EZ色差儀用標準白板(L*=94.11;a*=-1.08;b*=2.13)校正,測定雙孢蘑菇蓋的CIE-Lab表色系中L*值(從0～100變化,0是黑色,100是白色)，表示樣品褐變度,L*值越大,表示樣品顏色越白。每個處理測定12個整菇,結(jié)果取平均值。

1.2.3細胞膜透性測定采用相對電導率評價雙孢蘑菇的細胞膜透性,相對電導率的測定參照Liu等[15]的方法。用打孔器將雙孢蘑菇切成直徑為15 mm、厚度為2 mm的圓片,稱取1.0 g切好的圓片放入一定體積去離子水中浸泡1 h(25±1 ℃),用電導率儀測定活組織提取液的電導率,然后將含有樣品組織的浸泡液煮沸30 min并用去離子水補足體積后,測定總電導率?；罱M織電導率占總電導率的百分比即相對電導率。

1.2.4脂質(zhì)過氧化測定采用MDA含量評價雙孢蘑菇脂質(zhì)過氧化程度,MDA含量的測定參照Liu和Wang[8]的方法并略作修改。準確稱取1.0 g雙孢蘑菇樣品加7.0 mL三氯乙酸,冰浴條件下研磨勻漿,12000×g離心20 min(4 ℃),取1.0 mL上清液與5.0 mL 0.67%硫代巴比妥酸(用0.05 mol·L-1NaOH溶解)混合后在100 ℃加熱20 min,快速冷卻后在12000×g離心10 min,分別測定上清液在450、532、600 nm處的吸光值。MDA的計算公式如下:

MDA含量(μmol·g-1)=[6.45(OD532-OD600)-0.56OD450]×提取液總體積/樣品質(zhì)量×1000

1.2.5總酚含量測定參照Gon?alves等[16]的方法,修改如下:取雙孢蘑菇凍干粉1.0 g,加入60%甲醇7 mL,在40 ℃下振蕩(100 r/min)提取2 h,15000×g離心10 min。取0.1 mL上清液加入稀釋至1/10的福林酚試劑4.9 mL,反應8 min后,加入質(zhì)量分數(shù)為20%的Na2CO31.5 mL,在760 nm處測量吸光值,每組樣品做3次平行求平均值,以吸光度為縱坐標、以質(zhì)量分數(shù)為橫坐標,根據(jù)標準曲線(y1=0.0171x1-0.0057,R2=0.9977,y1為吸光值、x1為沒食子酸質(zhì)量分數(shù),單位為mg·mL-1)計算樣品中總酚的質(zhì)量分數(shù),樣品中總酚的質(zhì)量分數(shù)用沒食子酸當量(mg·g-1)表示。

1.2.6抗壞血酸含量測定參照Vaz等[17]的方法,修改如下:取雙孢蘑菇凍干粉1.0 g,加入質(zhì)量分數(shù)為1%的偏磷酸7 mL,室溫下提取45 min,然后在10000×g下離心5 min。取1 mL的上清液和9 mL濃度為0.5 mg/mL的2,6-二氯靛酚反應30 min再在515 nm處測量吸光值,每組樣品做3次平行求平均值，根據(jù)標準曲線(y2=-4.556x2+0.7488,R2=0.9999,其中y2為吸光值、x2為抗壞血酸質(zhì)量分數(shù),單位為mg·mL-1)計算樣品中抗壞血酸質(zhì)量分數(shù),結(jié)果以mg·g-1表示。

超氧陰離子產(chǎn)生速率(nmol·min-1·g-1)=(OD530+0.004)×提取液總體積×1000/0.005×吸取樣品液體積×反應時間×樣品質(zhì)量

1.2.8H2O2含量測定采用H2O2測試盒測定。

1.2.9抗氧化酶活性測定準確稱取1.0 g雙孢蘑菇樣品加5.0 mL 0.1 mol·L-1pH7.4的磷酸緩沖液(含0.8 g·L-1PVP和1 mmol·L-1EDTA),冰浴條件下研磨勻漿,12000×g離心20 min(4 ℃),上清液即為粗酶液。

SOD活性測定:采用SOD測試盒測定。

CAT活性測定:參照Liu等[15]的方法并略作修改。取2.4 mL 50 mmol·L-1pH7.0磷酸鈉緩沖液加0.1 mL酶提液于25 ℃水浴預熱2～3 min,再加入0.5 mL 40 mmol·L-1H2O2,搖勻,立即計時,H2O2的降解表示為240 nm處吸光度的下降。每30 s記錄1次,記錄5 min。以1 min內(nèi)OD240降低0.01為一個酶活力單位(U),CAT活性表示為U·mg-1蛋白。

蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍染色法。

1.2.10數(shù)據(jù)處理采用SPSS 17.0和SigmaPlot12.5軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理,所有實驗均重復3次。

2　結(jié)果與討論

2.1短時高壓二氧化碳處理對雙孢蘑菇褐變度的影響

顏色是消費者判斷雙孢蘑菇是否可接受的重要參數(shù),采后貯藏期間菌蓋的褐變現(xiàn)象十分普遍,是導致商品價值下降的重要原因。從圖1可以看出,雙孢蘑菇的L*值隨著貯藏時間的延長逐漸下降,對照的L*值下降速度較快,貯藏8 d后L*值從87.34降到77.61;0.3 MPa二氧化碳短時處理的雙孢蘑菇在貯藏前期L*值下降明顯,2 d后波動不大,且0～4 d的L*值均低于對照,僅8 d后的L*值高于對照,其中0.3 MPa二氧化碳短時處理的雙孢蘑菇貯藏8 d后的L*值比對照組高3.96%,存在顯著差異(p<0.05)。從短期護色效果來看,短時高壓二氧化碳處理對雙孢蘑菇的護色效果并不理想,這可能與短時高壓二氧化碳處理破壞了雙孢蘑菇的細胞結(jié)構(gòu)有關。研究表明微生物的侵染能夠活化雙孢蘑菇多酚氧化酶,進而加速酶促褐變的發(fā)生[19],而高壓二氧化碳處理能夠抑制微生物生長[10],這可能是處理組雙孢蘑菇在貯藏后期的顏色好于對照的原因之一。

圖1　短時高壓二氧化碳處理對雙孢蘑菇色澤的影響Fig.1　Effect of short-time HPCD treatment on color of button mushroom during storage

2.2短時高壓二氧化碳處理對雙孢蘑菇細胞膜透性和脂質(zhì)過氧化的影響

相對電導率和MDA含量是衡量細胞膜透性和穩(wěn)定性的兩個主要指標。通常認為相對電導率可以間接反映細胞膜的損傷程度,而MDA作為脂質(zhì)過氧化主要產(chǎn)物,其含量的多少可間接反映細胞脂質(zhì)過氧化的程度。短時高壓二氧化碳處理對雙孢蘑菇相對電導率和MDA含量的影響分別如圖2和圖3所示。從圖2中可以看出,隨著貯藏時間的延長,對照組雙孢蘑菇的相對電導率從22.86%逐漸增大到28.33%;0.3 MPa二氧化碳短時處理組的雙孢蘑菇相對電導率在貯藏期間則變化平穩(wěn),且貯藏0～6 d均高于對照,這可能與高壓對細胞的破壞作用有關,而8 d后的相對電導率為26.43,比對照低6.71%。如圖3所示,在8 d貯藏期內(nèi),對照組雙孢蘑菇的MDA從最初的0.43 nmol·g-1增長到2.45 nmol·g-1,而0.3 MPa二氧化碳短時處理組的MDA含量則從1.01 nmol·g-1增長到2.01 nmol·g-1。貯藏前期處理組相對電導率和MDA含量均高于對照組,說明高壓處理對細胞結(jié)構(gòu)造成了傷害,加速了膜脂過氧化進程,而在貯藏后期處理組的相對電導率和MDA含量低于對照組,這可能與高壓二氧化碳處理抑制了雙孢蘑菇表面微生物數(shù)量的增長有關[10,20]。

圖2　短時高壓二氧化碳處理對雙孢蘑菇相對電導率的影響Fig.2　Effect of short-time HPCD treatment on relative leakage rate of button mushroom during storage

圖3　短時高壓二氧化碳處理對雙孢蘑菇MDA含量的影響Fig.3　Effect of short-time HPCD treatment on MDA content of button mushroom during storage

2.3短時高壓二氧化碳處理對雙孢蘑菇總酚和抗壞血酸含量的影響

多酚是雙孢蘑菇體內(nèi)主要的抗氧化物質(zhì),該類物質(zhì)具有維護健康、預防癌癥和心血管疾病的有益作用。抗壞血酸是雙孢蘑菇體內(nèi)重要的營養(yǎng)成分之一,然而該物質(zhì)不穩(wěn)定,易被氧化,是雙孢蘑菇褐變的原因之一。本研究表明雙孢蘑菇體內(nèi)的總酚和抗壞血酸含量在整個貯藏期呈下降趨勢(圖4和圖5)。由圖4可知,貯藏初期(2 d)0.3 MPa二氧化碳短時處理組的總酚含量低于對照的含量,隨著貯藏時間的延長,0.3 MPa高壓二氧化碳短時處理組的總酚含量逐漸高于對照的含量,尤其是貯藏8 d時0.3 MPa二氧化碳短時處理組總酚含量比對照高。如前所述,在貯藏前期,0.3 MPa二氧化碳短時處理對雙孢蘑菇的褐變抑制效果并不明顯,而貯藏后期該處理對褐變的抑制效果則逐漸顯現(xiàn),這表明低褐變程度與高總酚含量有關,總酚含量是雙孢蘑菇褐變的限制因素[21-22]。由圖5可知,0.3 MPa二氧化碳處理組可顯著降低抗壞血酸含量的損失,貯藏8 d后抗壞血酸含量分別為0.28 mg·g-1FW,比對照組的高18.12%,這說明0.3 MPa二氧化碳處理可以較好的保持雙孢蘑菇體內(nèi)的抗壞血酸含量。

圖4　短時高壓二氧化碳處理對雙孢蘑菇總酚含量的影響Fig.4　Effect of short-time HPCD treatment on total phenolics content of button mushroom during storage

圖5　短時高壓二氧化碳處理 對雙孢蘑菇抗壞血酸含量的影響Fig.5　Effect of short-time HPCD treatment on ascorbic acid content of button mushroom during storage

2.4短時高壓二氧化碳處理對雙孢蘑菇活性氧的影響

圖6　短時高壓二氧化碳處理 對雙孢蘑菇·產(chǎn)生速率的影響Fig.6　Effect of short-time HPCD treatment on superoxide production rate of button mushroom during storage

圖7　短時高壓二氧化碳處理 對雙孢蘑菇H2O2含量的影響Fig.7　Effect of short-time HPCD treatment on H2O2 content of button mushroom during storage

2.5短時高壓二氧化碳處理對雙孢蘑菇抗氧化酶活性的影響

圖8　短時高壓二氧化碳處理 對雙孢蘑菇CAT活性變化的影響Fig.8　Effect of short-time HPCD treatment on CAT activity change of button mushroom during storage

圖9　短時高壓二氧化碳處理 對雙孢蘑菇SOD活性變化的影響Fig.9　Effect of short-time HPCD treatment on SOD activity change of button mushroom during storage

3　結(jié)論

此外,雙孢蘑菇體內(nèi)的總酚和抗壞血酸含量在整個貯藏期呈下降趨勢,但是0.3 MPa二氧化碳短時處理能夠減少雙孢蘑菇體內(nèi)總酚和抗壞血酸的損失,進而抑制雙孢蘑菇的褐變。

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Effect of treatment with short-time high-pressure carbon dioxide on browning and activate oxygen metabolism ofAgaricusbisporus

LI Jing,LI Shun-feng,TIAN Guang-rui,WANG An-jian,LIU Li-na,WEI Shu-xin

(Institute of Agro-products Processing,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China)

Agaricusbisporus;high-pressure carbon dioxide;browning;reactive oxygen species

2015-12-22

李靜(1981-)，女，博士，副研究員，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品貯藏及加工，E-mail：ruochenjl@163.com。

河南省農(nóng)業(yè)科學院科研發(fā)展專項資金項目(20148409)。

TS255.3

A

1002-0306(2016)14-0308-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.053